MicroRNA-320b抑制PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞系MGC-803和MKN45的增殖作用*

馬 彭，章文毅，梅海軍，柯 靖

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江蘇 226001）

胃癌作為全球第四高發(fā)腫瘤，其死亡率高居第二位[1]。胃癌在中國的發(fā)生率位居腫瘤第二位，僅次于肺癌[2]。多數(shù)胃癌患者在診斷時(shí)已晚期，預(yù)后較差[3-5]。胃癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程復(fù)雜，涉及致癌基因和抑癌基因間的相互作用以及多條信號(hào)通路的交叉作用，因此尋找與胃癌診斷及發(fā)展進(jìn)程相關(guān)的分子，明確其參與胃癌增殖的分子機(jī)制，對(duì)胃癌的早期診斷和治療具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式影響靶基因的表達(dá)[6]。miRNA可調(diào)控多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過程，包括增殖、凋亡、運(yùn)動(dòng)和分化[7]。研究表明，miRNA在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，許多miRNA可作為胃癌潛在的標(biāo)記物和治療靶標(biāo)[8-10]。miR-320成員包括miR-320a，miR-320b，miR-320c，miR-320d和miR-320e，其中miR-320d和miR-320e僅存在于靈長類和人類[11]。miR-320在多種腫瘤中低表達(dá)，包括乳腺癌[12]，肝管細(xì)胞性肝癌[13]，肝細(xì)胞癌[14]，肺癌[15]和結(jié)直腸癌[16]等。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和結(jié)直腸癌中miR-320b的異常與腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲力有關(guān)[17-18]。

信號(hào)通路的激活或抑制在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用[19]，其中PI3K-AKT信號(hào)通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20-21]，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，促血管生成及誘導(dǎo)化療和放療抗性[22]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路，如miR-145通過抑制PI3K-AKT的活化而抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的增殖[16]，miR-944結(jié)合IGF-1R后抑制PI3K-AKT信號(hào)通路活化，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[23]，miR-567-PI3KAKT-c-Myc細(xì)胞環(huán)路參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥過程[24]。本研究旨在研究miR-320b在胃癌組織中的表達(dá)，探究其是否通過PI3K-AKT信號(hào)通路而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞株 DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），Trizol提取試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM（Invitrogen公司），miR-320b mimics、miR-320b inhibitor及陰性對(duì)照miRNC（廣州銳博生物科技有限公司），CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Biosharp公司），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BD Bioscience），5’-溴-2’-脫氧尿嘧啶（BrdU）標(biāo)記物（Sigma公司），小鼠抗人BrdU抗體（貨號(hào):ab8152,Abcam公司），驢抗小鼠熒光二抗（Jackson Immuno公司）。兔抗PI3K（phospho Y607）（貨號(hào):ab235266,Abcam公司），兔抗AKT（phospho T308）（貨號(hào):ab38449,Abcam公司），小鼠抗β-actin（貨號(hào):ab8227，Abcam公司）。人胃癌細(xì)胞系MGC-803，MKN45和正常胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株（上海中科院細(xì)胞庫）。

1.2 組織標(biāo)本來源 收集2019年1月—2020年12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除的66例胃癌及癌旁組織標(biāo)本，均經(jīng)組織病理學(xué)確診，其中男性38例，女性28例，年齡44～81歲，中位年齡58歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌細(xì)胞MGC-803、MKN45和正常胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)MGC-803和MKN45細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以0.25%胰酶消化后接種于6孔板。待細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%時(shí)，按照試劑說明書操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:取5μL Lipofectamine 2000TM加入500μL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別吸取10μL mi R-320b mimics，miR-320b inhibitor或miR-NC對(duì)照儲(chǔ)存液加入500μL無血清DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。室溫孵育20 min，隨后將兩者混勻，室溫孵育30 min。將miR-320b mimics、miR-320b inhibitor、miR-NC和轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入細(xì)胞，終濃度為80 nmol/L，miR-320b mimics和inhibitor終濃度為150 nmol/L。6 h后更換為新鮮含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 熒光定量PCR反應(yīng) 胃癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞株，采用Trizol法提取RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。參照cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成，以snU6為內(nèi)參，構(gòu)建20μL熒光定量PCR反應(yīng)體系:逆轉(zhuǎn)錄cDNA 2μL，SYB R Green預(yù)混液10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DEPC水6μL。反應(yīng)條件:95℃5 min，95℃10 s和58℃20 s，40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值為CT值。利用2-ΔΔCt計(jì)算mi R-320b相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 在96孔板中每孔接種約5 000個(gè)MGC-803或MKN45細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，按照上文實(shí)驗(yàn)步驟分別轉(zhuǎn)染mi R-320b mimics、mi R-320b inhibitor和mi R-NC。在轉(zhuǎn)染后0、1、2、3 d加入10μL CCK-8檢測(cè)試劑，反應(yīng)4 h后吸取上清液，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的吸光度。每次檢測(cè)取3個(gè)復(fù)孔，使用GraphPad Prism軟件繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的MGC-803和MKN45細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染mi R-320b mimics、mi R-320b inhibitor、miR-NC，48 h后收集細(xì)胞。以預(yù)冷的1×PBS緩沖液洗2遍，加入300μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，最后加入5μL PI染料和5μL Annexin V-FITC染料，充分混合均勻，室溫避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，使用艾森流式分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot法測(cè)定p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá) 取轉(zhuǎn)染48 h后的MGC-803和MKN45細(xì)胞，采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)每孔蛋白上樣總量30μg計(jì)算蛋白上樣體積。配制12%SDS-PAGE凝膠，濃縮膠電泳條件為70 V電泳1 h，分離膠為100 V電泳2 h。電泳結(jié)束后取SDS-PAGE凝膠將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件設(shè)置為100 V，65 min。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，洗膜，加一抗，4℃孵育過夜。第二天用1×TBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗室溫孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-320b在胃癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，胃癌組織中miR-320b表達(dá)顯著低于癌旁組織（P＜0.001），胃癌細(xì)胞株MGC-803和MKN45中miR-320b表達(dá)均顯著低于胃上皮細(xì)胞GES-1（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1A、1B。

圖1 miR-320b在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中表達(dá)

2.2 miR-320b表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 臨床分期T3、T4患者miR-320b表達(dá)低于T1、T2患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-320b表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而miR-320b表達(dá)與患者性別、年齡及腫瘤細(xì)胞分化程度無關(guān)。見表1。

表1 miR-320b表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 mi R-320b抑制MGC-803和MKN45胃癌細(xì)胞增殖能力 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miRNC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45細(xì)胞增殖明顯增加，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45細(xì)胞增殖明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示mi R-320b可以抑制胃癌細(xì)胞MGC-803和MKN45的增殖能力。見圖2。

圖2 CCK-8法檢測(cè)miR-320b抑制胃癌細(xì)胞株增殖

2.4 mi R-320b促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803和MKN45細(xì)胞凋亡 與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45凋亡細(xì)胞比例增加，主要為Annexin V+/PI+細(xì)胞比例增加（右上象限），而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45凋亡細(xì)胞比例降低，提示miR-320b促進(jìn)胃癌細(xì)胞MGC-803和MKN45凋亡。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-320b促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡

2.5 miR-320b抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活 為了進(jìn)一步明確miR-320b參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，采用Western blot法檢測(cè)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后pAKT，pPI3K和總AKT、PI3K表達(dá)。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)均顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)均顯著增加，而總PI3K和AKT水平無明顯變化。見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)miR-320b抑制胃癌細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)

3 討 論

越來越多的研究表明miRNA在人類多種疾病中異常表達(dá)，包括帕金森病[25]、糖尿病[26]、動(dòng)脈粥樣硬化[27]、免疫疾病[28]，特別是惡性腫瘤[29-32]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達(dá)可影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲[33-35]，如miR-140-5p結(jié)合THY1抑制Notch通路活化，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)進(jìn)程[36]，miR-106a調(diào)節(jié)TFAP2E甲基化介導(dǎo)MGC-803細(xì)胞耐藥[37]。本研究結(jié)果顯示，與胃癌癌旁組織比較，胃癌組織中miR-320b表達(dá)量顯著降低，與結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤和鼻咽癌中的發(fā)現(xiàn)一致[1，38-39]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-320b可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞[17]和結(jié)直腸癌細(xì)胞[38]增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染mi R-320 inhibitor可以特異性抑制MGC-803和MKN45細(xì)胞miR-320b表達(dá)，細(xì)胞增殖能力增加，凋亡率降低，提示miR-320b在胃癌細(xì)胞增殖過程中可能發(fā)揮抑制作用。

許多研究表明，在胃癌中PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)生改變，如常會(huì)出現(xiàn)PIK3CA（PI3K一個(gè)亞基）點(diǎn)突變[40-43]，在胃癌及其它腫瘤中PI3K/AKT信號(hào)通路通常被激活[44]。本研究結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的胃癌細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的胃癌細(xì)胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)顯著增加。miR-320b通過調(diào)節(jié)PI3K和AKT磷酸化水平影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡甚至化療和放療抗性[22]，從而在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但miR-320b對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-320b在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路激活，提示miR-320b在胃癌中可能發(fā)揮重要的抑癌作用，顯著影響胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡，這種作用可能是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。