五碳雙縮醛鑒別試驗(yàn)方法的改進(jìn)

周曉晴，呂小麗，趙淑娟，張文中，郭平，匡佩琳

江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（南昌 330001）

五碳雙縮醛（又名戊二醛），英文名glutaraldehyde，化學(xué)式是C5H8O2，為無色或淺黃色的透明液體，有特殊刺激氣味，可與水、乙醇以任何比例混合，溶液呈弱酸性。其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。五碳雙縮醛被廣泛應(yīng)用于殺菌消毒劑、固定劑、鞣革劑、木材防腐劑、藥物和高分子合成原料等[1-2]，在食品行業(yè)可作為食品工業(yè)用加工助劑，其在GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中被列作為交聯(lián)劑，用于膠原蛋白腸衣的加工工藝[3]。

圖1 五碳雙縮醛結(jié)構(gòu)式

國(guó)內(nèi)外五碳雙縮醛的工業(yè)化合成主要路線是以丙烯醛和乙烯基醚加成得2-乙氧基-3,4-二氫吡喃，水解得到戊二醛的吡喃法[4-5]。五碳雙縮醛作為一種食品添加劑，對(duì)五碳雙縮醛進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，對(duì)規(guī)范國(guó)內(nèi)生產(chǎn)和銷售具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

國(guó)家衛(wèi)生健康委（原衛(wèi)生部）食品添加劑指定標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號(hào)）中五碳雙縮醛鑒別試驗(yàn)方法為：取20 mL 2,4-二硝基苯肼試劑，加入0.4 mL樣品，搖勻，靜置5 min，收集沉淀，用乙醇徹底洗滌，用20 mL熱二氯乙烯溶解沉淀，過濾。濾液經(jīng)冰浴冷卻至產(chǎn)生結(jié)晶，過濾后收集沉淀，用30 mL丙酮回流再溶解，過濾，濾液經(jīng)冰浴冷卻重結(jié)晶，過濾，收集沉淀，所得的2,4-二硝基苯腙測(cè)定其熔點(diǎn)為185～195 ℃[6]。《美國(guó)食品化學(xué)品法典》（第十一版）（FCC 11）中五碳雙縮醛鑒別試驗(yàn)和美國(guó)藥典41（USP 41）中濃戊二醛溶液鑒別試驗(yàn)均為熔點(diǎn)測(cè)定[7-8]。其試驗(yàn)原理為五碳雙縮醛與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝基苯腙沉淀，且2,4-二硝基苯腙具有特定的熔點(diǎn)。

在檢驗(yàn)方法研究工作中發(fā)現(xiàn)國(guó)家衛(wèi)生健康委（原衛(wèi)生部）指定標(biāo)準(zhǔn)存在以下2個(gè)問題：一是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法采用二氯乙烯進(jìn)行溶解上一步生產(chǎn)的沉淀，發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)溶解時(shí)間，提高溶解溫度，二氯乙烯都不能溶解沉淀，更不能再下一步生產(chǎn)結(jié)晶；二是標(biāo)準(zhǔn)方法中重結(jié)晶關(guān)鍵點(diǎn)細(xì)節(jié)描述不詳細(xì)，僅說明用30 mL丙酮回流再溶解，過濾，濾液經(jīng)冰浴冷卻重結(jié)晶，導(dǎo)致試驗(yàn)重現(xiàn)性差。為此，對(duì)五碳雙縮醛鑒別試驗(yàn)方法進(jìn)行分析研究，并對(duì)該鑒別方法提出改進(jìn)意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2,4-二硝基苯肼、硫酸、無水乙醇（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二氯乙烷（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；丙酮（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；定性濾紙[通用電氣生物科技（杭州）有限公司]。

1.2 儀器和設(shè)備

QUINTIX124-1CN電子天平（感量0.0001 g，德國(guó)賽多利斯公司）；HH-6水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；Vortex Wizard渦旋混合器（意大利VELP公司）；WRR-Y熔點(diǎn)儀（上海物理光學(xué)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 二氯乙烷重結(jié)晶步驟確定

經(jīng)過重新比對(duì)《美國(guó)食品化學(xué)品法典》（第十一版）（FCC 11）原文發(fā)現(xiàn)《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號(hào)）方法的溶解試劑可能存在錯(cuò)誤，實(shí)際應(yīng)為二氯乙烷。

1.3.1.1 溶解溫度確定

《美國(guó)食品化學(xué)品法典》（第十一版）（FCC 11）原文中只寫了熱二氯乙烷，而沒有標(biāo)注具體溫度。根據(jù)二氯乙烷沸點(diǎn)83.5 ℃，同時(shí)根據(jù)重結(jié)晶的原理，在熱的溶劑中溶解，冰浴時(shí)析出晶體的原理，溫度越高，溶解性越好，所以為更多地溶解乙醇洗滌后的沉淀，選擇接近沸點(diǎn)的溫度80 ℃。

1.3.1.2 溶解方式確定

為保證二氯乙烷和沉淀一直保持在熱的狀態(tài)，溶解過程一直把離心管置于80 ℃水浴中，同時(shí)為增大溶液與固體的接觸頻率，增大溶解度，采用邊渦旋邊溶解的方式（每隔5 min渦旋1次）。

1.3.2 丙酮回流重結(jié)晶步驟確定

1.3.2.1 回流溫度確定

《美國(guó)食品化學(xué)品法典》（第十一版）（FCC 11）原文和《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號(hào)）方法中只描述“丙酮回流”，對(duì)于回流溫度沒有描述。根據(jù)丙酮的沸點(diǎn)56.5 ℃，選擇丙酮回流溫度60 ℃。

1.3.2.2 回流時(shí)間確定

隨著加入的二氯乙烷濾液結(jié)晶量的增加，丙酮回流后形成的結(jié)晶量也增加，但當(dāng)加入量達(dá)0.15 g以上時(shí)增長(zhǎng)速度減慢。加入二氯乙烷重結(jié)晶沉淀0.15 g左右時(shí)，回流2 h，沉淀幾乎完全溶解，所以確定回流時(shí)間為2 h。

1.3.2.3 丙酮回流時(shí)圓底燒瓶?jī)?nèi)外液面高度確定

在丙酮回流試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)回流時(shí)如果圓底燒瓶?jī)?nèi)液面的高度低于水浴鍋中水（外液面）的高度，會(huì)造成圓底燒瓶的粘壁現(xiàn)象，直接導(dǎo)致后續(xù)無法形成結(jié)晶。內(nèi)液面高于外液面則不會(huì)出現(xiàn)粘壁現(xiàn)象，后續(xù)可以形成結(jié)晶。

2 結(jié)果與分析

建議將《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號(hào)）鑒別試驗(yàn)方法修訂為：取0.4 mL試樣，加入到20 mL 2,4-二硝基苯肼溶液中，搖勻，靜置5 min。過濾，用200 mL無水乙醇徹底洗滌，待乙醇自然揮干后收集沉淀于50 mL離心管中，加入20 mL 80 ℃二氯乙烷溶解沉淀，該溶解過程一直保持在80 ℃水浴中，并每隔10 min渦旋1次，溶解1 h后，趁熱過濾。濾液經(jīng)冰浴冷卻至產(chǎn)生結(jié)晶，過濾后收集沉淀于100 mL圓底燒瓶中。在圓底燒瓶中加入30 mL丙酮，于60 ℃水浴回流2 h再次溶解沉淀，回流時(shí)要保證水浴鍋的液面低于圓底燒瓶中丙酮的液面，同時(shí)每隔一段時(shí)間輕微搖晃圓底燒瓶，避免粘壁?；亓骱?，過濾，收集濾液于50 mL比色管中，將比色管置于冰浴中冷卻重結(jié)晶，過濾，收集沉淀，測(cè)定所得結(jié)晶的熔點(diǎn)。對(duì)優(yōu)化后的鑒別試驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，主要驗(yàn)證其精密度和重復(fù)性。

2.1 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取0.4 mL測(cè)定用樣品，按改進(jìn)后的方法連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.42%，說明試驗(yàn)方法的精密度較高。

表1 精密度的測(cè)定結(jié)果

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取6份五碳雙縮醛樣品，按改進(jìn)后的鑒別試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 重復(fù)性的測(cè)定結(jié)果

從測(cè)定結(jié)果來看，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%，其重復(fù)性符合試驗(yàn)要求。

2.3 五碳雙縮醛鑒別的應(yīng)用

選取6家公司13個(gè)市售五碳雙縮醛樣品，采用改進(jìn)后的方法進(jìn)行鑒別分析，鑒別試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 市售五碳雙縮醛鑒別結(jié)果

從樣品測(cè)定結(jié)果來看，使用優(yōu)化后的方法步驟，不會(huì)出現(xiàn)難結(jié)晶的情況，試驗(yàn)重現(xiàn)性好，可有效鑒別五碳雙縮醛。

3 結(jié)論

試驗(yàn)方法對(duì)國(guó)家衛(wèi)生健康委（原衛(wèi)生部）食品添加劑指定標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑 五碳雙縮醛（又名戊二醛）》（2012年第6號(hào)）中五碳雙縮醛的鑒別試驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。替換使用二氯乙烷進(jìn)行重結(jié)晶步驟，確定二氯乙烷重結(jié)晶步驟中的溶解溫度80 ℃，并采用邊渦旋邊溶解的方式溶解沉淀。優(yōu)化丙酮回流重結(jié)晶步驟，確定丙酮回流溫度60 ℃，回流時(shí)間2 h，回流時(shí)圓底燒瓶?jī)?nèi)液面應(yīng)高于外液面。方法學(xué)試驗(yàn)和樣品測(cè)定結(jié)果表明，采用優(yōu)化后的鑒別試驗(yàn)步驟易于操作進(jìn)行，提高了試驗(yàn)的精密度及重現(xiàn)性，可用于日常五碳雙縮醛樣品中五碳雙縮醛的鑒別測(cè)定。