生防枯草芽孢桿菌HMB19198 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選及優(yōu)化

曲遠(yuǎn)航, 郭慶港*,, 李社增, 宣立鋒, 張曉云, 馬 平

(1. 河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；2. 河北省農(nóng)林科學(xué)院 石家莊果樹研究所，石家莊 050061)

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis及其近源菌種由于能產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，并且能形成耐逆、抗熱的芽孢而利于制劑的研制，因此成為了開發(fā)微生物源殺菌劑的重要資源[1-2]。目前防治作物土傳病害的微生物源殺菌劑制劑多為可濕性粉劑和干粉種衣劑，這些制劑加工過程中的瞬時高溫易殺死以營養(yǎng)體形態(tài)存在的菌體，而以芽孢形態(tài)存在的菌體則可能存活。因此，在考查微生物發(fā)酵指標(biāo)時，既要考慮菌體的數(shù)量，還應(yīng)考慮耐熱芽孢的濃度[3]。理想的發(fā)酵體系首先應(yīng)能提高菌體的發(fā)酵水平，其次還能通過營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控和環(huán)境條件的改變使菌體最大可能地轉(zhuǎn)化為耐逆性強(qiáng)的芽孢[4]?？莶菅挎邨U菌菌體生長和芽孢的形成受多種因素影響，而培養(yǎng)基中的碳源和氮源是其主要影響因素，充足的碳源和氮源可促進(jìn)菌體的生長，但芽孢的形成則一般發(fā)生在營養(yǎng)匱乏等逆境情況下[5]。由于不同菌株對適合自身菌體生長和芽孢形成所需的營養(yǎng)物質(zhì)不同，因此，針對某一特定菌株，需要探索其特定的最適營養(yǎng)物質(zhì)組成。

對于防治氣傳病害的微生物源殺菌劑，除了考慮菌體數(shù)量和活芽孢數(shù)量外，還要考慮其活性成分的含量。枯草芽孢桿菌類細(xì)菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)主要是脂肽類抗生素，包括泛革素 (fengycin) 、表面活性素 (surfactin) 和依枯草素 (iturins) ，其中泛革素對多種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制活性，在植物病害防治中發(fā)揮著重要作用。Islam 等[6]鑒定出枯草芽孢桿菌C9 菌株產(chǎn)生的主要抗真菌物質(zhì)為泛革素，并通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以甘露醇為碳源、以黃豆粉為氮源時泛革素的產(chǎn)量最高。Yaseen等[7]則發(fā)現(xiàn)，不同碳源和氮源會影響泛革素啟動子的表達(dá)，以尿素或尿素和銨鹽的混合物為氮源、以甘露醇為碳源時，可以提高泛革素啟動子的活性，從而提高其產(chǎn)量。

目前工業(yè)化的細(xì)菌培養(yǎng)基原料主要包括糖類、玉米粉、淀粉、各種油料作物餅粉和魚粉等農(nóng)副產(chǎn)品，以及銨鹽、硝酸鹽和鉀、鈉、鎂等礦物質(zhì)元素。其中葡萄糖、糖蜜、淀粉及玉米粉主要提供碳源，豆餅粉、魚粉、銨鹽和硝酸鹽主要提供氮源。鐘蔚[8]通過單因素篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以麥芽浸粉作為碳源時，枯草芽孢桿菌BS1 菌株芽孢濃度最高；以黃豆粉作為氮源時，雖然芽孢濃度較低，但由于菌體濃度大，所以其芽孢產(chǎn)量仍遠(yuǎn)高于其他氮源條件下的芽孢產(chǎn)量，因此仍可作為最適氮源用于BS1 菌株的發(fā)酵。也有研究報道，紅糖、淀粉和葡萄糖可作為枯草芽孢桿菌的最佳碳源，而花生餅粉、豆粕、酵母浸粉及牛肉膏可作為枯草芽孢桿菌的最佳氮源[9-12]。由此可見，不同菌株適宜的最佳碳源和氮源各不相同。

枯草芽孢桿菌HMB19198 菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室分離獲得的一株生防細(xì)菌，已證明以其為活性成分的微生物菌劑能有效防治番茄灰霉病和瓜類白粉病，且該菌株可產(chǎn)生脂肽類抗生素泛革素和表面活性素等活性物質(zhì)，其中泛革素是主要的抑菌活性物質(zhì)[13]。為提高HMB19198 菌株的發(fā)酵水平，降低相關(guān)菌劑的生產(chǎn)成本，本研究以活芽孢濃度為指標(biāo)，首先從工業(yè)生產(chǎn)常用培養(yǎng)基中篩選出較適合HMB19198 菌株芽孢形成的基礎(chǔ)配方，并進(jìn)一步對碳源和氮源進(jìn)行篩選及優(yōu)化，結(jié)合Plackett-Bruman 設(shè)計與響應(yīng)曲面分析 (RSA) ，獲得到了利于HMB19198 菌株芽孢形成的發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisHMB19198 菌株，由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離和保存，中國微生物菌種保藏中心保藏編號為CGMCC No. 5613，于?80 ℃長期保存在含有體積分?jǐn)?shù)30%甘油的LB 培養(yǎng)基 (胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 5 g/L) 中，使用前在LB 固體培養(yǎng)基上于37 ℃進(jìn)行活化。

1.2 芽孢濃度測定

取1 mL 菌液，于80 ℃高溫處理10 min，之后用滅菌水系列稀釋，分別取100 μL 10?4和10?5稀釋倍數(shù)的菌懸液，涂布于LB 固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)過夜，統(tǒng)計芽孢濃度。以未經(jīng)高溫處理的菌懸液為空白對照，并按式 (1) 計算芽孢的形成率[14]。

式中：SR 為芽孢形成率，%；TC 為80 ℃高溫處理組菌落數(shù)，CFU/mL；UC 為空白對照組菌落數(shù)，CFU/mL。

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報道[7,15-18]，選擇8 種常用于芽孢桿菌的培養(yǎng)基 (標(biāo)號1 ～ 8) 作為HMB19198 菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (表1) 。將活化好的HMB19198 菌株接種于5 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h后，按照1 : 100 的比例接種于100 mL 各基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，篩選發(fā)酵液中芽孢濃度最高的培養(yǎng)基作為HMB19198 菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基配方信息詳見表1。

表1 芽孢桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基Table 1 Basic mediums for Bacillus

1.4 最適碳源及氮源篩選

在篩選出利于HMB19198 菌株芽孢形成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)方法，選取12種碳源 (麥麩粉、水解玉米粉、玉米粉、糖蜜、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、可溶性玉米淀粉和蘋果酸) 及10 種氮源 (豆餅浸粉、酶解玉米漿、花生餅浸粉、棉籽餅粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、魚粉、黃豆粉和硫酸銨) ，以30 g/L質(zhì)量濃度分別替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源。按照1.2 節(jié)所述方法測定發(fā)酵液中芽孢濃度，篩選利于HMB19198 菌株芽孢形成的最佳碳源和氮源。

1.5 Plackett-Burman 法分析培養(yǎng)基中影響菌株芽孢形成的主要因子

Plackett-Burman 法是一種近飽和的兩水平試驗(yàn)設(shè)計方法，該方法能通過最少試驗(yàn)次數(shù)快速篩選出影響某一性狀的主要因子[19]。本研究利用Plackett-Burman 法對利于HMB19198 菌株芽孢形成的碳、氮源進(jìn)行優(yōu)化，每個因素分別取低水平“?1”和高水平“1”兩個水平，采用 Minitab 軟件進(jìn)行方差分析。具體試驗(yàn)因子及水平見表2。

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)因子與水平設(shè)計Table 2 Experimental design of the factors and levels of Plackett-Burman

1.6 響應(yīng)曲面分析法確定發(fā)酵液芽孢濃度最高時的培養(yǎng)基配方

響應(yīng)曲面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法[19]。在Plackett-Burman 分析的基礎(chǔ)上，以可溶性玉米淀粉、糖蜜、花生餅浸粉、K2HPO4?3H2O 為參考因子，以發(fā)酵液中芽孢濃度為指標(biāo)，采用Design-Expert 軟件按照Boxbehnken 中心組合設(shè)計4 因子、3 水平、29 次運(yùn)行的響應(yīng)曲面試驗(yàn)。具體試驗(yàn)因子及水平見表3。通過對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，最后在一定的水平范圍內(nèi)求出最佳值。

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因子與水平設(shè)計Table 3 Experimental design of the factors and levels of RSA

1.7 枯草芽孢桿菌HMB19198 菌株生長曲線測定

按照優(yōu)化后的配方配制優(yōu)化培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的HMB19198 菌株按照1 : 100 的比例分別接種到優(yōu)化培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取樣統(tǒng)計發(fā)酵液中芽孢濃度，計算芽孢形成率，并繪制生長曲線。

1.8 優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵液所產(chǎn)泛革素濃度測定

將HMB19198 菌株分別以優(yōu)化培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基于37 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)48 h，獲得菌株發(fā)酵液；發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min 下離心20 min，收集上清液；用6 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)上清液pH 值至2.0，4 ℃下過夜，次日于10000 r/min下離心20 min，收集沉淀；沉淀干燥后加入甲醇抽提2 次，合并抽提液得到脂肽粗提物。

采用高效液相色譜 (HPLC) 梯度洗脫分離脂肽化合物。HPLC 分析系統(tǒng)為 AKTA Purifier 10 液相分析系統(tǒng)，色譜柱為 SOURCE5 RPC ST4.6/150柱。流動相A 為V(三氟乙酸) :V(乙腈) :V(水) =0.065 : 2﹕97.935，流動相B 為V(三氟乙酸) :V(乙腈) :V(水) = 0.05 : 80 : 19.95。梯度洗脫，49.86 min內(nèi)流動相A 由100%到0。檢測波長215 nm，流速1 mL/min。本團(tuán)隊(duì)前期研究已明確，保留時間在20～25 min 的物質(zhì)為泛革素[13]，因此，本研究將20～25 min 期間洗脫液的峰面積除以對應(yīng)處理的芽孢濃度作為不同培養(yǎng)基發(fā)酵液中泛革素的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基

利用8 種芽孢桿菌常用培養(yǎng)基對HMB19198菌株進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)基中HMB19198菌株的芽孢濃度。結(jié)果表明：2 號培養(yǎng)基中發(fā)酵液的芽孢濃度最高，達(dá)到3.34 × 109個/mL；其次是5 號培養(yǎng)基，芽孢濃度為2.97 × 109個/mL，1 號和6 號培養(yǎng)基結(jié)果與5 號培養(yǎng)基接近，分別為2.90 ×109和2.83 × 109個/mL；4 號培養(yǎng)基中發(fā)酵液的芽孢濃度最低，僅為9.00 × 108個/mL (圖1)。由于2 號培養(yǎng)基中的芽孢濃度最高，并且其組分簡單、原料來源豐富、價格低廉且取材方便，因此，確定選擇2 號培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌HMB19198菌株芽孢濃度的影響Fig. 1 Effect of different basic mediums on the spore concentration of B. subtilis strain HMB19198

2.2 最適宜芽孢形成的碳源及氮源確定

比較了12 種碳源對HMB19198 菌株芽孢濃度的影響。結(jié)果 (圖2A) 表明：在以復(fù)雜碳源為唯一碳源的培養(yǎng)基中，HMB19198 菌株發(fā)酵液的芽孢濃度較高，其中以可溶性玉米淀粉作為唯一碳源時芽孢濃度最高，達(dá)到4.52 × 109個/mL；其次是以糖蜜為唯一碳源的培養(yǎng)基，芽孢濃度為3.38 ×109個/mL；以麥麩粉、玉米粉和水解玉米粉為唯一碳源時，芽孢濃度分別為2.14 × 109、2.05 × 109和1.93 × 109個/mL。而在以糖類物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基中，HMB19198 菌株發(fā)酵液的芽孢濃度較低。由于芽孢桿菌攝取糖蜜的速度較快，可作為發(fā)酵前期的速效碳源，攝取玉米淀粉的速度較慢，將其作為發(fā)酵中后期的遲效碳源，兩者結(jié)合構(gòu)成最適碳源組合。

圖2 不同碳源 (A) 和氮源 (B) 對枯草芽孢桿菌HMB19198 菌株芽孢形成的影響Fig. 2 Spore concentrations of B. subtilis strain HMB19198 in basic medium supplemented with different carbon (A) and nitrogen (B) sources

在確定了以可溶性玉米淀粉和糖蜜為最適碳源的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步針對10 種氮源物質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果 (圖2B) 表明：在以花生餅浸粉為氮源的培養(yǎng)基中，HMB19198 菌株發(fā)酵液的芽孢濃度最高，為5.22 × 109個/mL；其次是蛋白胨和牛肉浸膏，芽孢濃度分別為3.03 × 109和3.88 × 109個/mL；而以無機(jī)氮源 (NH4)2SO4為氮源的培養(yǎng)基中芽孢濃度最低，僅為2.90 × 108個/mL。雖然以牛肉浸膏和蛋白胨作為氮源時芽孢濃度相近，但牛肉浸膏成本較高，故選取芽孢桿菌攝取速度較快的蛋白胨作為發(fā)酵前期的速效氮源，以花生餅浸粉作為發(fā)酵中后期的遲效氮源，兩者結(jié)合構(gòu)成最適氮源組合。

2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中影響芽孢形成的主要因子

分別以可溶性玉米淀粉和糖蜜為碳源，以花生餅浸粉和蛋白胨為氮源，無機(jī)鹽為K2HPO4?3H2O和MgSO4?7H2O，利用Plackett-Burman 法對6 個因素 (表4) 進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 (表5) 表明：可溶性玉米淀粉、花生餅浸粉、糖蜜、K2HPO4?3H2O對HMB19198 菌株芽孢形成影響顯著，是影響發(fā)酵液中芽孢濃度的主要因子。圖4 中各因子的模型預(yù)測結(jié)果顯示，可溶性玉米淀粉和K2HPO4?3H2O濃度與芽孢濃度呈正相關(guān)，糖蜜和花生餅浸粉濃度與芽孢濃度呈負(fù)相關(guān)。

圖4 影響芽孢形成主要因子的預(yù)測模型Fig. 4 Predictive models of the main factors affecting spore formation

表4 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計與芽孢濃度響應(yīng)Table 4 Experimental designs of Plackett-Burman and corresponding spore concentrations

2.4 培養(yǎng)基中主要影響因子的最佳濃度及驗(yàn)證

以Plackett-Burman 分析所得4 種主要影響因子為基礎(chǔ)，以可溶性玉米淀粉45 g/L、糖蜜10 g/L、花生餅浸粉30 g/L 及K2HPO4?3H2O 7.5 g/L 作為中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 Plackett-Burman 試驗(yàn)統(tǒng)計分析Table 5 The regression analysises of Plackett-Burman experiments

利用Design Expert 10 軟件設(shè)計響應(yīng)曲面試驗(yàn)（表6），對數(shù)據(jù)分析并繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖 (圖5) ，回歸分析結(jié)果見表7。統(tǒng)計結(jié)果顯示，A (可溶性玉米淀粉)、A × C (可溶性玉米淀粉和花生餅浸粉交互) 和B × C (糖蜜和花生餅浸粉交互)對發(fā)酵液中芽孢濃度影響影響顯著。

表6 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental designs and results of RSA

當(dāng)確定糖蜜14.1 g/L、K2HPO4?3H2O 9.2 g/L為最佳值時，分析了可溶性玉米淀粉和花生餅浸粉的最佳比例。由圖5a 可見：在可溶性玉米淀粉為低水平時，隨著花生餅浸粉質(zhì)量濃度升高，發(fā)酵液中芽孢濃度逐漸降低；在可溶性玉米淀粉為高水平時，隨著花生餅浸粉質(zhì)量濃度升高，芽孢濃度呈先升高后降低趨勢。在花生餅浸粉為低水平時，隨著可溶性玉米淀粉濃度升高，發(fā)酵液中芽孢濃度變化較?。辉诨ㄉ灲蹫楦咚綍r，隨著可溶性玉米淀粉濃度升高，芽孢濃度也逐漸升高。據(jù)此，確定兩者最佳配比為可溶性玉米淀粉67 g/L，花生餅浸粉41.6 g/L。圖5b 顯示，可溶性玉米淀粉與花生餅浸粉兩個因素的交互作用顯著。

圖5 可溶性玉米淀粉與花生餅浸粉雙因素最適濃度及配比模擬結(jié)果Fig. 5 Simulation results of the optimum concentrations and ratios of soluble corn starch and peanut cake powder

當(dāng)確定可溶性玉米淀粉67 g/L、K2HPO4?3H2O 9.2 g/L 為最佳值時，分析了糖蜜和花生餅浸粉的最佳比例。由圖6a 可見：在糖蜜為低水平時，隨著花生餅浸粉質(zhì)量濃度升高，發(fā)酵液中芽孢濃度逐漸降低；在糖蜜為高水平時，隨著花生餅浸粉質(zhì)量濃度升高，發(fā)酵液中芽孢濃度呈先升高后降低趨勢。而無論花生餅浸粉為高水平或低水平，隨著糖蜜濃度升高，發(fā)酵液中芽孢濃度均呈先升高后降低趨勢。綜上，確定兩者的最佳配比為糖蜜14.1 g/L，花生餅浸粉41.6 g/L。圖6b 顯示，糖蜜和花生餅浸粉兩個因素的交互作用顯著。

圖6 糖蜜與花生餅浸粉雙因素最適濃度及配比模擬結(jié)果Fig. 6 Simulation results of the optimum concentrations and ratios of molasses and peanut cake powder

圖5 和圖6 的響應(yīng)面均為開口向下的凸型曲面，代表響應(yīng)值存在極高值。利用Design Expert 10 軟件對表7 進(jìn)行進(jìn)一步分析計算，得到模型預(yù)測的最佳點(diǎn)：即當(dāng)可溶性玉米淀粉質(zhì)量濃度為67.0 g/L、糖蜜為14.1 g/L、花生餅浸粉為41.6 g/L、K2HPO4?3H2O 為 9.2 g/L 時，預(yù)測HMB19198 菌株發(fā)酵液中芽孢濃度最高，為7.83 × 109個/mL。

表7 響應(yīng)曲面試驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 7 The regression analysis of RSA

2.5 模型驗(yàn)證

按照響應(yīng)曲面模型預(yù)測所得最佳組合，即可溶性玉米淀粉67.0 g/L、糖蜜14.1 g/L、花生餅浸粉41.6 g/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO4?3H2O 9.2 g/L及MgSO4?7H2O 1.5 g/L，配制得到優(yōu)化培養(yǎng)基，將HMB19198 菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)并統(tǒng)計芽孢濃度。結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 后，HMB19198菌株發(fā)酵液中芽孢濃度為6.92 × 109個/mL，與預(yù)測值7.83 × 109個/mL 比較接近，表明模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確。

2.6 菌株生長曲線

HMB19198 菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期，16 h 開始生長趨緩，20 h 時芽孢濃度達(dá)到最大值1.10 × 1010個/mL；該菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，26 h 時芽孢濃度達(dá)到最大值7.08 × 109個/mL (圖7)。研究表明，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，在優(yōu)化后培養(yǎng)基中，HMB19198菌株發(fā)酵周期可縮短40%，芽孢濃度提高了54.8%。

圖7 枯草芽孢桿菌HMB19198 菌株的生長曲線Fig. 7 Growth curve of B. subtilis strain HMB19198

2.7 優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵液產(chǎn)生的泛革素濃度

HMB19198 菌株分別在優(yōu)化培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后，提取2 種培養(yǎng)基中的脂肽類抗生素粗提液，利用HPLC 進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后培養(yǎng)基中泛革素的產(chǎn)量提高了39.4% (表8) 。

表8 培養(yǎng)基優(yōu)化前后發(fā)酵液中泛革素濃度Table 8 Relative contents of fengycin in fermentation mediums before and after optimization

3 結(jié)論與討論

芽孢是芽孢桿菌產(chǎn)生的休眠體，含水量極低，抗逆性強(qiáng)，能耐受高溫、紫外線等。以芽孢為主要成分的微生物農(nóng)藥制劑貨架期較長，是開發(fā)微生物源殺菌劑的主要成分[20]。

碳源物質(zhì)是培養(yǎng)基中的重要組分之一，負(fù)責(zé)為細(xì)胞提供能源、構(gòu)成碳架及合成代謝產(chǎn)物[21]。常見碳源物質(zhì)主要包括碳水化合物、脂肪、有機(jī)酸等。以生產(chǎn)芽孢為目的的芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基通常以廉價且易獲取的農(nóng)副產(chǎn)品及各種糖類為碳源，如玉米粉、淀粉、糖蜜、麩皮及蔗糖等[22-23]。本研究通過對不同碳源物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)以可溶性玉米淀粉為碳源能提高HMB19198 菌株發(fā)酵液的芽孢濃度?？扇苄杂衩椎矸凼侵参锒嗵穷愄荚?，在細(xì)菌發(fā)酵過程中可被降解為葡萄糖，進(jìn)而被細(xì)胞吸收和轉(zhuǎn)化。葡萄糖是細(xì)菌優(yōu)先利用的碳源，但過量的葡萄糖也會抑制細(xì)菌的生長和代謝代謝[24-25]。由于淀粉降解為葡萄糖存在一個緩慢的過程，保證了培養(yǎng)基中葡萄糖不會大量積累，因而避免了過量葡萄糖所造成的負(fù)面效應(yīng)[26]。尹鳳嬌等[27]通過單因素試驗(yàn)，篩選出了最適合解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensY4 菌株芽孢形成的碳源為可溶性淀粉，并通過Plackett-Burman 分析，明確了可溶性淀粉是影響發(fā)酵液中芽孢濃度的主要因子。糖蜜是食糖加工過程的副產(chǎn)品，含有較高濃度的蔗糖，易被細(xì)胞吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，糖蜜也能提高HMB19198 菌株發(fā)酵液的芽孢濃度，但糖蜜的濃度與芽孢形成率呈負(fù)相關(guān)，說明高濃度的糖蜜會抑制HMB19198 菌株芽孢的形成，因此，糖蜜可作為芽孢桿菌發(fā)酵前期的能量來源。

氮源物質(zhì)的主要功能是構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu) (氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等) 及合成含氮代謝產(chǎn)物。根據(jù)被微生物利用的速度，氮源物質(zhì)可分為遲效氮源(黃豆粉、花生餅浸粉、棉籽餅粉等) 和速效氮源(蛋白胨、硫酸銨等) 。遲效氮源通常為蛋白質(zhì)含量較高的農(nóng)副產(chǎn)品，其中花生餅浸粉含氮量為8.0%，高于豆餅粉 (6.71%) 、棉籽餅粉 (6.56%) 和黃豆粉 (5.2%)[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，以花生餅浸粉為氮源能顯著提高HMB19198 菌株的芽孢形成率。原因可能除花生餅浸粉蛋白質(zhì)含量較高外，還因其含有較多的氨基酸、多肽及某些生長因子，能促進(jìn)HMB19198 菌株的生長和代謝。

碳/氮比 (C/N ratio) 是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的重要參數(shù)，直接影響發(fā)酵過程中菌體的生長和代謝，碳/氮比過高或過低均不利于芽孢桿菌的發(fā)酵[29]。適合芽孢桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)基碳/氮比通常為5～10；碳/氮比偏高 (12～20) 通常會導(dǎo)致芽孢產(chǎn)量降低，但可刺激代謝產(chǎn)物的分泌；而碳/氮比過高(> 20) 會導(dǎo)致芽孢及代謝產(chǎn)物產(chǎn)量同時降低；碳/氮比過低 (< 5) 則會導(dǎo)致菌體自溶[30]。本研究通過響應(yīng)曲面法，分析了可溶性玉米淀粉和糖蜜組成的碳源與不同比例花生餅浸粉氮源對HMB19198菌株芽孢形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可溶性玉米淀粉和糖蜜濃度處于較高水平、花生餅浸粉濃度在中等水平，即碳/氮比為15.8 時，發(fā)酵液中芽孢濃度最高。本研究優(yōu)化后培養(yǎng)基的碳/氮比略高于上述碳/氮比最適區(qū)間 (5～10) ，其原因可能是由于芽胞桿菌發(fā)酵的最適碳/氮比還受其他因素影響。不同碳源與氮源組合的最適碳/氮比通常不同[31]，另外，不同菌種對碳/氮比的偏好也不同。相較于芽孢桿菌，假單胞菌的碳/氮比最適區(qū)間為7～14；酵母菌在碳/氮比為4 時菌體生長旺盛，而在碳/氮比為3 時，可代謝產(chǎn)生較多的谷氨酸[31]。Jin 等[15]發(fā)現(xiàn)，用菜籽粕代替蛋白胨作為氮源，在相同碳源情況下可使枯草芽孢桿菌 3-10 菌株的發(fā)酵水平提高20%，并使脂肽類抗生素伊枯草菌素 (iturins)的產(chǎn)量提高了8 倍。除此之外，碳/氮比對芽孢產(chǎn)量的影響也會隨氧傳遞系數(shù)的增大而逐漸降低。培養(yǎng)基中固體含量較多或質(zhì)地較粘稠都會導(dǎo)致氧傳遞系數(shù)降低，通氣性變差，此時就需要較高的碳/氮比以維持細(xì)菌旺盛的生長[32]。

培養(yǎng)基中的礦物質(zhì)元素雖然不參與細(xì)胞物質(zhì)的組成，但卻是很多酶的輔助因子。鉀離子與細(xì)胞滲透壓和透性相關(guān)，在培養(yǎng)基中可起到一定的緩沖劑作用并維持pH 值穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，K2HPO4?3H2O 濃度與HMB19198 菌株的芽孢濃度呈正相關(guān)，且9.2 g/L 的K2HPO4?3H2O 最適合HMB19198 菌株芽孢的形成。不同菌株對鉀離子濃度的需求可能不同。林陳強(qiáng)等[33]的研究表明，培養(yǎng)基中添加適量的鉀離子能促進(jìn)地衣芽孢桿菌CHB6 菌株的生長和芽孢形成，優(yōu)化后的培養(yǎng)基中芽孢濃度可達(dá)到4.8 × 109個/mL，芽孢形成率為90.6%。張麗霞[34]通過分析K、Mg、Mn、Fe、Zn、Cu、Mo 及Ca 等礦物質(zhì)養(yǎng)料對芽孢桿菌生長的影響，確定了K 對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液芽孢濃度影響最大，進(jìn)一步明確了K2HPO4是最佳的K供體，在K 質(zhì)量濃度為0.7 g/L 時，發(fā)酵液中芽孢濃度最高，較優(yōu)化前提高了29%。K2HPO4在提供K 的同時還可以提供P 元素，P 是核酸和蛋白質(zhì)的必要成分，也是細(xì)胞膜的重要組分[21]，同時P 還是微生物平衡生長的限制因素。

泛革素是枯草芽孢桿菌及其近源種產(chǎn)生的一種脂肽類抗生素，在抑制病原菌生長和防治作物病害中發(fā)揮著重要作用[35-36]。本團(tuán)隊(duì)前期研究[13]證明，泛革素是HMB19198 菌株產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)，在抑制番茄灰霉病菌生長和防治番茄灰霉病中具有重要作用。因此，提高發(fā)酵液中泛革素的含量能提高HMB19198 菌株的防病效果。Yassen 等[7]的研究表明，發(fā)酵液中泛革素含量受培養(yǎng)基中碳源和氮源影響較大。Islam 等[6]比較了枯草芽孢桿菌C9 菌株在不同碳、氮源組合下的泛革素產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)以甘露醇為碳源、以黃豆粉為氮源能提高泛革素的產(chǎn)量。因此，通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化提高泛革素產(chǎn)量是一種有效途徑。本研究篩選得到了利于HMB19198 菌株芽孢形成的優(yōu)化培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化培養(yǎng)基中，HMB19198 菌株的泛革素產(chǎn)量提高了39.4%。芽孢桿菌中脂肽類抗生素的產(chǎn)生一般發(fā)生在對數(shù)生長后期至芽孢形成前期，一些基因同時調(diào)控著芽孢的形成和脂肽類抗生素的產(chǎn)生，因此，提高芽孢的形成率往往伴隨著脂肽類抗生素產(chǎn)量的提高[37]。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基不僅提高了HMB19198 菌株發(fā)酵液中芽孢濃度，同時還提高了泛革素的產(chǎn)量。