DNA碎片指數對體外受精和卵胞漿內單精子注射術胚胎發(fā)育的影響

王青欣，陳艷男，顧小鈴，王 霞

（南通大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，江蘇 226001）

越來越多的不孕夫婦通過輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）尋求醫(yī)療幫助。育齡期夫婦不孕不育發(fā)病率近15%，其中約50%由男方因素引起[1]。傳統上對男性不育檢查主要基于精液常規(guī)分析。近年來研究表明，精子DNA碎片指數（DNA fragmentation index，DFI）可預測男性不育，較常規(guī)精液參數具有更好的預測價值[2]。有研究表明，精子DNA碎片指數與受精率或胚胎發(fā)育無關[3]，而另有研究認為高DFI可能影響受精[4-5]。精子DFI對體外受精（in vitro fertilization，IVF）實驗室結局的影響仍存在爭議。本研究選擇2017年10月—2020年6月在我中心行IVF治療的不孕夫婦240對，回顧性分析IVF及卵胞漿內單精子注射術（ICSI）后DFI與精子參數及胚胎發(fā)育間的關系，為臨床不育治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 行IVF治療的不孕夫婦240對，根據男方精子DFI水平分為正常DFI組（DFI＜15%）126對和高DFI組（DFI≥15%）114對。正常DFI組女性平均年齡29.8±4.2歲，不孕年限3.2±2.8年，體質量指數（BMI）22.7±3.2 kg/m2；卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）分別為8.3±3.9 IU/L，5.4±3.5 IU/L和51.3±18.7 ng/mL；卵巢刺激7.5±2.4天，人絨毛膜促性腺激素（HCG）日E2、LH和孕酮（P）水平分別為2 344.4±1 656.4 ng/mL，3.0±3.3 IU/L和1.1±0.4 ng/mL；子宮內膜厚度9.8±3.2 mm，獲卵數8.5±6.0個；男性平均年齡30.9±5.3歲，精子濃度（72.9±31.1）×106/mL。高DFI組女性平均年齡31.1±5.8歲，不孕年限3.1±1.9年，BMI 22.3±2.9 kg/m2；FSH、LH、E2水平分別為8.1±3.3 IU/L，4.8±2.8 IU/L和44.4±14.5 pg/mL；卵巢刺激7.9±1.5天，HCG日E2、LH和P水平分別為1 852.0±1 132.3 pg/mL，3.4±2.8 IU/L和1.0±0.7 ng/mL；子宮內膜厚度10.0±3.1 mm，獲卵數7.0±4.5個；男性平均年齡33.0±6.5歲，精子濃度（77.4±53.0）×106/mL。兩組患者一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。納入標準:（1）年齡＜38歲；（2）排除輸卵管因素或男性因素以外的其他不孕因素；（3）不孕年限＜10年；（4）女性18＜BMI＜25 kg/m2。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 IVF/ICSI程序 使用促性腺激素釋放激素（GnRH）激動劑或GnRH拮抗劑和重組促卵泡激素/尿促性腺激素進行控制性卵巢刺激，當≥2個優(yōu)勢卵泡平均直徑≥18 mm時，皮下注射250μg重組HCG（Ovidrel，Serono）。注射HCG后36 h在陰道超聲引導下穿刺取卵，置于含10%人血清白蛋白（Vitrolife）的G-IVF TM（Vitrolife，Gothenburg，Sweden）中孵育，4～6 h后行IVF或ICSI。ICSI指征:經密度梯度洗滌及上游后前向運動精子總數＜1×106個。IVF或ICSI后16～20 h評估卵母細胞是否受精，如果出現兩個原核（pronucleus，PNs）和兩個極體，則認為受精正常。受精或ICSI后48 h和72 h評估卵裂和胚胎發(fā)育，正常受精率=（2PN卵子數/用于受精卵子數）×100%。卵裂率=（D2卵裂胚胎數/2PN卵子數）×100%。取卵后72 h，根據卵裂球和形態(tài)學評分對胚胎進行分類[6]:Ⅰ級:卵裂球大小均勻，無碎片；Ⅱ級:卵裂球均勻，碎片率＜10%；Ⅲ級:細胞分裂不均勻，碎片率＜25%；Ⅳ級:細胞分裂不均勻，碎片率＞25%。Ⅰ級和Ⅱ級胚胎為優(yōu)質胚胎，優(yōu)胚率=（D3優(yōu)質胚胎數/2PN卵裂卵子數）×100%。在取卵后第3天，選擇2個優(yōu)質胚胎進行移植，剩余的優(yōu)質胚胎部分進行冷凍保存，部分和Ⅲ級、IV級胚胎繼續(xù)進行囊胚培養(yǎng)，形成囊胚后冷凍保存。囊胚形成率=（形成囊胚數/培養(yǎng)囊胚數）×100%。

1.3 精液分析和精子DNA碎片測定 在取卵當天通過手淫取精獲得精子（禁欲2～7天），置于37℃恒溫箱中液化1 h。取10μL樣品采用偉力精子質量分析儀進行精液活力及密度測定，參照2010版WHO精液分析標準。取20μL精液樣品，選用深圳華康醫(yī)藥公司的精子DNA碎片檢測試劑盒，行精子染色質擴散（sperm chromatin dispersion，SCD）實驗。其原理為包埋于瓊脂糖凝膠中的精子在酸變性和去除核蛋白等處理后，雙鏈DNA可擴散形成特征性的暈，而碎片化的精子DNA不能形成或形成很小的有碎片的暈。400倍光學顯微鏡下觀察不少于500個精子2張次，計算精子DNA碎片指數（DFI），DFI=（有碎片的小暈環(huán)+無暈環(huán)精子數）/精子總數×100%。

1.4 密度梯度離心和上游法測量精液活力密度 吸取1 mL 90%精子梯度分離液（Vitrolife）加入離心管底部，再將45%精子梯度分離液輕輕置于其上，形成明顯的界面。將2 mL精液滴在45%層上，以300 g離心20 min，棄上清，用1 mL胚胎培養(yǎng)基洗滌沉淀后繼續(xù)離心10 min，棄0.5 mL上清，然后將沉淀重懸浮于培養(yǎng)基中。記錄精子活力及密度等相關數據，備用IVF，并根據精子處理后的參數結果決定受精方式。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和率表示，組間比較采用χ2檢驗。使用線性回歸和Spearman相關系數進行相關性檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 精子DFI與精液活力相關性 高DFI組男性精液中精子活力（37.4±11.2）%，顯著低于正常DFI組的（44.9±11.2）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。Spearman相關分析表明，精子DFI與精子活力呈負相關（r=-0.44，P＜0.01）。見圖1。

圖1 精子DFI與精子活力相關性

2.2 精子DFI與IVF/ICSI實驗室檢查結果相關性 240對夫婦中138對行IVF，60對行ICSI，其余42對行half-ICSI。在IVF周期中，高DFI組受精率為（69.4±19.3）%，顯著低于正常DFI組的（93.6±10.6）%，差異有統計學意義（P＜0.01）。高DFI組優(yōu)胚率和卵裂率分別為（43.0±10.2）%和（72.0±21.3）%，低于正常DFI組，但差異無統計學意義（P＞0.05），需加大樣本量進一步研究。兩組囊胚形成率比較，差異無統計學意義，見圖2A。Spearman相關分析顯示，精子DFI與受精率呈負相關（r=-0.47，P=0.00），見圖2B。在ICSI周期中，兩組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率和囊胚形成率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 IVF周期中兩組胚胎發(fā)育相關指標水平及與受精率的相關性

圖3 ICSI周期中胚胎發(fā)育相關指標水平

3 討 論

正常妊娠的維持首先要有正常精子完成受精，任何因素導致精子染色質改變都可能對精子功能產生影響[7]，導致受精及妊娠失敗。研究發(fā)現，精子活力與精子DFI相關，精子DFI＞30%則精子活力顯著降低[8-9]。精子濃度較低的精液中，精子DFI較高[8]。也有研究表明，精子DFI與精子活力和形態(tài)顯著相關，而與其他精液參數無關[10]。本研究結果顯示，精子DFI與精子濃度無關，但與精子活力呈負相關，與CHI等[10]研究結果一致。有證據表明，附睪和輸精管射出的精液中精子DNA碎片率高于睪丸中精子[11]，說明精子DNA損傷晚于精子的發(fā)生，精子DNA碎片更可能與精子活力相關。

胚胎質量在妊娠維持中具有重要作用，較差的胚胎質量可能導致早期流產。我們檢測了IVF周期的胚胎發(fā)育，發(fā)現高DFI組受精率顯著低于正常DFI組，精子DFI與受精率呈負相關，這與大部分研究結果一致[12-13]。本研究顯示，在ICSI周期中DFI與受精率、卵裂率、優(yōu)胚率和囊胚形成率無關。有人建議對高DFI患者可行ICSI治療以改善妊娠結局。卵母細胞雖然具有修復精子損傷的能力，但如果精子損傷程度超過卵母細胞的修復能力，則會造成受精失敗或胚胎發(fā)育異常。ICSI將精子直接注射到卵母細胞中，減少精子暴露于氧化應激環(huán)境，使得精子質量優(yōu)于常規(guī)受精精子，有利于提高受精率和優(yōu)胚率。但是由于妊娠周期少，我們無法對臨床結局進一步比較，尤其是流產率。因此，還需要更多移植周期進一步探索精子DFI和胚胎發(fā)育以及妊娠結局的相關性。