致病疫霉對(duì)纈菌胺敏感基線的建立及抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

楊 坡, 吳 杰, 路 粉, 趙建江, 畢秋艷,韓秀英, 李 洋, 王文橋*,

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河北 保定 071000)

由致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.) de Bary 引起的馬鈴薯及番茄晚疫病為多循環(huán)氣傳病害，發(fā)生范圍廣，流行速度快，短期內(nèi)可造成重大損失，嚴(yán)重影響了馬鈴薯和番茄的生產(chǎn)[1]。化學(xué)防治作為重要的防治手段，防效高，見(jiàn)效快，已成為晚疫病的主要防治手段，被廣泛應(yīng)用。自20 世紀(jì)70 年代末以來(lái)，苯基酰胺類殺菌劑 (甲霜靈、精甲霜靈、霜靈) 、羧酸酰胺類殺菌劑 (烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、氟嗎啉、纈霉威等) 、QoI類殺菌劑(嘧菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯等) 、氰基乙酰類 (霜脲氰) 、吡啶酰胺類 (氟吡菌胺) 和哌啶基噻唑異唑啉類 (氟噻唑吡乙酮) 等一批高效、內(nèi)吸殺菌劑及其混劑被應(yīng)用于晚疫病的防治，使晚疫病的防治水平大大提高，但隨著內(nèi)吸性殺菌劑的大量使用，一些國(guó)家相繼報(bào)道了包括致病疫霉對(duì)甲霜靈的抗性[2-8]和對(duì)嘧菌酯的抗性[9]，導(dǎo)致出現(xiàn)相應(yīng)藥劑防效明顯降低、病害再猖獗、農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。如今抗藥性已成為晚疫病化學(xué)防治中的重要問(wèn)題之一。

殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)是指隨著病原菌抗藥性的發(fā)展，存在殺菌劑防病失敗或藥效降低的可能性。抗性風(fēng)險(xiǎn)由病菌生物與遺傳特性及藥劑作用機(jī)制與作用特點(diǎn)決定的基本風(fēng)險(xiǎn)和藥劑的使用對(duì)策形成的治理風(fēng)險(xiǎn)組成[10]，是制訂抗藥性治理對(duì)策和開(kāi)發(fā)應(yīng)用殺菌劑的重要依據(jù)[11]。纈菌胺是2008 年研發(fā)的羧酸酰胺類殺菌劑，可有效防治由卵菌中除腐霉屬之外的病原菌引起的局部或系統(tǒng)性侵染病害[12]。66%代森錳鋅 ? 纈菌胺水分散粒劑已在中國(guó)登記用于防治馬鈴薯晚疫病，目前尚未見(jiàn)有關(guān)致病疫霉對(duì)纈菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)建立致病疫霉對(duì)纈菌胺的敏感基線，篩選致病疫霉對(duì)纈菌胺的抗性突變菌株，研究纈菌胺與現(xiàn)用的其他羧酸酰胺類殺菌劑及非羧酸酰胺類殺菌劑之間的交互抗性，旨在為監(jiān)測(cè)致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性的發(fā)生發(fā)展提供參考，為明確致病疫霉對(duì)纈菌胺的抗性風(fēng)險(xiǎn)、制定致病疫霉對(duì)纈菌胺的抗性治理策略及晚疫病高效化學(xué)防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基及藥劑 黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(rye sucrose agar，RSA)：黑麥80 g，瓊脂15 g，蔗糖20 g，蒸餾水定容至1 L。利福平(rifampicin)，索萊寶(CAS：13292-46-1)；氨芐西林鈉 (ampicillin)，索萊寶(CAS：69-52-3)；95%五氯硝基苯(quintozene)原藥，山西三立化工有限公司；98%多菌靈 (polymyxin) 原藥，河北冠龍農(nóng)化有限公司。

1.1.2 供試菌株 于2018 年從河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、貴州省和四川省未使用過(guò)纈菌胺，且鮮用其他羧酸酰胺類殺菌劑防治晚疫病的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，采集具有晚疫病典型癥狀的新鮮病葉。每個(gè)省 (自治區(qū)) 選2～3 個(gè)市(縣)，每個(gè)市(縣)選擇3～5 個(gè)馬鈴薯集中種植區(qū)，每個(gè)種植區(qū)至少間隔10 km，從5 個(gè)不同的地塊采集20～40 個(gè)病樣 (表1)。

表1 供試菌株采集時(shí)間及地點(diǎn)Table 1 Collection time and location of the tested strains

剪取病葉病健交界處，分別夾于健康、感病的馬鈴薯薯塊切口中，置于保溫箱內(nèi)。將馬鈴薯薯塊置于滅菌的、底部鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中的一次性筷子上，并在18 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)至薯塊切口邊緣長(zhǎng)出白色菌絲 (視情況可將健康馬鈴薯薯塊轉(zhuǎn)接多次)。挑取菌絲轉(zhuǎn)接到選擇性黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板 (RSA 中加入50 μg/mL 利福平、50 μg/mL 氨芐西林鈉、50 μg/mL 五氯硝基苯和50 μg/mL 多菌靈) 上，18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7～10 d。挑取培養(yǎng)后的菌絲塊，置于載玻片上鏡檢觀察。接種感病馬鈴薯葉片，再分離，完成柯赫氏法則檢驗(yàn)。將具有致病疫霉的典型特征的菌株保存在RSA 斜面上或平板上待試。共獲得105 個(gè)致病疫霉菌株，用于測(cè)定對(duì)纈菌胺的敏感性。

1.1.3 供試藥劑 98% 纈菌胺(valifenalate) 原藥，江蘇省蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司；95%雙炔酰菌胺(mandipropamid)原藥，先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；97.6%烯酰嗎啉(dimethomorph)原藥，河北冠龍農(nóng)化有限公司；95% 嘧菌酯(azoxystrobin)原藥，南京金土地化工有限公司；95%氟吡菌胺(fluopicolide)原藥，拜耳作物科學(xué)公司；98%霜脲氰(cymoxanil)原藥，杜邦公司；97%甲霜靈 (metalaxyl)原藥，沈陽(yáng)化工研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病疫霉對(duì)纈菌胺敏感性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13]測(cè)定。以二甲基亞砜為溶劑，配制質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的纈菌胺母液，用無(wú)菌水將母液依次稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156 和0.078 mg/L 藥液。準(zhǔn)確移取6 mL 不同濃度藥液，分別添加到事先滅菌并冷卻至50～54 ℃的54 mL RSA 培養(yǎng)基中，之后倒入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中，制成系列質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156 和0.0078 mg/L的含纈菌胺的RSA 平板。對(duì)照組添加相同質(zhì)量濃度的二甲基亞砜和等量的無(wú)菌水，制成不含藥劑的RSA 平板。

將分離純化的致病疫霉菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，于18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)滿平板。在菌落邊緣打取直徑0.5 cm 的菌餅，轉(zhuǎn)移至含有不同質(zhì)量濃度纈菌胺的RSA 平板中央。每濃度和對(duì)照組平板各重復(fù)3 次，于18 ℃下黑暗培養(yǎng)7～10 d。當(dāng)無(wú)菌水對(duì)照平板菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，按 (1) 式計(jì)算各藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

式中：I為抑制率，%；D0為對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑，mm；Dt為處理組菌落生長(zhǎng)直徑，mm。

以藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù) (x) 為橫坐標(biāo)，抑制率轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的機(jī)率值 (y) 為縱坐標(biāo)，求出纈菌胺對(duì)供試菌株的毒力回歸方程y= bx+a，計(jì)算抑制菌落生長(zhǎng)的有效中濃度(EC50)及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 致病疫霉對(duì)纈菌胺敏感基線的建立 參照DBl3/T 1420—2011《馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》的方法[13]，將供試菌株對(duì)纈菌胺的敏感性(EC50值)劃分成5 個(gè)區(qū)段，以每個(gè)區(qū)段菌株出現(xiàn)的頻率 (%) 為縱坐標(biāo)，以藥劑濃度區(qū)段為橫坐標(biāo)，畫(huà)出菌株敏感性分布光滑曲線圖，由5 個(gè)點(diǎn)連成，每一點(diǎn)以(x, y)來(lái)表示，x= 濃度區(qū)段中值，y代表該區(qū)段菌株出現(xiàn)頻率。利用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行不同區(qū)段菌株頻率數(shù)據(jù)正態(tài)性分布檢驗(yàn)，如果Ρ> 0.05，即在95%置信限內(nèi)，敏感性呈近似正態(tài)分布，則菌株可視為野生敏感菌株，其敏感性(EC50)平均值可作為敏感基線(EC50值)，計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后3 位數(shù)字。

1.2.3 致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性突變體的獲得

1.2.3.1 紫外誘變菌絲體 將野生敏感菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，待菌落長(zhǎng)滿平板后，置于紫外燈(15 W，254 nm，預(yù)熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處，分別照射10、15、20、25、30 和35 min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)照射完成后，在黑暗條件下培養(yǎng)至少30 min。在無(wú)菌紅光條件下打取直徑5 mm 菌塊，菌絲面向下接種到不含藥劑的RSA 平板。每處理10 皿，每皿4 塊。在黑暗、18 ℃下培養(yǎng)7～10 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。觀察菌落生長(zhǎng)情況，確定照射亞致死時(shí)間。

將野生敏感菌株接種在不含藥劑的RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，待菌落長(zhǎng)滿平板后，接種到含1、0.5、0.25、0.125、0.0625 和0.03125 mg/L 纈菌胺的RSA 平板及對(duì)照平板上，在黑暗、18 ℃下培養(yǎng)7～10 d后觀察菌絲生長(zhǎng)情況，確定藥劑最低抑制質(zhì)量濃度(MIC，0.5 mg/L)。

參考趙衛(wèi)松[14]的方法，先在黑暗無(wú)菌條件下，將一批長(zhǎng)滿敏感菌株的平板置于紫外燈 (15 W，254 nm，預(yù)熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處照射30 min，再在黑暗條件下培養(yǎng)至少30 min。在無(wú)菌紅光條件下從菌落邊緣切取大小為10 mm ×10 mm 的菌塊，菌絲面向下接種至含MIC 或以上濃度纈菌胺的RSA 平板上。每皿4 塊，在黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，觀察菌塊菌絲生長(zhǎng)情況。若能在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上生長(zhǎng)，表明該野生敏感菌株對(duì)纈菌胺產(chǎn)生了抗性。按公式 (2) 計(jì)算抗性突變頻率。

式中：MR1為紫外誘變菌絲體的抗性突變率；NR為出現(xiàn)抗性突變的菌餅數(shù)；NT為供試的菌餅總數(shù)。

1.2.3.2 紫外誘變孢子囊 將野生敏感菌株接種在RSA 平板上，在黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)15 d后，用無(wú)菌水洗下孢子囊，用雙層紗布過(guò)濾，在顯微鏡下調(diào)孢子囊濃度至 5 × 105個(gè)/mL。在無(wú)菌條件下，取上述孢子囊懸浮液5 mL 置于距紫外燈(15 W，254 nm，預(yù)熱 30 min) 下方垂直距離25 cm處，邊振蕩邊分別照射30、60、90、120、150 和180 s。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)照射完成后，再在黑暗條件下培養(yǎng)至少30 min。在無(wú)菌紅光條件下均勻涂布在不含藥劑的R S A 平板上，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種10 皿，每皿10 μL，觀察菌落生長(zhǎng)情況及疏密程度，確定紫外線照射孢子囊亞致死時(shí)間。

參照Van Tyul 的方法[15]，在無(wú)菌條件下，取上述孢子囊懸浮液5 mL，置于距紫外燈 (15 W，254 nm，預(yù)熱 30 min) 下方垂直距離25 cm 處，邊振蕩邊照射120 s 后，在黑暗條件下培養(yǎng)30 min。在無(wú)菌紅光條件下均勻涂布在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上，每菌株接種10 皿，每皿10 μL，于黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d。若能在含MIC 及以上濃度纈菌胺的RSA 平板上長(zhǎng)出菌絲，表明該野生敏感菌株對(duì)纈菌胺產(chǎn)生了抗性，按公式 (3) 計(jì)算突變頻率。

式中：MR2為紫外誘變孢子囊的抗性突變率；NSR為出現(xiàn)抗性突變菌株孢子囊數(shù)；NST受紫外線照射的孢子囊總數(shù)。

1.2.3.3 藥劑馴化 將野生敏感菌株分別接種到含0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 和1.0 mg/L 纈菌胺的RSA 平板上，于黑暗、18 ℃條件下培養(yǎng)7～10 d，觀察平板上菌絲生長(zhǎng)情況，確定纈菌胺對(duì)親本敏感菌株GZGY 的亞致死質(zhì)量濃度為0.4 mg/L，MIC 為0.5 mg/L，對(duì)親本敏感菌株CFKLQ 的亞致死質(zhì)量濃度為0.3 mg/L，MIC 為0.4 mg/L。親本敏感菌株GZGY 在含0.4～6 mg/L (質(zhì)量濃度逐代遞增) 纈菌胺的RSA 平板上繼代培養(yǎng)11 代；親本敏感菌株CFKLQ 在含0.3～1.2 mg/L (質(zhì)量濃度逐代遞增) 纈菌胺的RSA 平板上繼代培養(yǎng)11 代，逐代測(cè)定馴化過(guò)的親本菌株對(duì)纈菌胺的敏感性，方法見(jiàn)1.2.1 節(jié)。根據(jù)馴化過(guò)的親本菌株在含有大于或等于MIC 纈菌胺的RSA 平板上是否生長(zhǎng)，判斷其對(duì)纈菌胺是否產(chǎn)生了抗性，并測(cè)定馴化獲得的抗性突變體對(duì)纈菌胺的抗性水平。

1.2.4 抗性突變體的抗性水平測(cè)定 按照DBl3/T 1420—2011《馬鈴薯晚疫病菌抗藥性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》[13]，采用菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定紫外誘導(dǎo)及藥劑馴化獲得的抗性突變體及其親本菌株對(duì)纈菌胺的EC50值，求出各抗性突變體的抗性水平?？剐运?= 抗藥性突變體EC50值/親本敏感菌株EC50值。

致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性等級(jí)的劃分：敏感(S)，敏感性(EC50值)≤敏感基線的95%置信限上限，抗性水平≤(敏感基線的95% 置信限上限/敏感基線)；低抗(LR)，(敏感基線的95%置信限上限/敏感基線)<抗性水平≤10 倍；中抗(MR)，10 倍<抗性水平≤100 倍；高抗(HR)，抗性水平>100 倍。

1.2.5 抗性突變體對(duì)不同藥劑的交互抗性測(cè)定 參照羅彥濤等[16]的方法，采用菌絲生長(zhǎng)速率法分別測(cè)定8 個(gè)抗性突變菌株及其6 個(gè)親本敏感菌株對(duì)烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、甲霜靈、嘧菌酯、霜脲氰和氟吡菌胺等6 種常用防治晚疫病內(nèi)吸性殺菌劑的敏感性。用SPSS 軟件進(jìn)行皮爾遜檢驗(yàn)，分析抗性突變菌株及其親本敏感菌株對(duì)纈菌胺的EC50值的對(duì)數(shù)值與抗性突變菌株及其親本敏感菌株對(duì)其他6 種常用晚疫病防治藥劑中每種藥劑的EC50值對(duì)數(shù)值之間的相關(guān)性，記錄相關(guān)系數(shù)。如果P> 0.05，即表明在P= 0.05 的水平下差異不顯著，說(shuō)明兩種藥劑之間無(wú)相關(guān)性，表明纈菌胺與該藥劑之間不存在交互抗性關(guān)系；如果P< 0.05，表明纈菌胺與該藥劑之間有相關(guān)性。相關(guān)系數(shù)越高，相關(guān)性越大，通常相關(guān)系數(shù)大于0.75 時(shí)，則認(rèn)為兩種藥劑之間存在交互抗性關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.05、SPSS 26.0 及Microsoft Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉對(duì)纈菌胺敏感基線建立

纈菌胺對(duì)從河北、內(nèi)蒙古、貴州、四川、黑龍江等省或自治區(qū)未使用過(guò)纈菌胺或鮮用其他羧酸酰胺類殺菌劑的地區(qū)采集的105 個(gè)菌株的EC50值范圍為0.0594～0.159 mg/L (圖1)，敏感性差異為2.7 倍，平均值為(0.102 ± 0.024) mg/L，通過(guò)DPS 軟件進(jìn)行W 正態(tài)檢驗(yàn)：W= 0.980，P=0.141 (> 0.05)，敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，未觀察到對(duì)纈菌胺敏感性明顯下降的抗性亞群體，說(shuō)明所測(cè)菌株均為對(duì)纈菌胺敏感的野生菌株，以菌株出現(xiàn)頻率為縱坐標(biāo)、有效抑制中濃度區(qū)間為橫坐標(biāo)，畫(huà)出105 個(gè)野生敏感菌株對(duì)纈菌胺的敏感性分布曲線 (圖2)，同時(shí)將105 個(gè)野生敏感菌株平均EC50值(0.102 ± 0.024) mg/L 作為致病疫霉對(duì)纈菌胺的敏感基線。

圖1 105 株致病疫霉菌株對(duì)纈菌胺的敏感性分布Fig. 1 Senisitivity distribution of 105 isolates of Phytophthora infestans to valifenalate

圖2 致病疫霉對(duì)纈菌胺的敏感基線Fig. 2 Sensitivity baseline of Phytophthora infestans to valifenalate

2.2 致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性突變體抗性水平

由表2 可知，紫外照射致病疫霉菌絲體的亞致死時(shí)間為30 min，紫外照射孢子囊懸浮液的亞致死時(shí)間為120 s。

表2 紫外誘變?cè)囼?yàn)亞致死時(shí)間的確定Table 2 Determination of sublethal time in ultraviolet mutagenesis test

通過(guò)紫外線照射敏感菌株的菌絲體，共處理736 個(gè)菌塊，獲得了4 個(gè)對(duì)纈菌胺的抗性突變體，抗性水平為3.2～14.9 倍，突變頻率為0.54%；通過(guò)紫外線照射敏感菌株孢子囊懸浮液，共照射用孢子囊懸浮液涂布的RSA 平板300 皿，獲得了2 個(gè)對(duì)纈菌胺的抗性突變體，抗性水平分別為8.1 倍和8.2 倍，突變頻率為1.33 × 10?7；通過(guò)對(duì)野生敏感菌株進(jìn)行藥劑馴化11 代，獲得了2 個(gè)抗性水平分別為3.1 倍和9.4 倍的抗性突變體 (表3和表4)。通過(guò)紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化共獲得8 個(gè)對(duì)纈菌胺抗性突變體 (表5)。

表3 致病疫霉親本菌株GZGY 經(jīng)藥劑馴化獲得對(duì)纈菌胺抗性過(guò)程Table 3 The acquisition of resistance to valifenalate in Phytophthora infestans parent strain GZGY

表4 致病疫霉親本菌株CFKLQ 經(jīng)藥劑馴化獲得對(duì)纈菌胺抗性過(guò)程Table 4 The acquisition of resistance to valifenalate in P. infestans parent strain CFKLQ

表5 致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性突變體的抗性水平Table 5 Resistance factor to valifenalate of the valifenalate-resistant mutants of P. infestans

2.3 纈菌胺與其他藥劑的交互抗藥性

結(jié)果表明：致病疫霉對(duì)纈菌胺不同抗性突變體及其親本敏感菌株對(duì)纈菌胺 EC50對(duì)數(shù)值(lgEC50)與對(duì)雙炔酰菌胺、烯酰嗎啉的 EC50對(duì)數(shù)值(lgEC50)之間相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.862 和0.890，表明纈菌胺與烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺之間存在交互抗性關(guān)系；致病疫霉對(duì)纈菌胺的不同抗性突變體及其親本菌株的 lgEC50分別與嘧菌酯、氟吡菌胺、甲霜靈和嘧菌酯lgEC50之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.175、0.281、0.255 和 ?0.108，表明纈菌胺與嘧菌酯、氟吡菌胺、甲霜靈和霜脲氰之間無(wú)交互抗性 (圖3)。

圖3 致病疫霉對(duì)纈菌胺及其他6 種殺菌劑交互抗性模式Fig. 3 Cross-resistance patterns of P. infestans to valifenalate and the other 6 fungicides

3 結(jié)論與討論

羧酸酰胺(CAA)類殺菌劑是一大類作用機(jī)理不同于其他防治作物卵菌病害的苯基酰胺類 (甲霜靈、精甲霜靈、霜靈)、QoI 類殺菌劑 (嘧菌酯、吡唑醚菌酯、啶氧菌酯等)、吡啶酰胺類 (氟吡菌胺)、哌啶基噻唑異唑啉類 (氟噻唑吡乙酮)、氰基乙酰類 (霜脲氰) 和咪唑類 (氰霜唑) 殺菌劑的新型高效內(nèi)吸殺菌劑，包括烯酰嗎啉 (dimenthomorph)、雙炔酰菌胺 (mandipropamid)、纈霉威 (iprovalicarb)、氟嗎啉 (flumorph)、苯噻菌胺 (benthiavalicarb)、異苯噻菌胺 (benthiavalicarb-isopropyl)、纈菌胺(valifenalate) 和丁吡嗎啉 (pyrimorph)。

采用QoI 類殺菌劑嘧菌酯防治黃瓜霜霉病，苯基酰胺類甲霜靈防治馬鈴薯晚疫病及黃瓜霜霉病2～3 年即出現(xiàn)抗藥性問(wèn)題，這些病原菌對(duì)該類藥劑已具有中至高度抗性風(fēng)險(xiǎn)[17-18]，而致病疫霉等卵菌對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺存在低至中度抗性風(fēng)險(xiǎn)[19-20]，烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺等與QoI 類殺菌劑、苯基酰胺類殺菌劑之間無(wú)交互抗性[21-22]，除纈菌胺和丁吡嗎啉外，烯酰嗎啉、氟嗎啉、雙炔酰菌胺和纈霉威單劑或混劑在田間用于防治馬鈴薯晚疫病、黃瓜霜霉病、葡萄霜霉病和辣椒疫病的時(shí)間已遠(yuǎn)超10 年，盡管有些國(guó)家已檢測(cè)到田間靶標(biāo)菌對(duì)烯酰嗎啉的抗性菌株，如1994 年法國(guó)用烯酰嗎啉防治葡萄霜霉病8 年后發(fā)現(xiàn)田間抗性菌株[23]，隨后意大利、瑞士、德國(guó)及中國(guó)檢測(cè)到黃瓜霜霉病菌、辣椒疫霉等卵菌對(duì)雙炔酰菌胺和氟嗎啉的田間抗性菌株[24-26]，但目前羧酸酰胺類殺菌劑防治晚疫病等卵菌病害仍然維持良好的防效。

本研究通過(guò)紫外誘導(dǎo)和藥劑馴化方法均獲得了致病疫霉對(duì)纈菌胺的抗性突變體，但抗性突變體抗性水平較低，同時(shí)纈菌胺與有低至中度抗性風(fēng)險(xiǎn)的烯酰嗎啉及雙炔酰菌胺之間有交互抗性關(guān)系，與具有高度抗性風(fēng)險(xiǎn)的甲霜靈和嘧菌酯、有中度抗性風(fēng)險(xiǎn)的氟吡菌胺和有低度抗性風(fēng)險(xiǎn)的霜脲氰之間無(wú)交互抗性，由此初步推測(cè)，纈菌胺與烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺具有相同的作用機(jī)理，致病疫霉對(duì)纈菌胺有低至中度抗性風(fēng)險(xiǎn)，這一結(jié)論尚待研究致病疫霉對(duì)纈菌胺抗性突變體的遺傳穩(wěn)定性、競(jìng)爭(zhēng)力、適合度及機(jī)理等生物學(xué)性狀及監(jiān)測(cè)登記產(chǎn)品纈菌胺 ? 代森錳鋅使用地區(qū)致病疫霉群體對(duì)纈菌胺的敏感性下降趨勢(shì)后進(jìn)一步評(píng)估。雖然纈菌胺與烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺之間存在交互抗性，但是纈菌胺仍可與其他保護(hù)性殺菌劑或內(nèi)吸性殺菌劑混用，以防治馬鈴薯和番茄晚疫病等卵菌病害。

致病疫霉被國(guó)際殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)(FRAC)劃分為具有高度抗性風(fēng)險(xiǎn)的病原菌[27]，因此不能忽視其對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑的抗性治理。建議在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)限制每個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)羧酸酰胺類殺菌劑使用不超過(guò)3 次，嚴(yán)格按照推薦劑量用藥，并與多作用位點(diǎn)的保護(hù)性殺菌劑 (代森錳鋅、百菌清等) 或與其無(wú)交互抗性的其他作用機(jī)理的藥劑(氟吡菌胺、嘧菌酯、氟噻唑吡乙酮、霜脲氰等)混用或交替使用，以延緩病原菌抗性的產(chǎn)生，延長(zhǎng)羧酸酰胺類殺菌劑的使用壽命。此外，在推廣使用登記產(chǎn)品纈菌胺 ? 代森錳鋅制劑防治晚疫病后，應(yīng)密切關(guān)注田間纈菌胺防治晚疫病的防治效果，監(jiān)測(cè)不同年份、不同地區(qū)致病疫霉對(duì)纈菌胺敏感性的變化，并對(duì)纈菌胺田間藥效進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步評(píng)估田間致病疫霉的抗性風(fēng)險(xiǎn)，為纈菌胺等羧酸酰胺類殺菌劑持久發(fā)揮良好的防治效果提供參考。