一株百合內(nèi)生細菌Burkholderia sp. FJb-2的分離鑒定及其體外抑菌促生效應

孫雨晨，易欣欣，王麗偉，程兆倫，張秀海*，高俊蓮*

（1.北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京 102206；2.北京市農(nóng)林科學院，北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心，北京 100097；3.蒙陰縣住房和城鄉(xiāng)建設局，山東 蒙陰 276200）

百合是單子葉植物綱百合科（Liliaceac）百合屬（Lilium）多年生草本植物，是目前著名的觀賞花卉之一［1］。百合具有很高的觀賞價值，同時還具有較高的食用和藥用價值［2］。然而，百合是一種較易感病的花卉，隨著栽培面積的不斷擴大，病害發(fā)生已日趨嚴重，已成為制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的主要因素之一［3-5］。百合主要病害包括百合枯萎病，也稱百合根腐病、莖腐病，是百合生產(chǎn)中嚴重的土傳病害［6］；百合灰霉病，又稱葉枯病，主要危害百合的葉、莖和花，導致葉片枯死、花器褐腐、莖稈發(fā)黑和鱗莖停止生長，嚴重影響切花及種球的產(chǎn)量和質(zhì)量［7］；百合葉尖干枯病，是常發(fā)生在百合生長初期的葉部主要病害，主要危害葉尖，葉尖發(fā)病后變?yōu)楹诤稚珘乃阑蚋煽荩⒉粩嘞蛉~基部擴展［8］。目前百合病害的防治主要采用化學防治，但是長期使用化學農(nóng)藥，不僅會造成環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡，而且農(nóng)藥殘留使食用和藥用百合品質(zhì)降低，存在很大食品安全的隱患；同時會使病原菌產(chǎn)生抗藥性，影響防治效果。生物防治作為一種新的防治策略，對環(huán)境友好、無抗藥性、防效持久，擁有良好的應用前景。此外，與其他農(nóng)作物一樣，百合生產(chǎn)中同樣存在著化肥、農(nóng)藥等農(nóng)用化學投入品過量使用而引起的一系列環(huán)境污染問題。如何在病害嚴重、減肥、減藥及干旱等不良氣候條件下提高百合產(chǎn)量，已成為百合產(chǎn)業(yè)面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指在健康植物體內(nèi)寄生，在各種組織和器官內(nèi)部或細胞間隙中度過全部或近乎全部生活周期，而不致使寄主植物表現(xiàn)任何病害癥狀的一類微生物，主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌3類［9］。內(nèi)生細菌被認為是根際細菌的一個分支，通常也稱為植物根際促生細菌（PGPR）［10］。實際上，內(nèi)生細菌具有植物根際細菌的促進植物生長所有重要特性，并且內(nèi)生細菌對宿主植物提供的有益作用通常大于根際細菌［11］。尤其當植物受到逆境脅迫挑戰(zhàn)時，這種有益作用可能會更大［12-13］。目前己從大豆、玉米、棉花、小麥、水稻、馬鈴薯等多種作物中分離獲得具有促生或者生防作用的內(nèi)生細菌［14-15］，但是關于百合內(nèi)生細菌的研究報道較少，本課題組最近兩年陸續(xù)報道了從百合鱗莖球中分離獲得了幾株具有拮抗病原菌和促進百合生長的芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的內(nèi)生細菌［16-17］。紅芯百合（Fangio），為亞洲百合與鐵炮百合的雜交品種，抗病性較強，切花商品價值較高［18］。本研究以百合抗病品種—紅芯百合植株樣品為研究對象，分離篩選兼具拮抗與促生特性的百合內(nèi)生細菌，為研發(fā)百合環(huán)境友好型抗病促生長微生物菌劑提供優(yōu)良菌種資源和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試植物

供試紅芯百合（Fangio）為荷蘭進口，種植于北京市農(nóng)林科學院生物技術研究中心房山百合資源圃。

1.1.2 百合病原真菌

百合灰霉病菌—灰葡萄孢（Botrytis cinerea）ACCC 36423和百合葉尖干枯病菌—葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）ACCC 37263均購自中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；百合枯萎病菌—尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）F01 139由中國農(nóng)業(yè)大學植物病理學系羅來鑫老師惠贈。

1.1.3 培養(yǎng)基

本實驗使用的培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基［19］、PDA培養(yǎng)基［20］、DF培養(yǎng)基［21］、ADF培養(yǎng)基［將1-氨基環(huán)內(nèi)烷-1-羧酸（ACC）溶于超純水，過濾滅菌，加到不含（NH4）2SO4的滅菌DF培養(yǎng)基中，終濃度為3.0mmol/L］、無機磷培養(yǎng)基［22］、CAS培養(yǎng)基［23］。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離

采用的組織塊方法［24］分離百合內(nèi)生細菌：將采集到的健康百合植株樣品，用自來水沖洗掉表面殘留的泥土等雜質(zhì)。將植株根、莖、葉分開，并將莖部剪成10 cm左右的小段，然后對分離部位進行表面消毒：用75%乙醇浸泡分離部位10 min，之后用2.5% NaClO溶液浸泡3 min，然后再用無菌水沖洗3遍，用滅菌濾紙吸干百合植株樣品的水分，用滅菌的剪刀將其剪切成5 mm左右大小的片段，置于LB平板培養(yǎng)基上，每個平板上夾取8～10段，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察LB平板內(nèi)生菌的生長情況，待植物組織材料切口處長出菌落，及時轉(zhuǎn)接于新鮮LB平板進行純化，純化后的菌種加入30%甘油，于-80℃超低溫冰箱保藏。

1.2.2 拮抗百合病原真菌活性的測定

采用平板對峙法，篩選具有拮抗百合病原真菌活性的內(nèi)生細菌。參考Khan等［17］的實驗方法，將植物病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃下，培養(yǎng)一周后，采用滅菌的1 mL微量移液器藍色槍頭尾部圓孔取直徑7 mm的含有真菌的瓊脂圓盤，轉(zhuǎn)移到新鮮PDA培養(yǎng)基平板的中心。將細菌菌株活化于LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，28℃，培養(yǎng)2 d。然后將PDA平板平均分成4個區(qū)域，在每個區(qū)域內(nèi)距中心約2.5 cm處接種約10 μL已經(jīng)在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了2 d的細菌菌液，將平板在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d。以沒有接種細菌的真菌平板作為對照，定期檢查平板的病原真菌和細菌菌株的生長情況，待對照PDA平板上的真菌菌絲體到達平板的邊緣后，并測量對照真菌與抑制真菌生長的直徑。使用以下公式計算病原真菌的生長抑制率［17］：生長抑制率（%）=（C-T）/C×100，其中C是對照組PDA板上的真菌菌絲體生長區(qū)域的半徑（mm），T是接種有細菌（實驗組）的真菌菌絲體生長區(qū)域的半徑（mm）。每個處理重復3次。

1.2.3 植物促生長特性分析

（1）ACC脫氨酶陽性菌株篩選及活性測定。陽性菌株篩選：將菌株FJb-2接入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h進行活化后，吸取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，離心（8000 r/min，4℃）10min收集菌體。棄上清，用1 mL無菌水重懸菌體。吸取100 μL菌懸液于2 mL ADF培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果，若培養(yǎng)液變渾濁，則該菌株可利用ACC為氮源而生長，初步表明其有產(chǎn)ACC脫氨酶活性。

ACC脫氨酶活性測定：參考Penrose等［21］和陳堅等［25］的實驗方法。

（2）菌株產(chǎn)生長素能力測定：采用Salkowski等［26］的比色法測定內(nèi)生細菌產(chǎn)生長素（IAA）能力，將菌株FJb-2接入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h進行活化，轉(zhuǎn)接于含3 mmol色氨酸的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。取1 mL菌懸液4000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液與 Salkowski比色液（50 mL 35%HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）等體積混合，陰性對照是LB培養(yǎng)基和Salkowski比色液等體積混合，陽性對照為100 mg/L的IAA溶液和Salkowski比色液等體積混合，避光靜置30 min，觀察顏色變化，顏色變紅者表示產(chǎn)生了IAA。對顏色變紅的陽性菌株，進一步測定其OD 530 nm值。陰性對照是單獨的LB培養(yǎng)基和Salkowski比色液混合。用分析純IAA標準品繪制標準曲線，IAA濃度依次為0、10、20、40、60、80、100 mg/L。以吸光度值為縱坐標，IAA濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算菌液中IAA的濃度。實驗設置3次重復。

（3）菌株溶磷能力的測定：用LB液體培養(yǎng)基活化FJb-2菌株，培養(yǎng)24 h后，將其點接種于無機磷培養(yǎng)基上，接種量為10 μL，每個處理重復3次，28℃培養(yǎng)7 d，觀察解磷圈，出現(xiàn)透明圈，表示該菌株將難溶的磷轉(zhuǎn)化為可溶性憐，記為有解磷活性，測量解磷圈直徑（D）與菌落直徑（d），并計算D/d值，初步判定其解磷能力的大小。

（4）菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定：在CAS培養(yǎng)基上，對菌株FJb-2進行產(chǎn)鐵載體能力的測定。將細菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，28℃，培養(yǎng)2 d。取10 μL的細菌培養(yǎng)液點接在CAS定性藍色檢測平板，每個菌設3個重復，28℃下培養(yǎng)5 d。在CAS檢測平板上，分泌鐵載體的細菌菌落周圍會出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈。記錄平板上橙色暈圈的有無，并測定單菌落橙色鐵載體暈圈直徑和菌落直徑的比值。

1.2.4 內(nèi)生細菌的鑒定

（1）形態(tài)學觀察：將菌株FJb-2活化接種于LB培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)1 d，挑取菌落置于1mL無菌水中重懸，制備成菌懸液。然后以此稀釋獲得不同的稀釋度，取10-3、10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布在LB培養(yǎng)基上，倒置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察其菌落形態(tài)特征。挑選LB培養(yǎng)基上的菌落，使用BIOMéRIEUXTM革蘭染色液試劑盒進行革蘭氏染色，用普通光學顯微鏡觀察染色結(jié)果。進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)特征，再使用掃描電鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)。

（2）分子生物學鑒定：采用天根細菌基因組DNA試劑盒提取FJb-2菌株的基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書標準流程進行。以基因組DNA為模板，用細菌的16S rRNA通用引物對細菌基因組DNA進行PCR擴增［27］。引物分別為：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）采 用25 μL體系進行擴增，擴增體系為：Premix TaqTM12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，模板1μL。PCR擴增程序為：94℃ 3 min，94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環(huán)，72℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的條帶（1500 bp左右），擴增樣品送至北京博邁德測序公司進行測序，將得到的16S rRNA 序列在EzBioCloud數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.ezbiocloud.net/）［28］中 的 相應基因序列進行同源性比較，利用MEGA 7.0［29］進行Clustal W多重序列比對，并采用Kimura 2-parameter模式和Neighbor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并將該序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲取基因登錄號。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合內(nèi)生菌分離及其對百合病原真菌的拮抗特性

本研究從百合Fangio植株體內(nèi)分離獲得16株內(nèi)生細菌，將16株內(nèi)生細菌純化培養(yǎng)，對其進行產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶活性、產(chǎn)生長素（IAA）、溶磷、產(chǎn)鐵載體等多種植物促生特性初篩，發(fā)現(xiàn)菌株FJb-2同時具有以上4種功能特性，故進一步對該菌株的抑菌活性進行了測定。菌株FJb-2分別與百合病原菌Botrytis cinerea（ACCC 36423）、Botryosphaeria dothidea（ACCC 37263）和Fusarium oxysporum（F01139）進行對峙培養(yǎng)，結(jié)果表明：菌株FJb-2對測試的百合病原真菌菌絲生長具有較好的生長抑制作用（圖1）。該菌株對測試百合病原真菌的生長抑制率為（60.00%±3.14%）～（81.88%±1.25%）。其中對百合灰霉病菌—灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）ACCC 36423的抑制作用最強，抑制率高達81.88%±1.25%；對百合葉尖干枯病菌—葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）ACCC37263和百合枯萎病菌—尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）F01139的抑菌率分別為72.78%±2.8%和60.00%±3.14%。

圖1 菌株FJb-2對百合病原真菌的抑制作用

2.2 菌株FJb-2植物促生長特性的分析

為了評價菌株FJb-2促進植物生長的潛力，分別進行該菌株產(chǎn)生ACC脫氨酶、產(chǎn)生IAA、產(chǎn)生鐵載體、溶磷等促生長特性的定性或定量分析，結(jié)果表明，內(nèi)生細菌菌株FJb-2在所有測定中均顯示陽性結(jié)果。

2.2.1 菌株FJb-2產(chǎn)ACC脫氨酶活性的測定結(jié)果

菌株FJb-2在以ACC為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長良好（圖2A），可以初步判定菌株FJb-2有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力。對菌株FJb-2的ACC酶活性定量測定后，發(fā)現(xiàn)該菌株所產(chǎn)的ACC脫氨酶的活性為（35.28±0.05）μmol α-酮丁酸/（mg·h）。當細菌菌株ACC脫氨酶活性高于20 nmol α-丁酮酸/（mg·h）蛋白時，即可表現(xiàn)出明顯的植物促生長作用［21］。該菌株產(chǎn)ACC脫氨酶能力較強，預示其具有較強的植物促生長潛力。

圖2 菌株FJb-2植物促生長的特性定性測定

2.2.2 菌株FJb-2產(chǎn)IAA的能力

通過定性和定量測定均檢測到菌株FJb-2具有一定產(chǎn)IAA的能力。在定性測定的實驗中，菌株FJb-2培養(yǎng)液的顏色位于陰性對照（無色）和陽性對照（粉紅色）之間（圖2B），這表明菌株FJb-2具有產(chǎn)IAA的能力；在定性測定的基礎上，通過比色法進行定量測定，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的IAA濃度可以達到（11.22±0.27）mg/L。

2.2.3 菌株FJb-2溶磷能力的測定結(jié)果

具有溶磷能力的菌株具體表現(xiàn)為在菌落周圍形成透明的溶磷圈。菌株FJb-2在無機磷培養(yǎng)基的檢測板上，出現(xiàn)明顯的溶磷透明圈（圖2C）。通過溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值確定溶磷能力大小，比值越大溶磷能力越強，D/d值在1.0～2.0屬于中等溶磷能力菌株，D/d值≥2.0屬于強溶磷能力菌株［30］。菌株FJb-2的D/d值為2.2，這說明菌株FJb-2具有強溶磷能力。

2.2.4 菌株FJb-2產(chǎn)鐵載體能力的測定結(jié)果

采用CAS藍色定性檢測固體培養(yǎng)基對菌株進行產(chǎn)鐵載體能力的定性測定，發(fā)現(xiàn)菌株FJb-2能在CAS藍色定性檢測固體培養(yǎng)基上形成橙色暈圈（圖2D）（嗜鐵圈），其可溶性指數(shù)為1.92，表明該菌株具有非常明顯的產(chǎn)鐵載體能力。

2.3 菌株FJb-2的初步鑒定

2.3.1 FJb-2菌株形態(tài)特征觀察

菌株FJb-2接種于LB平板上培養(yǎng)3 d后，菌落呈圓形，邊緣整齊，呈污白色、有光澤，菌落直徑約為1～2 mm（圖3A）。通過光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈短桿狀，革蘭氏染色呈陰性（圖3B）；采用掃描電子顯微鏡，觀察細胞的形態(tài)，并測量細胞的大小，菌落FJb-2的細胞形態(tài)為桿狀，菌體大小為（0.29～0.57）μm×（0.71～2.41）μm（圖3C）。

圖3 菌株FJb-2的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和菌體形態(tài)圖

2.3.2 FJb-2菌株的16S rRNA序列分析結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

FJb-2菌株的16S rRNA基因序列的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測，在1500bp附近有目的條帶，送交至測序公司進行測序。將FJb-2測序所得的16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MW541881。

通過鄰接法（NJ）對菌株 FJb-2的16S rRNA基因序列，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫找到同源性較高的相關序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建進化樹（圖4）。分析結(jié)果表明，菌株FJb-2與菌株Burkholderia gladioli（NBRC 13700）的親緣關系最近，兩者序列相似性達到99.63%。通過構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（圖4）也可以看出，菌株FJb-2在進化樹上與菌株Burkholderia gladioli聚于同一系統(tǒng)發(fā)育分支，表明該菌株屬于Burkholderia屬。

圖4 基于16S rRNA基因序列建立的菌株FJb-2的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

百合生產(chǎn)及儲運過程中病害頻發(fā)已成為制約百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，生物防治對環(huán)境友好，且無農(nóng)藥殘留，也無抗藥性，擁有良好的應用前景。植物內(nèi)生菌是一類天然的生防菌資源，文獻報道植物內(nèi)生菌在多種植物病害防治中具有明顯的效果。本研究中從百合植株的莖部分離獲得1株內(nèi)生細菌Burkholderiasp. FJb-2，該菌株同時對測試的幾種主要百合病害病原菌，包括百合枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、百合灰霉病菌（Botrytis cinerea）和百合葉尖干枯病菌（Botryosphaeria dothidea）均有較高的拮抗活性，對病原真菌的生長抑制率范圍為60%～81%。因此，該菌株在百合病害生防菌劑研發(fā)中具有較好的應用潛力，可以成為優(yōu)良候選菌株。

大多數(shù)植物內(nèi)生菌與根際細菌等植物相關細菌都具有直接或間接促進植物生長和發(fā)育的功能，其促進植物生長的機制有多種，比如通過溶磷、固氮作用為植物提供養(yǎng)分，產(chǎn)生植物激素，影響植物對水和礦物質(zhì)的吸收，促進植物根系發(fā)育而直接促進植物生長；或者間接地通過減少各種病原體對植物生長發(fā)育的抑制作用而促進植物生長等［31］。植物內(nèi)生菌與根際細菌的研究與應用為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)減少化肥與農(nóng)藥的使用提供了一條有效途徑，對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

具有溶磷特性的菌株FJb-2有為植物提供磷素的潛力，同時菌株FJb-2有一定產(chǎn)生IAA的能力，暗示著其具有促進植物生長的潛力。鐵載體是由細菌、放線菌、真菌、某些藻類和植物在低鐵脅迫下合成的低分子量鐵離子特異性螯合劑，鐵載體的主要作用是促進鐵元素的吸收［32］。據(jù)報道，產(chǎn)鐵載體植物根際促生細菌在促進植物生長發(fā)育、增加作物產(chǎn)量、提高植物的抗逆性以及抑制根際有害菌群等方面也發(fā)揮著重要的作用［32-33］。菌株FJb-2具有較強的產(chǎn)生鐵載體的能力，預示著其在促植物生長及活化鐵元素方面具有巨大潛力。多種根際細菌合成的ACC脫氨酶減少了植物中有害乙烯的含量，并平衡了脫落酸ABA水平［34］。ACC脫氨酶將ACC降解為α-酮丁酸和氨，為植物提供氮和能量，因此降低植物體內(nèi)乙烯含量水平［35］。已經(jīng)證明產(chǎn)ACC脫氨酶的植物根際促生細菌可以賦予植物對干旱脅迫、鹽分脅迫、洪澇等許多環(huán)境脅迫的耐受性［19］。干旱也是嚴重制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一［36］，菌株FJb-2具有較高的ACC脫 氨 酶 活 性［（35.28±0.05）μmol α-酮 丁 酸/（mg·h）］，可能在提高百合抗旱性能方面有很好的應用潛力。

伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）是一類重要的生防菌，其在農(nóng)業(yè)領域中具有生物防治及促進植物生長等多種生物學功能［37-38］。本研究通過16S rRNA基因序列分析將菌株FJb-2初步鑒定為伯克霍爾德氏菌屬細菌。據(jù)我們所知，這是首次報道從百合體內(nèi)分離獲得伯克霍爾德氏菌屬內(nèi)生細菌，該菌株不但具有拮抗多種百合病原真菌的能力，而且還具有多種植物促生特性，且具有較大的百合微生物肥料和生物農(nóng)藥開發(fā)應用潛力。

本研究從紅芯百合植株莖部中分離到1株具有明顯抑制多種百合病原真菌活性的細菌FJb-2。通過百合病原真菌拮抗實驗觀察到菌株FJb-2對百合灰霉病菌—灰葡萄孢菌、百合葉尖干枯病菌—葡萄座腔菌和百合枯萎病菌—尖孢鐮刀菌均有較高的拮抗活性，對病原真菌的生長抑制率范圍為60%～81%。這說明菌株FJb-2是一株很有潛力的植物促生內(nèi)生菌，同時表明該菌株可能通過幾種機制共同起作用來發(fā)揮其促生作用。而該菌株的生防、促生、抗旱等潛力有待于進一步的田間試驗證實。