MicroRNA-320a靶向Pirh2調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移研究*

陳穎穎，唐 翀

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院/南通市第一人民醫(yī)院1呼吸內(nèi)科；2普外科，江蘇 226001）

肺癌是常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，2018年全球約有177萬肺癌患者死亡[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%[2]，目前治療包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療[3]，但大多數(shù)患者診斷時(shí)已處于中晚期，5年生存率低于20%[4]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。

MicroRNA（miRNA）是一段內(nèi)源性非編碼單鏈RNA小分子，通過與靶基因3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合而降解靶基因mRNA，調(diào)控靶基因水平，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)過程[5]。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，預(yù)測超過60%的人類基因受miRNAs調(diào)控。miRNA在多種腫瘤中差異表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-320a在NSCLC中表達(dá)下調(diào)，并可作為直接靶向NSCLC細(xì)胞的腫瘤抑制因子[7-8]。泛素連接酶Pirh2（p53-induced RING-H2 protein）是一種具有內(nèi)在泛素連接酶活性，促使底物蛋白發(fā)生泛素化修飾的結(jié)合蛋白，影響NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過程[9-10]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Pirh2可能是miR-320a靶基因，但miR-320a是否靶向調(diào)控NSCLC中Pirh2蛋白，從而參與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移仍不清楚。本研究選擇2020年1月—12月于我院行NSCLC根治手術(shù)的20對(duì)癌組織和癌旁組織標(biāo)本以及人NSCLC細(xì)胞系，旨在探究miR-320a靶向Pirh2對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 NSCLC根治手術(shù)的20對(duì)癌組織及癌旁組織標(biāo)本，均經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)，在手術(shù)后立即儲(chǔ)存在液氮中。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 人NSCLC細(xì)胞系 人NSCLC細(xì)胞系（H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1）和正常支氣管上皮細(xì)胞株（16HBE）購自美國ATCC公司，采用含10%胎牛血清，鏈霉素（50μg/mL）和青霉素（50 U/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待A549細(xì)胞生長至80%融合度，以適當(dāng)密度接種至6孔板中。按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為6組:NC mimics組、miR-320a mimics組、NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-Pirh2組（轉(zhuǎn)染si-Pirh2）、miR-320a mimics+NC組（共轉(zhuǎn)染miR-320amimics和pcDNA3.1）、miR-320a mimics+Pirh2組（共轉(zhuǎn)染miR-320a mimics和pcDNA3.1-Pirh2）。按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測定Pirh2蛋白表達(dá)情況。

1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol（Invitrogen公司）提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，TaqMan MicroRNA試劑盒檢測miR-320a表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測Pirh2蛋白表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)沸水浴變性后，取20μg蛋白上樣至12%SDS-PAGE凝膠電泳。電壓80 V，當(dāng)Marker跑至分離膠與濃縮膠交界處，換至120 V電壓。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于含5%脫脂牛奶中室溫下封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗，置于4℃冰箱過夜。洗膜，5 min×3次，加入二抗，室溫避光孵育2 h，洗膜，5 min×3次。顯影。

1.6 CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn) 96孔板中加入100μL細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)板加入10μL不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A549細(xì)胞，孵育24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的NSCLC細(xì)胞以合適密度接種在6孔板中，培養(yǎng)2～3周。PBS洗滌2次，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)大于2 mm的克隆數(shù)目。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn):待測細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將104個(gè)細(xì)胞加到Transwell上室，下室加入600～800μL DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去上室中培養(yǎng)基，加入甲醇室溫固定30 min。吸干固定液，加入染液染色15～30 min。清水沖洗浸泡數(shù)次，吸去上室液體，棉簽擦除未穿過的細(xì)胞，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機(jī)選取9個(gè)視野觀察，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn):按1∶2比例將基質(zhì)膠與無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，包被Transwell上室，將104個(gè)細(xì)胞加入Transwell上室，其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將A549細(xì)胞接種于24孔板，使用Lipofectamine 2000將構(gòu)建好的野生型Pirh2-3′-UTR-WT和突變型Pirh2-3′-UTRMUT的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及NC mimics、miR-320a mimics轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作步驟檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間差異性比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人NSCLC癌組織和細(xì)胞株中miRNA-320a表達(dá)水平下調(diào) 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示，與癌旁組織相比，20例人NSCLC癌組織中miR-320a表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1A）。與正常支氣管上皮細(xì)胞株16HBE相比，NSCLC細(xì)胞株H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1中miR-320a表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），其中A549細(xì)胞表達(dá)最低，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中作為細(xì)胞模型（圖1B）。

圖1 人NSCLC組織和細(xì)胞株miRNA-320a表達(dá)水平

2.2 miR-320a過表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 將miR-320a mimics和NC mimics轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，qRT-PCR測定顯示，與NC mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-320a表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2A）。CCK-8試驗(yàn)表明，與NC mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）（圖2B）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯少于NC mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2C）。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似（圖2D）。

圖2 A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

2.3 miR-320a靶向調(diào)控Pirh2表達(dá) TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，miR-320a與Pirh2 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A），推測Pirh2可能是miR-320a的靶基因。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-320a mimics顯著降低WT-Pirh2 3′UTR的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B），而對(duì)MUT1和MUT2 Pirh2 3′UTR熒光素酶活性無影響，提示miRNA-320a與Pirh2 3′UTR特異性結(jié)合，直接調(diào)控Pirh2表達(dá)。Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-320a mimics組細(xì)胞中Pirh2蛋白表達(dá)水平低于miRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3C），進(jìn)一步證實(shí)miR-320a負(fù)向調(diào)控Pirh2表達(dá)。

圖3 熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)

2.4 Pirh2低表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 將siPirh2#1、siPirh2#2、siPirh2#3和siRNA NC分別轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，Western blot顯示siPirh2#2基因干擾效果最好（圖4A，見封二），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇siPirh2#2沉默細(xì)胞中Pirh2表達(dá)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)表明，與轉(zhuǎn)染siRNA NC細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siPirh2#2的A549細(xì)胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4B，見封二）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染siPirh2#2的細(xì)胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯少于轉(zhuǎn)染siRNA NC的細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4C，見封二）。侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似（圖4D，見封二）。

圖4 Pirh2低表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

2.5 miRNA-320a負(fù)調(diào)控Pirh2對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響 將miR-320a mimics+pcDNA3.1和miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2分別轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，克隆形成實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)表明，與miR-320a mimics+pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（圖5A，見封二），細(xì)胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯增多（圖5B，見封二），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），侵襲實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象（圖5C，見封二）。

圖5 miRNA-320a負(fù)調(diào)控Pirh2對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

3 討 論

NSCLC惡性程度較高，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，目前的治療方法雖然在一定程度上可減緩病情發(fā)展，但如何延長患者的生存期仍需進(jìn)一步研究[11-12]。先前研究已證明miRNA可能是癌癥過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13-14]，了解NSCLC與miRNA異常表達(dá)之間的關(guān)系有助于尋找新的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320a在人NSCLC組織和細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，證實(shí)miR-320a對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用以及NSCLC細(xì)胞中miR-320a負(fù)調(diào)控Pirh2的表達(dá)。

有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-320a是多種腫瘤的抑制因子，與NSCLC關(guān)系密切。miR-320a通過靶向電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）影響NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲[15]；miR-320a在NSCLC組織中表達(dá)下調(diào)，并通過直接靶向胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲[16]；miR-320a-3p/ELF3軸通過PI3K/Akt途徑調(diào)控NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。這些文獻(xiàn)均表明miR-320a對(duì)靶基因的調(diào)控在NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過靶基因預(yù)測軟件檢測發(fā)現(xiàn)miR-320a與Pirh2 3′-UTR存在互補(bǔ)的核苷酸序列，推測Pirh2可能是miR-320a的潛在靶基因，miR-320a可能通過靶向Pirh2參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

Pirh2最早由GRINDEL等[17]發(fā)現(xiàn)，由261個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為30 kDa，其中包含Rirh-H2結(jié)構(gòu)域，是RING結(jié)構(gòu)域家族的泛素連接酶E3，具有內(nèi)在泛素連接酶活性，促使底物蛋白發(fā)生泛素化修飾[9]。有研究報(bào)道，Pirh2促進(jìn)p53發(fā)生泛素化而降解，使p53抑制腫瘤生長的功能減弱或消失，導(dǎo)致腫瘤惡化。有研究發(fā)現(xiàn)，Pirh2促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且與患者低生存率有關(guān)[10]。關(guān)于miR-320a是否通過調(diào)控Pirh2而進(jìn)一步影響NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，目前仍不清楚。本研究熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-320a mimics-WT-Pirh2組細(xì)胞熒光素酶活性明顯低于miR-320a mimics-MUT-Pirh2組，且miR-320a過表達(dá)降低NSCLC細(xì)胞中Pirh2的表達(dá)，提示miR-320a直接靶向Pirh2的3′UTR。本研究采用siRNA沉默NSCLC細(xì)胞中Pirh2表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著降低，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pirh2細(xì)胞中Pirh2表達(dá)的提高則促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-320a調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制十分復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320a在人NSCLC癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，在體外miR-320a通過下調(diào)Pirh2的表達(dá)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和遷移，但其下游可能存在的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。