乳腺癌中Ki-67、EGFR及E-cad表達及其對預(yù)后的影響研究

程辰 李雪平 徐藝 趙紅艷 趙海濤連云港市中醫(yī)院超聲科，連云港 00；連云港市第一人民醫(yī)院超聲科，連云港000；連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，連云港 000；連云港市中醫(yī)院普外科，連云港 00

通信作者：趙紅艷，Email：643627734@qq.com

作為當(dāng)下全世界女性群體較為常見的惡性腫瘤疾病，乳腺癌在所有的女性惡性腫瘤疾病方面位列首位。雖然該疾病的發(fā)病率常年居高不下，但因相關(guān)治療技術(shù)趨于完善，病患的5 年生存情況表現(xiàn)較好。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，歐洲一地2006 至2012 年期間，該病患的5 年生存情況從二十年前的83%，攀升至88%，相對生存率更是從91%增長到了96%。基于醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步，分子生物標志物越來越多［1］，靶向明確的新輔助化療及內(nèi)分泌治療的廣泛開展，使乳腺癌的生存率及預(yù)后有了大幅度改善，也使得該疾病的治療方案趨近于慢性疾病管理［2］。因此，構(gòu)建起圍繞個體特性以及分子生物標志的預(yù)后評價機制顯得尤為必要。除人表皮生長因子受體2（HER-2）、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）外，細胞增殖相關(guān)抗原（Ki-67）、表皮生長因子受體（EGFR）和上皮鈣黏附蛋白（E-cad）目前已經(jīng)成為臨床病理學(xué)中用以評估腫瘤生長活躍程度的常用指標，并且已經(jīng)在結(jié)直腸癌、宮頸癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌及胃腸道間質(zhì)瘤等腫瘤中得到廣泛應(yīng)用。關(guān)于Ki-67、EGFR、E-cad 在乳腺癌中的表達及其對預(yù)后的影響，目前只有少數(shù)研究，并且部分顯示出相互矛盾的結(jié)果。

為此，我們進一步探討Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平和該疾病的臨床病理治療、預(yù)后等聯(lián)系，探索Ki-67、EGFR、E-cad對于乳腺癌患者生存時間的影響，以期為臨床決策提供依據(jù)。

資料與方法

1、研究對象

本文回顧性研究2015 年5 月至2021 年12 月連云港市第一人民醫(yī)院及連云港市中醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌標本167 例，隨訪并整理患者病例資料，時間起點為患者的手術(shù)日期或臨床活檢病理確診日期，以患者失訪、最后1 次隨訪時間（隨訪截止時間為2022 年4 月）或死亡為節(jié)點，研究終點為死亡。（1）納入標準：①女性；②手術(shù)病理或臨床活檢確診為乳腺癌的患者；③給予規(guī)范化治療的乳腺癌患者；④相關(guān)病例資料完善。（2）排除標準：①其他組織來源腫瘤；②隨訪信息不完整者；③新輔助化療或內(nèi)分泌治療不規(guī)范者。

2、研究方法

2.1、資料收集 通過連云港市第一人民醫(yī)院及連云港市中醫(yī)院病案管理系統(tǒng)，按照標準檢索出2015 年1 月至2021 年12 月滿足條件的患者住院基本信息和相關(guān)原始資料，梳理研究所需要的病例資料，匯總為表格。

2.2、隨訪 通過電話隨訪以及現(xiàn)場訪談等方式，以手術(shù)開始或組織活檢病理確診日期為隨訪起點，隨訪截止日期為2022 年4 月1 日，隨訪過程中因失訪未產(chǎn)生結(jié)果事件者定義成截尾。

2.3、評價標準 總生存期（OS）即患者確診日期為起點至患者死亡或研究結(jié)束期間的時間。期間由開始時間至腫瘤及其并發(fā)癥導(dǎo)致死亡時間或最后1 次隨訪時間為完全數(shù)據(jù)。由隨訪開始日期至截尾日期為截尾數(shù)據(jù)。

3、病理數(shù)據(jù)

（1）TNM 分期：參照第八版AJCC 公布的乳腺癌分期分期標準［3］，記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。（2）病理分子分型：根據(jù)ER、PR及HER2的表達，將乳腺癌分為以下分子分型：Luminal A 乳腺癌、Luminal B 乳腺癌、HER-2 陽性（HR 陽性）乳腺癌、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）。（3）ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR、E-cad 的判讀標準。ER、PR 判讀：腫瘤細胞核染色≥1%的任何強度染色判讀為陽性，＜1%腫瘤細胞核染色為陰性。HER-2 判讀：按照陽性細胞表達的數(shù)量分為4級（-、+、++、+++），-、+判定為陰性，++、+++判定為陽性。Ki-67 判讀：Ki-67 陽性定義為細胞核染色為淡黃至棕黃色，隨機選擇10 個400 倍鏡進行計數(shù)，計算Ki-67 陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比。Ki-67≤14%為低表達，Ki-67＞14%為高表達。EGFR、E-cad 判讀：按照陽性細胞表達的數(shù)量分為4級（-、+、++、+++）。

4、預(yù)后評價標準

Neo-Bioscore 評分系統(tǒng)的具體評分如下：ER 陽性、陰性分別對應(yīng)0、1分；HER-2陽性、陰性分別對應(yīng)0、1分；組織學(xué)分級：1～2級0分，3級1分；新輔助治療前臨床分期：Ⅰ、ⅡA期均為0 分，ⅡB、ⅢA 期均為1 分，ⅢB、ⅢC 期均為2 分；術(shù)后病理分期：0期與Ⅰ期均為0分，ⅡA、ⅡB期、ⅢA期及ⅢB期均為1 分，ⅢC 期為2 分。將Neo-Bioscore 評分分為0、1、2、3、4、5、6、7共8個分級。

5、統(tǒng)計學(xué)方法

通過Excel軟件對隨訪患者的資料進行整理匯總，建立數(shù)據(jù)庫。運用SPSS 24.0 軟件分析、處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料的組間比較采用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05，若P＜0.05則認為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義；運用Spearman進行關(guān)聯(lián)性研究，評價生物學(xué)預(yù)后因子與臨床病理特征、預(yù)后評價體系Neo-bioscore 相關(guān)性的研究；對OS、生存分析進行觀察，按照Kaplan-Meier 法進行繪制，得到生存曲線。在此基礎(chǔ)上，采用Cox 回歸模型，排除混雜因素所產(chǎn)生的影響，開展多因素分析。

結(jié) 果

1、一般資料

經(jīng)手術(shù)切除的乳腺癌標本167例，患者年齡21～79歲，平均年齡46.4 歲。參照世界衛(wèi)生組織標準病理學(xué)，其中有101 例浸潤性導(dǎo)管癌，39 例非特殊浸潤性導(dǎo)管癌，5 例粘液癌、7 例原位癌、37 例導(dǎo)管內(nèi)癌（單發(fā)或合并浸潤性導(dǎo)管癌）。病理分子分型中，Luminal A 型26 例，Luminal B 型56例，HER-2陽性（HR陽性）57例，三陰型28例。隨訪中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例，術(shù)后復(fù)發(fā)13例，4例出現(xiàn)了肝、肺、骨轉(zhuǎn)移等問題；其中，有131 例接收了新輔助化療，31 例接收內(nèi)分泌治療，5例轉(zhuǎn)外后續(xù)治療。

2、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

Ki-67、EGFR、E-cad的表達水平分別與患者的年齡、腫塊的位置、腫瘤長徑、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、TNM分期之間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但其乳腺癌的病理分子分型與Ki-67、EGFR 表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.463，P＜0.001；χ2=25.652，P＜0.001）。 Ki-67 與EGFR，EGFR 與E-cad 之間的表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.167，P=0.007；χ2=18.576，P＜0.001）。

3、Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性研究

Ki-67與腫瘤長徑有一定正相關(guān)性（r=0.159，P=0.041），即腫瘤長徑越大，則Ki-67 的表達水平可能越高，但相關(guān)系數(shù)r＜0.2，說明關(guān)系緊密性一般。乳腺癌的分子分型分別與Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平有顯著相關(guān)性（r=0.414，P＜0.001；r=0.379，P＜0.001；r=-0.170，P=0.028），其中乳腺癌的分子分型與Ki-67、EGFR 有緊密的正相關(guān)性，與E-cad有緊密的負相關(guān)性。EGFR 與Ki-67 的表達水平有緊密的正相關(guān)性（r=0.207，P=0.007），與E-cad 的表達水平有顯著的負相關(guān)性（r=-0.325，P＜0.001）。

4、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達水平與乳腺癌預(yù)后評價體系Neo-bioscore相關(guān)性的研究

Neo-bioscore 評分體系分值高低與Ki-67 的表達水平有緊密正相關(guān)性（r=0.324，P＜0.001）；與EGFR 的表達水平有緊密性一般的正相關(guān)（r=0.176，P=0.023）。 而Neo-bioscore 評分體系分值高低與E-cad 的表達水平亦有緊密性一般的負相關(guān)（r=-0.162，P=0.037）。見表1。

表1 乳腺癌患者預(yù)后評價體系Neo-bioscore評分與Ki-67、EGFR、E-cad表達水平的相關(guān)性（例）

5、乳腺癌組織中Ki-67、EGFR、E-cad 的表達與患者生存分析

結(jié)合臨床隨訪資料，對167 例患者的臨床病例參數(shù)進行歸納總結(jié)（表2），術(shù)后常規(guī)定期隨訪，共14～88 個月的隨訪期（隨訪的平均時長40個月，34個月為中位數(shù)）。

表2 167例乳腺癌患者生存曲線單因素分析（Log-rank檢驗）

通過Kaplan-Meier單因素分析顯示：乳腺癌的Ki-67表達水平和Neo-bioscore 評分是影像乳腺癌預(yù)后的因素（圖1、圖2）。乳腺癌Ki-67 表達水平不同其預(yù)后有明顯差異（χ2=3.950，P=0.047），Neo-bioscore 評 分（χ2=13.372，P=0.004）。本研究中腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分級及其余生物學(xué)免疫因子對乳腺癌生存期的影響差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖1 167例乳腺癌患者Ki-67表達水平與生存時間的相關(guān)性分析

圖2 167例乳腺癌患者Neo-bioscore評分與生存時間的相關(guān)性分析

進一步采用COX 模型排除混雜因素影響，分析Ki-67 表達水平和Neo-bioscore 評分實際值與生存時間的關(guān)系，結(jié)果顯示Ki-67 表達水平和Neo-bioscore 評分仍是影響患者生存的獨立危險因素（表3）。

表3 167例乳腺癌患者生存曲線多因素分析（COX回歸）

討 論

1、不同年齡對乳腺癌患者生存期的影響

本研究中，167例乳腺癌患者的平均發(fā)病年齡為46.4歲（年齡21～79 歲）。年輕乳腺癌（≤35 歲）以及老年乳腺癌（≥56 歲）比例分別為18.0%和18.6%，年齡分布特征與國內(nèi)外相關(guān)研究［4］結(jié)果比較，年輕乳腺癌較國內(nèi)外相關(guān)研究比例較低，而老年乳腺癌卻得到了相似結(jié)果。對發(fā)病者的年齡進行分析，人數(shù)最多的組別（61 例）為46～55 歲這一年齡范圍，占36.53%，從這個數(shù)值來看，表明女性絕經(jīng)前后為高發(fā)期，應(yīng)對其予以重視。有研究顯示：年輕與老年的乳腺癌患者預(yù)后效果均較差，而年輕女性乳腺癌患者往往有較高的不良預(yù)后指標，其中絕大部分選擇保留乳房的手段進行治療，相較于年齡更大的乳腺癌患者而言，存在較高的局部復(fù)發(fā)風(fēng)險［5-7］。但值得一提的是，對Luminal 亞型乳腺癌進行分析，老年患者預(yù)后效果較差。本研究中，因樣本量及醫(yī)療服務(wù)輻射區(qū)域有限，結(jié)果中年齡因素對乳腺癌生存期的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但在未來的研究中，全面評估年輕女性乳腺癌手術(shù)后患者，更好地了解影響年輕婦女乳腺癌發(fā)病率和病死率的種族、民族差異的因素，將有助于改善她們的預(yù)后情況。

2、Ki-67的表達與腫瘤長徑關(guān)系

20世紀80年代，Gerdes等［8］經(jīng)過長期研究和不斷摸索，在其發(fā)表的成果中指出，Ki-67 為增殖細胞核抗原，和有絲分裂存在非常緊密的關(guān)系。當(dāng)前，在臨床檢測腫瘤增殖活性的過程中，往往會將Ki-67 視為一種具有較高可靠性的指標。根據(jù)已有的研究結(jié)果來看，其和癌癥患者存活率、腫瘤體積等存在一定的關(guān)聯(lián)性［9］，正是因為如此，經(jīng)常用于對癌癥患者的預(yù)后、療效進行預(yù)測和評估。本文在研究過程中，Ki-67 與腫瘤長徑有一定的正向相關(guān)性，但緊密性一般（r=0.159，P=0.041），該結(jié)論與部分學(xué)者先前的研究結(jié)論部分一致［10］。分析其原因，筆者認為：對細胞增殖、分化而言，Ki-67 發(fā)揮了非常重要的作用，因Ki-67 與VEGF 呈正相關(guān)性，后者對血管的形成產(chǎn)生了明顯促進作用，使得血管變得更加通透，便于供給營養(yǎng)，故腫塊在其作用下，生長速度增快、體積增大，分化程度較高，同時生長方式較易呈現(xiàn)縱向生長。

3、Ki-67、EGFR與病理分子分型相關(guān)性

本研究中，Ki-67 與EGFR 的表達水平與病理分子分型中的Luminal A 型、Luminal B 型、HER-2 陽性（HR 陽性）、三陰型有明顯相關(guān)性，其趨勢表現(xiàn)為Ki-67與EGFR 的表達水平越高則三陰型的可能性越大。由于缺乏ER、PR、HER-2 的表達，TNBC 的臨床特征為具有侵襲性生物學(xué)表現(xiàn)，靶向治療不具有特異性，對內(nèi)分泌治療的敏感性也較低。從這個層面上來講，相較于其他乳腺癌亞型而言，預(yù)后明顯較差。而Ki-67 在TNBC 中的預(yù)后價值尚不清楚，也沒有達成共識。Wu 等［11］經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67 的高表達是切除后TNBC 較差的預(yù)后因素，與低表達率相比，Ki-67 臨界值≥40%與更高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險相關(guān)，但Ki-67 的最佳臨界值尚不清楚。Keam 等［12］報道，接受高Ki-67 表達新輔助治療的TNBC 患者有早期復(fù)發(fā)的模式。相比之下，Ki-67 低表達的亞組沒有任何模式，提示Ki-67 高表達可能導(dǎo)致早期復(fù)發(fā)，提示其具有高增殖潛力。這一現(xiàn)象可能部分解釋了為什么高Ki-67 表達仍然是新輔助治療亞組的不良預(yù)后因素。

EGFR 屬酪氨酸激酶的ErbB 家族［13］。根據(jù)近期相關(guān)研究，在癌癥患者中，經(jīng)常出現(xiàn)EGFR 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域突變、基因擴增等變化，使得EGFR 參與了不同類型腫瘤的發(fā)病和進展，而EGFR 的基因改變都與抗EGFR 藥物反應(yīng)的高概率相關(guān)，所以在胰腺癌、肺癌等癌癥中，EGFR 發(fā)生過表達、突變，加快腫瘤進程產(chǎn)生，和耐藥性存在一定的關(guān)聯(lián)性［14］。TNBC 的患者中也有較大比例發(fā)生EGFR 過表達現(xiàn)象，因此對TNBC 患者而言，EGFR 抑制劑治療可能為有效的治療方式。在臨床治療中，EGFR單抗、聯(lián)合免疫檢查點、PRMT1 抑制劑等極有可能具有重要的推廣價值［15-16］。因此，EGFR 可用于TNBC 預(yù)后評價，并在TNBC 治療過程中，可發(fā)揮分子靶點的作用［17］。

4、Ki-67、EGFR、E-cad 三者關(guān)系及與乳腺癌預(yù)后評價體系Neo-bioscore的相關(guān)性

既往的文獻中對乳腺癌中Ki-67、EGFR、E-cad 三者間關(guān)系的研究甚少，據(jù)本文的試驗結(jié)果：Ki-67 與EGFR 的表達水平呈正向相關(guān)性，而EGFR 與E-cad的表達水平呈負向相關(guān)性。筆者分析：Ki-67 作為一種增殖標志物，似乎與癌癥的存活率有關(guān)，也有研究認為它是檢測腫瘤增殖活性的最可靠指標［9］；EGFR 對細胞增殖、分化產(chǎn)生影響［18］，其高表達極有可能加快惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，不管是總生存期，還是無病生存期，都出現(xiàn)了顯著下降趨勢。E-cad作為鈣黏附蛋白家族中重要成員，是近年來的研究熱點之一。作為腫瘤抑制因子的E-cad 與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究顯示E-cad 在乳腺癌組織中呈低表達，且與ER 表達水平呈顯著相關(guān)。E-cad 蛋白表達減少或缺失是導(dǎo)致惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中的一個重要因素。St?nculescu 等［19］發(fā)現(xiàn)在分化差、進展期的癌癥中E-cad蛋白表達降低，轉(zhuǎn)移病灶中E-cad蛋白表達均缺失。由此可見，Ki-67 與EGFR 同為影響腫瘤細胞增殖的免疫因子，其間的正相關(guān)性可以認為不是偶然；E-cad 蛋白作為抑癌因子與增殖因子EGFR 呈負相關(guān)性，也可能存在一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，但需要更多的樣本量支持和實驗進一步驗證。

Neo-bioscore 評分系統(tǒng)是將新輔助治療前的臨床分期、腫瘤穿刺病理信息（包括ER、PR、HER-2、組織學(xué)分級）、術(shù)后病理分期綜合進行評分量化，各項評分相加最終得到Neo-Bioscore 得分，它幾乎涵蓋了乳腺癌新輔助治療前、后重要的臨床病理信息［20］。國內(nèi)外有研究顯示：對早期無病生存期進行預(yù)測時，以該得分為考察指標［21］。對復(fù)發(fā)風(fēng)險進行分組時，如果閾值設(shè)定為3 分，與無病生存期的相關(guān)性更緊密，對年輕的HR陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療方案的選擇進行指導(dǎo)。Neo-Bioscore 除了可以改善新輔助化療后乳腺癌患者在臨床和病理分期上的預(yù)后分層［22］，并且可能有助于識別可以避免額外輔助化療的非pCR TNBC 患者。本研究中，Neo-bioscore 評分體系分值高低與Ki-67、EGFR 的表達水平有正相關(guān)性，而與E-cad 的表達水平有負相關(guān)性。筆者認為：該結(jié)果從側(cè)面證明，Ki-67、EGFR 等表達在評價乳腺癌患者療效、預(yù)后分層時具有重要的指導(dǎo)意義。

5、乳腺癌的Ki-67 表達水平、Neo-bioscore 評分與生存時間的相關(guān)性

既往的研究中多次驗證：乳腺癌的高增殖狀態(tài)又導(dǎo)致與腫瘤的浸潤生長和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性［23］，所以，Ki-67 高表達和乳腺癌患者不良預(yù)后存在非常密切的聯(lián)系。焦武等［24］在研究過程中，Neo-bioscore 評分閾值設(shè)置為3分，對198例患者進行分組，按照高、低分組開展生存分析，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.353，P＜0.05），這與本研究中Neo-bioscore評分的生存分析結(jié)果相似（χ2=13.372，P=0.004）。但這一預(yù)后評分體系并未將Ki-67 表達水平納入?yún)⒖挤秶?5］，雖然在預(yù)后評估方面有著全面、分層清晰、早期評估效果好等優(yōu)越性，但臨床對Ki-67 的參考應(yīng)用較多，這也可能會在某種程度上會影響對乳腺癌預(yù)后評估的判定，加之評分標準較為復(fù)雜，國內(nèi)外很多專家學(xué)者也在不斷改良。故筆者認為，將Ki-67 表達水平與Neo-bioscore 評分結(jié)果綜合評估乳腺癌患者的生存預(yù)后，可能更會合理地預(yù)測乳腺癌患者的生存情況及預(yù)后。

6、本研究的創(chuàng)新點及局限性

本研究首次在乳腺癌中綜合研究免疫因子Ki-67、EGFR、E-cad表達水平之間的相互關(guān)系，以及與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性，并首次將其與乳腺癌預(yù)后評價體系Neo-bioscore評分進行比較，確定其對部分乳腺癌亞型靶向治療預(yù)后評價的價值分析，此方法國內(nèi)外發(fā)表的文獻中尚未見報道。

本文在研究過程中存在一些缺陷：首先，由于設(shè)置了相對嚴格的納入標準，有可能導(dǎo)致選擇存在偏倚現(xiàn)象；與此同時，隨訪的中位時長為3 年，導(dǎo)致整體層面上的病死率、復(fù)發(fā)率被低估，應(yīng)該延長隨訪時間，更好地對治療乳腺癌患者過程中的這些因素價值進行驗證。

從以上分析來看，本文經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)Ki-67、EGFR 及E-cad表達對增殖活性分子表達等產(chǎn)生了輔助判斷作用，使得個性化、靶向治療成為可能，與乳腺癌患者的預(yù)后有直接或間接相關(guān)性，動態(tài)監(jiān)測腫瘤靶向治療效果，從而更好地為臨床服務(wù)。