應(yīng)用顯微掃描儀檢測(cè)臨床樣本中抗酸菌的假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果情況分析

黃業(yè)倫 劉欣 黃艷君 陳劍鋒 謝偉勝 羅少珍 劉志輝

廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095

通信作者：劉志輝，Email：liuyixi2005@163.com

臨床標(biāo)本涂片顯微鏡檢查找抗酸菌在結(jié)核病診斷中雖然靈敏度不高，但為簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)方法，與此同時(shí)也是指示結(jié)核病患者傳染性強(qiáng)弱、考察抗結(jié)核化療效果與治療轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)結(jié)核病控制效果的重要指標(biāo)，目前尚無(wú)任何實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)能取而代之［1-4］。涂片顯微鏡檢查找抗酸菌雖然技術(shù)不高深、方法也很簡(jiǎn)單，但主觀性強(qiáng)，人為因素影響較大，劉志輝等［5］1995—2000 年3.3%的假陰性實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果即深刻說(shuō)明了這一點(diǎn)。隨著電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、信息化技術(shù)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)等的飛速發(fā)展，顯微鏡檢查找抗酸菌檢測(cè)已逐步向全自動(dòng)制片、染色和鏡檢方向發(fā)展，基于抗酸染色或熒光染色檢測(cè)抗酸菌的顯微掃描儀已走進(jìn)臨床實(shí)驗(yàn)室，其效果如何目前我們尚未查見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)將我們2019 年12 月至2020 年6 月進(jìn)行的人、機(jī)檢測(cè)對(duì)比分析結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

1、一般資料

采用試驗(yàn)研究方法對(duì)比分析在廣州市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科2019 年12 月至2020 年6 月的5 284 張金胺O 熒光染色涂片中進(jìn)行研究。

2、儀器與試劑

結(jié)核分枝桿菌顯微掃描系統(tǒng)FS400 寧波舜宇儀器有限公司，金胺O 熒光染色試劑由實(shí)驗(yàn)室自行配制，涂片采用與顯微掃描儀配套的載玻片。

3、金胺O熒光染色試劑配制

3.1、染色劑（金胺O 染液） 稱量金胺O 染液1 g，使之完全溶解在95%乙醇100 ml 中，另取50 ml 石碳酸液加在850 ml蒸餾水中，將此二液混合均勻（不必過(guò)濾），裝入褐色瓶中，放室溫保存。

3.2、脫色劑（3%～5%的鹽酸乙醇） 3 ml（或5 ml）35%濃鹽酸與97 ml（或95 ml）95%乙醇混合。

3.3、復(fù)染劑（0.5%高錳酸鉀水溶液） 稱量5 g 高錳酸鉀，加入1 000 ml蒸鎦水中搖勻。

4、實(shí)驗(yàn)方法

包括標(biāo)本收集、涂片、染色、鏡檢（人工鏡檢或顯微掃描檢測(cè)）、結(jié)果報(bào)告5 大步驟，實(shí)驗(yàn)操作參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［6］和結(jié)核分枝桿菌顯微掃描系統(tǒng)FS400操作說(shuō)明書進(jìn)行。其中，顯微掃描檢測(cè)的主要操作如下：檢查和啟動(dòng)儀器、打開軟件，將染色好的玻片放在玻片架上（每架40 張）并置入儀器，點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)掃描，掃描速度5～7 min∕張。

5、顯微掃描結(jié)果人工復(fù)檢抽樣和顯微鏡檢

對(duì)所有儀器報(bào)告陽(yáng)性涂片、約15%的儀器報(bào)告陰性涂片（隨機(jī)抽?。┻M(jìn)行人工復(fù)檢，計(jì)算其假陽(yáng)性率和假陰性率；對(duì)假陰性者，應(yīng)用顯微鏡玻片夾坐標(biāo)尺標(biāo)注人工復(fù)檢到的抗酸菌在涂片中所在位置，估計(jì)其在儀器掃描區(qū)域內(nèi)外的情況。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用分類資料的統(tǒng)計(jì)描述方法手工計(jì)算顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性率和假陰性率，人工復(fù)檢查見抗酸菌在儀器掃描區(qū)域內(nèi)、外的發(fā)生率。

結(jié) 果

1、顯微掃描儀器系統(tǒng)假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果情況

在5 284張涂片中，儀器報(bào)告陽(yáng)性1 290例，人工復(fù)檢報(bào)告陽(yáng)性850例，假陽(yáng)性率為34.11%（440∕1 290），這些涂片在顯微鏡下可觀察到短桿、散在點(diǎn)粒、雜質(zhì)等熒光染色物；隨機(jī)抽查儀器報(bào)告陰性涂片665 張，人工復(fù)檢報(bào)告陽(yáng)性100 例，假陰性率為15.04%，假陰性結(jié)果包括38 例±、50 例1+、6例2+、4例3+、2例4+。

2、儀器系統(tǒng)假陰性涂片人工復(fù)檢結(jié)果

⑴隨機(jī)抽查儀器報(bào)告陰性涂片665 例，人工復(fù)檢發(fā)現(xiàn)100 例假陰性涂片，鏡檢分級(jí)結(jié)果為±、1+、2+、3+、4+的 假 陰 性 率 分 別 為5.71%（38∕665）、7.52%（50∕665）、0.90%（6∕665）、0.60%（4∕665）、0.30%（2∕665）。⑵對(duì)于人工復(fù)檢分級(jí)結(jié)果為±、1+、2+、3+、4+的100例假陰性涂片，其落入到儀器閱片區(qū)域內(nèi)和外的例數(shù)分別為11 和27、23 和27、3和3、3和1、2和0。

討 論

在涂片中見到的抗酸菌包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）、麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM），而麻風(fēng)病在我國(guó)已基本消除，故能想見各類臨床樣本中的抗酸菌主要為MTC 和NTM。對(duì)于NTM，目前全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)190余種并且不斷有新種發(fā)現(xiàn)，我國(guó)則分離到60余種，其引起疾病的發(fā)病率和患病率也有逐步增加的趨勢(shì)［7-9］。在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，廣州市胸科醫(yī)院結(jié)核病防治所實(shí)驗(yàn)室1994—2003 年的NTM 分離率為6.28%［10］、住院部實(shí)驗(yàn)室1998—2001 年的NTM 分離率為16.50%［11］，2012—2016 年廣州市越秀和海珠兩老城區(qū)的NTM 分離率為4.18%［12］；Zhou 等［13］的meta 分析則報(bào)道2000—2019 年間我國(guó)結(jié)核病疑似病例中NTM的粗分離率為4.66%～5.78%，NTM在所有分枝桿菌分離株中所占的比例為11.57%。由此可以推斷在涂片查找的抗酸菌中有10%左右的NTM。我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下可以看到不同種類的分枝桿菌形態(tài)各異，結(jié)核分枝桿菌也分桿菌型、球菌型、顆粒型、濾過(guò)型4 種類型，單個(gè)散在時(shí)或呈人型、V 型、T 型、Y 型，多個(gè)細(xì)菌扭集在一起時(shí)可呈繩索狀、束狀或叢狀［14］，在人工顯微鏡檢判斷時(shí)即存在一定程度的主觀性。顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)抗酸菌屬于人工智能，其常用方法和模型包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，如何準(zhǔn)確識(shí)別形態(tài)多樣的抗酸菌，則更有賴于機(jī)器深度學(xué)習(xí)中訓(xùn)練數(shù)據(jù)的質(zhì)與量，深度學(xué)習(xí)依賴于大量的標(biāo)注數(shù)據(jù)，而標(biāo)注數(shù)據(jù)的質(zhì)量決定著深度學(xué)習(xí)模型訓(xùn)練的結(jié)果［15］。李強(qiáng)等［16］評(píng)價(jià)了自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)的效果與人工鏡檢的陽(yáng)性率相近，但兩者間的差異性沒(méi)有在形態(tài)學(xué)和掃描區(qū)域方面進(jìn)行分析。在本文的分析結(jié)果中，顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)抗酸菌的假陽(yáng)性率為34.11%，在人工復(fù)檢時(shí)也能看到涂片中短桿、散在點(diǎn)粒、雜質(zhì)等熒光染色物，充分說(shuō)明機(jī)器深度學(xué)習(xí)中訓(xùn)練數(shù)據(jù)的質(zhì)與量還相當(dāng)不足，我們必須建立數(shù)量更多、質(zhì)量更高的數(shù)據(jù)庫(kù)供儀器系統(tǒng)深度學(xué)習(xí)，以提高儀器系統(tǒng)的建模質(zhì)量，不斷降低其假陽(yáng)性情況的發(fā)生。哈艷等［17］應(yīng)用增強(qiáng)圖卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)透射電子顯微鏡病毒圖像特征的識(shí)別的研究理念值得我們借鑒。與此同時(shí)，更需強(qiáng)調(diào)的是：對(duì)顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果必須全部人工復(fù)檢，因?yàn)樵谂R床中抗酸菌檢測(cè)陽(yáng)性即幾近確診為結(jié)核?。ㄒ?yàn)橐延谇笆鯪TM 僅占10%左右），假陽(yáng)性結(jié)果嚴(yán)重影響患者的臨床治療，只有當(dāng)顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)與人工復(fù)檢結(jié)果達(dá)到高度一致時(shí)方可考慮適度降低對(duì)這一程序的要求，如按比例抽查人工復(fù)檢等。

顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)抗酸菌在高假陽(yáng)性結(jié)果的同時(shí)，我們也得到了15.04%的假陰性結(jié)果，可以看到其原因有二：一是儀器系統(tǒng)對(duì)閱片域內(nèi)的抗酸菌“認(rèn)不清”，屬儀器系統(tǒng)建模質(zhì)量問(wèn)題；二是儀器系統(tǒng)對(duì)閱片域外的抗酸菌“看不到”，為儀器系統(tǒng)掃描區(qū)域設(shè)置問(wèn)題。涂片染色查找抗酸菌靈敏度本來(lái)不高，如何提高是人們一直都在探討的課題，因此如何減少顯微掃描系統(tǒng)檢測(cè)抗酸菌假陰性結(jié)果，也是我們必須重視的問(wèn)題，提高儀器系統(tǒng)建模質(zhì)量、擴(kuò)大儀器系統(tǒng)的掃描區(qū)域是解決問(wèn)題的基本途徑。如何提高儀器系統(tǒng)建模質(zhì)量已于上述，至于掃描區(qū)域如何擴(kuò)大，則需兼顧檢測(cè)速度，大家在實(shí)踐中應(yīng)予務(wù)實(shí)探索，結(jié)合樣本臨床信息對(duì)顯微掃描檢測(cè)陰性涂片進(jìn)行適當(dāng)比例的人工復(fù)檢可以在相當(dāng)程度上彌補(bǔ)儀器系統(tǒng)的缺陷。

總之，高質(zhì)量維護(hù)顯微掃描系統(tǒng)建模數(shù)據(jù)庫(kù)是儀器系統(tǒng)應(yīng)用中的常態(tài)性工作，必須持之以恒；依據(jù)儀器系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行人工復(fù)檢，是保證檢驗(yàn)正確的必要手段，必須常抓不懈。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突