酶法提取木槿花多糖工藝

劉涵，李咪，孫盼盼，王靜，曹際云

德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（德州 253023）

木槿（Hibiscus SyriacusL.）屬錦葵科木槿屬落葉灌木，又名木錦、籬障花。木槿花的食用歷史悠久，在我國(guó)廣東、福建等地多作為蔬菜原料烹飪成菜肴。在福建省汀州市，人們用木槿花和蔥切碎，與面粉混合后制成稀面，在煎鍋中油炸后面餅香脆可口，被稱(chēng)為“面花”和“花炸”。木槿花的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，不僅有蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、多糖等成分，還有人體所需的微量元素，如鈣、鎂、鐵、鋅、鉀等[1]。木槿花的功效在一些藥物學(xué)著作中有所記載，如具有清熱、利濕、涼血等[2]功能，能夠幫助預(yù)防治療高血壓和心血管疾病，還可以調(diào)節(jié)人體免疫功能，有抗炎、抗癌癥、抗糖尿病、抗氧化、抗高血壓等[2]作用。

多糖（polysaccharide）在自然界中分布廣泛，是維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一[3]。試驗(yàn)已證明多糖具有抗腫瘤、抗氧化劑、抗病毒、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等[4]作用，對(duì)人體副作用小。有研究開(kāi)發(fā)一些多糖類(lèi)的功能性食品以促進(jìn)身體健康，是食品行業(yè)最具前景的領(lǐng)域之一。

國(guó)內(nèi)外對(duì)木槿花提取物的研究主要集中在原花青素、總黃酮和多酚類(lèi)物質(zhì)上。呂惠卿等[5]通過(guò)響應(yīng)面法建立回歸方程模型，改進(jìn)木槿花中總黃酮的最佳提取工藝。張雪嬌等[6]利用響應(yīng)面法改進(jìn)木槿花多酚提取工藝條件。黃采姣等[7]研究5種類(lèi)型的木槿花，通過(guò)試驗(yàn)證明木槿花的總酚和總黃酮含量會(huì)影響木槿花的抗氧化性。張婕等[8]通過(guò)正交試驗(yàn)研究木槿花的原花青素提取工藝，優(yōu)化木槿花花青素的最佳提取工藝。對(duì)木槿花多糖的提取工藝研究很少，只有利用超聲波來(lái)提取木槿花多糖，而利用酶法提取木槿花多糖還鮮見(jiàn)諸報(bào)道。

提取植物多糖的工藝有微波提取[9]、超聲波提取[10]、熱水浸提[11]、堿浸提[12]和酶提取[13]等。通過(guò)查閱參考文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)超聲波和微波對(duì)多糖的組成和活性有較大影響、堿浸提有嚴(yán)格的工藝要求，如果超出工藝要求的pH范圍，則可能會(huì)導(dǎo)致糖苷鍵在多糖中斷裂。因此，試驗(yàn)采用酶法提取木槿花多糖。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

石油醚（沸程30～60 ℃）；無(wú)水乙醇、氯仿-正丁醇（V∶V=4∶1）、苯酚（均為分析純）；纖維素酶（酶活3 U/mg）；濃硫酸；葡萄糖；白色重瓣木槿花（江蘇省宿遷市沐陽(yáng)縣長(zhǎng)景園林）。

普通的索氏提取器（冷凝管、抽提管、平底燒瓶）；濾紙筒；HHS21-8-8水浴鍋；PL203電子天平；TDZ5-WS低速架自動(dòng)平衡離心機(jī)；UV-5500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；恒溫振蕩箱；等。

1.2 多糖得率的計(jì)算

試驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，這種方法具有快速方便、顯示靈敏的優(yōu)點(diǎn)。多糖得率按式（1）計(jì)算。

式中：C為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為多糖溶液稀釋后總體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取一定質(zhì)量的木槿花粉末，加入石油醚，在66 ℃回流提取2 h脫脂，抽濾，在55 ℃烘箱中烘干，在80%乙醇中浸泡12 h除去一些物質(zhì)，曬干后備用，得到預(yù)處理后的木槿花粉末。稱(chēng)取1 g預(yù)處理后的木槿花粉末于錐形瓶中，在一定酶量、反應(yīng)時(shí)間、料液比、溫度下反應(yīng)，在100 ℃下滅酶15 min。冷卻后進(jìn)行真空抽濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)65 ℃減壓。液體冷卻后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，在此期間用玻璃棒不斷攪拌，在4 ℃冰箱中放置12 h。在5000 r/min下離心20 min，棄去上清液留下沉淀，再用蒸餾水溶解，加入溶液體積1/4的氯仿-正丁醇溶液（4∶1，V∶V），搖晃15 min，在4000 r/min下離心15 min，棄去中間及下層的物質(zhì)，得到多糖提取液，定容到100 mL容量瓶后進(jìn)行稀釋10倍。加入苯酚和濃硫酸，反應(yīng)后測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。

1.3.1 酶用量對(duì)多糖得率的影響

分別稱(chēng)取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水，加入0.05%，0.10%，0.20%和0.30%纖維素酶，在50 ℃下反應(yīng)2 h，按1.3項(xiàng)下測(cè)定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶用量。

1.3.2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

分別稱(chēng)取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水和0.05%纖維素酶，在50 ℃下分別反應(yīng)60，90，120和150 min，按1.3項(xiàng)下測(cè)定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶解時(shí)間。

1.3.3 料液比對(duì)多得率的影響

分別稱(chēng)取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入0.05%纖維素酶，分別加入20，30，40和50 mL蒸餾水，在50 ℃下反應(yīng)2 h，按1.3項(xiàng)下測(cè)定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳料液比。

1.3.4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

分別稱(chēng)取4份1 g木槿花粉末置于瓶中，加入40 mL蒸餾水和0.05%纖維素酶，在40，50，60和70 ℃下分別反應(yīng)2 h，按1.3項(xiàng)下測(cè)定多糖得率，確定木槿花多糖提取最佳酶解溫度。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

通過(guò)分析單因素試驗(yàn)的結(jié)果，得出影響因素的最佳取值范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)處理，固定酶解溫度60 ℃，探討影響因素與多糖得率之間的關(guān)系，分別設(shè)置酶用量、酶解時(shí)間、料液比3個(gè)水平因素，以1，0和-1進(jìn)行編碼，優(yōu)化酶法提取木槿花多糖工藝。

表1 試驗(yàn)因素與水平取值

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖曲線

曲線以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到回歸線方程Y=9.299 5X+ 0.006 4（R2=0.999 8）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酶用量對(duì)多糖得率的影響

如圖2所示，曲線整體呈先上升后下降趨勢(shì)，酶用量0.05%～0.2%，可以發(fā)現(xiàn)木槿花多糖得率一直增長(zhǎng)，直至0.2%達(dá)到最大值，此時(shí)木槿花多糖得率為3.12%± 0.09%。繼續(xù)加大纖維素酶用量，曲線開(kāi)始下降，表明木槿花多糖得率開(kāi)始減少。原因可能是酶用量超過(guò)0.2%時(shí)，酶分子與全部底物結(jié)合，無(wú)剩余底物，此時(shí)會(huì)有剩余的酶，而這些酶會(huì)酶解多糖，導(dǎo)致多糖得率下降[23]。因此纖維素酶的最佳酶用量為0.2%。

圖2 酶用量對(duì)木槿花多糖得率的影響

2.3 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

如圖3所示，隨著酶解時(shí)間增加，木槿花多糖得率在酶解時(shí)間60～120 min之間變化幅度不明顯，在酶解時(shí)間120～150 min出現(xiàn)激增，并在酶解時(shí)間150 min時(shí)，木槿花多糖得率達(dá)到3.85%±0.2%，通過(guò)參考其他相關(guān)文獻(xiàn)猜測(cè)多糖得率在酶解時(shí)間180 min會(huì)出現(xiàn)下降，所以在響應(yīng)面水平值上設(shè)置酶解時(shí)間180 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)木槿花多糖得率的影響

2.4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

如圖4所示，觀察曲線變化走向，會(huì)發(fā)現(xiàn)提取率是先增大后減小的。酶解溫度60 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，即2.695%±0.11%；酶解溫度增加10 ℃，發(fā)現(xiàn)提取率開(kāi)始減小。這是因?yàn)闇囟葧?huì)影響酶反應(yīng)速度，在最適溫度下酶反應(yīng)速度會(huì)達(dá)到最大值，但在低溫或高溫下會(huì)導(dǎo)致酶反應(yīng)速度減慢，甚至?xí)?dǎo)致酶失活。因此纖維素酶提取木槿花多糖的最佳酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)木槿花多糖得率的影響

2.5 料液比對(duì)多糖得率的影響

如圖5所示，曲線呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，料液比1∶40（g/mL）時(shí)，提取率最大，即2.688%±0.19%。料液比1∶50（g/mL），提取率開(kāi)始下降。這是因?yàn)椋涸谔崛《嗵沁^(guò)程中所加溶劑太少，會(huì)導(dǎo)致多糖不容易從植物細(xì)胞中析出，使得多糖得率下降；隨著溶劑增加，更多的多糖從植物細(xì)胞中析出溶解到溶劑中，多糖得率開(kāi)始上升，但隨著溶劑體積不斷增大，溶劑內(nèi)酶濃度下降，使得多糖得率又緩慢下降。因此纖維素酶提取多糖的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

圖5 料液比對(duì)木槿花多糖得率的影響

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)完成單因素試驗(yàn)，得出影響因素的最佳取值范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到三元二次回歸方程：Y=5.19+1.13A-0.11B+0.70C+0.27AB-0.055AC+0.16A2+0.46B2-0.77C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表3顯示，回歸模型對(duì)木槿花多糖得率的影響顯著（p=0.0192＜0.0500），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.3929＞0.050），說(shuō)明模型的擬合程度良好。多糖得率的校正系數(shù)R2為70.86%，結(jié)果表明得出的模型可以解釋70.86%多糖得率的變化[14]。

通過(guò)表3發(fā)現(xiàn)，酶用量、酶解時(shí)間和料液比的平方項(xiàng)對(duì)木槿花多糖得率的影響較大。分析表3中的F值發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)值越高，對(duì)多糖得率的影響越大。由一次項(xiàng)的F值可以看出FA＞FC＞FB，因此可以看出影響得率的大小因素順序?yàn)槊赣昧浚玖弦罕龋久附鈺r(shí)間。使用Design-Expert得到響應(yīng)面曲線，曲線的分析原理：響應(yīng)圖的曲面越陡峭，輪廓越密集呈橢圓，表示因素之間交互影響越大[15]，所以由圖6～圖8可以看出，只有酶用量和酶解時(shí)間交互作用顯著，對(duì)多糖得率影響較大。

圖6 酶解時(shí)間和酶用量對(duì)多糖得率的影響

圖8 料液比和酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

表3 回歸模型的方差分析

利用軟件分析得到提取木槿花多糖的最佳工藝：酶解時(shí)間180 min，酶用量0.3%，料液比1∶48.4（g/mL），預(yù)測(cè)提取率為7.641%。為驗(yàn)證進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果為7.247%，與預(yù)期值相差不大，所以利用Design Expert 8.0.6軟件得到的回歸模型可靠，可用于木槿花多糖的提取。

圖7 料液比和酶用量對(duì)多糖得率的影響

3 結(jié)論與展望

通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到影響因素的最佳取值范圍，利用響應(yīng)面法建立酶提取木槿花多糖的回歸方程模型，改進(jìn)木槿花多糖的提取工藝。分析后發(fā)現(xiàn)影響多糖得率的因素大小順序是酶用量、料液比、酶解時(shí)間。

最佳工藝條件為酶用量0.3%、酶解時(shí)間180 min、料液比1∶48.4（g/mL）、酶解溫度60 ℃，預(yù)測(cè)得率為7.641%。通過(guò)參考其他文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)超聲波提取木槿花多糖得率為6.36%，比較后發(fā)現(xiàn)酶法提取木槿花多糖的提取率要比超聲波提取木槿花多糖多1.2個(gè)百分點(diǎn)。所以后續(xù)研究木槿花多糖的其他特性時(shí)，可采用酶法提取木槿花多糖，不僅多糖得率更高，而且節(jié)約實(shí)驗(yàn)資源。