基于SSR 標記的無翼坡壘遺傳多樣性研究

蔡 穎，段繼煜，朱思奇，任明迅,2，唐 亮,2

（1. 海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海口 570228; 2. 海南大學(xué) 環(huán)南海陸域生物多樣性研究中心，海口 570228）

熱帶雨林分布在赤道附近降雨充沛的熱帶地區(qū)，是1 種具有獨特外貌和群落結(jié)構(gòu)，物種多樣性很高的森林生態(tài)系統(tǒng)[1?2]。熱帶雨林在調(diào)節(jié)局部與全球氣候、維持生物多樣性和生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用[3]。我國熱帶地區(qū)位于亞洲熱帶北緣，是東南亞熱帶雨林向北延伸的邊界，主要包括西藏東南部、云南和廣西南部、臺灣南部和海南島，其中，海南島具有我國分布最集中、連片面積最大的熱帶雨林[4?6]。龍腦香科(Dipterocarpaceae)是海南島熱帶雨林的標志性樹種，廣泛分布在海南島700 m 以下的低海拔山地[7]。胡玉佳[7]根據(jù)群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)外貌特征，將海南島的龍腦香群落分為混合群落與單優(yōu)群落，后者包括單優(yōu)青皮林與單優(yōu)無翼坡壘林。與原生演替形成的單優(yōu)青皮林不同，單優(yōu)無翼坡壘林是經(jīng)過多次人為干擾破壞后，通過次生演替形成的[8]。自20 世紀70 年代在甘什嶺發(fā)現(xiàn)無翼坡壘以來，許多學(xué)者圍繞單優(yōu)無翼坡壘林開展了種群、群落和區(qū)系研究。胡玉佳[7]在1983 年調(diào)查了無翼坡壘林的物種組成，發(fā)現(xiàn)群落的物種數(shù)較少，森林尚處于更新階段。最近，邢福武等[9]和漆良華等[10]再次調(diào)查了無翼坡壘群落，發(fā)現(xiàn)物種數(shù)有所增長，表明甘什嶺保護區(qū)在物種保護上發(fā)揮了積極的作用。楊小波等[11?13]研究了無翼坡壘的種群結(jié)構(gòu)，分布格局，物種多樣性和空間配置，確定無翼坡壘為增長型種群，但自疏作用強烈，生長到一定階段后個體數(shù)量減少，種群的集群程度變小。胡璇等[14]針對無翼坡壘種群結(jié)構(gòu)與動態(tài)的最新研究顯示，老齡樹的比例較25 年前有所增長，種群結(jié)構(gòu)在向好的方向發(fā)展，但無翼坡壘的幼齡樹對病害敏感，且生長受磷元素限制[15?17]。光合生理特性研究顯示，雖然無翼坡壘為耐陰樹種，但到一定時期后需要充足的光照才能生長更好，否則將進入長時間的蹲苗期[18]。林中無翼坡壘的密度大，光照和養(yǎng)分條件差，種內(nèi)競爭激烈，群落總體上仍處在不穩(wěn)定階段[8]。加上分布范圍局限，適生區(qū)面積狹小[19]，國際自然保護聯(lián)盟（IUCN）將無翼坡壘評級為極度瀕危種（https://www.iucnredlist.org/species/33393/9776515），所以海南島無翼坡壘的生存狀況仍然不容樂觀?，F(xiàn)有報道主要集中在無翼坡壘種群與群落生態(tài)的研究上，缺乏遺傳多樣性的評估與分析。種群遺傳變異是闡明物種進化歷史和生態(tài)適應(yīng)的基礎(chǔ)[20]，是評價物種存活潛力、解釋瀕危原因的重要依據(jù)[21?22]。因此，研究瀕危物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是制定其保護策略的前提。

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)[23]，也稱為微衛(wèi)星(microsatellite)，是基因組中以1～6個核苷酸為單位的串聯(lián)重復(fù)序列，長度一般在100～200 bp 之間。因其多態(tài)性高、易于檢測等優(yōu)點[24]，廣泛應(yīng)用于瀕危物種的保護研究[25?26]。龍腦香科瀕危樹種常用微衛(wèi)星標記評估遺傳多樣性，用以指導(dǎo)保護管理。LEE 等[27]發(fā)現(xiàn)娑羅雙屬的極度瀕危種Shorea lumutensis 仍具有較高水平的微衛(wèi)星變異，但因個體數(shù)量不足500，建議通過就地保護與遷地保護相結(jié)合的方式實施物種保護。坡壘屬的極度瀕危種狹葉坡壘(Hopea chinensis)僅在越南廣寧和中國廣西發(fā)現(xiàn)，TRANG 等[28]使用SSR標記檢測到種群瓶頸和高水平近交，揭示種群規(guī)模縮小是狹葉坡壘瀕危的主要原因。WANG等[29]利用12 對SSR 標記評估了海南島瀕危植物坡壘(H. hainanensis)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)坡壘的微衛(wèi)星變異水平明顯低于同屬的非瀕危種H.dryobalanoides，推斷種群瓶頸是坡壘遺傳變異喪失的可能原因。綜上所述，SSR 標記是研究龍腦香科瀕危物種保護的有效分子標記。本研究利用11 個微衛(wèi)星標記度量海南甘什嶺無翼坡壘種群的遺傳多樣性，并分析種群遺傳結(jié)構(gòu)，評估無翼坡壘遺傳變異下降的程度，旨在為制定無翼坡壘合理的保護措施提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 無翼坡壘種群樣本采集研究區(qū)域位于海南省甘什嶺省級自然保護區(qū)（109°34′～109°42′ E,18°21′～18°26′N）。甘什嶺屬低山丘陵地貌，海拔約50～681 m，坡度<50°，土壤母質(zhì)以花崗巖為主，巖層裸露率10%，屬熱帶海洋季風(fēng)氣候，干濕季分明，雨季集中在5~10 月，年降雨量約為1 800 mm。年平均氣溫25.4 ℃，地帶性森林類型是以無翼坡壘為優(yōu)勢種的熱帶低地雨林[9?10]。甘什嶺保護區(qū)建立于1985 年，主要保護目標是單優(yōu)無翼坡壘林。本研究根據(jù)胸徑將無翼坡壘劃分為3 個齡級：幼齡（Ⅰ）（胸徑 ≤ 2.5 cm），中齡（Ⅱ）（2.5 cm <胸徑 ≤ 7.5 cm）和成熟齡（Ⅲ）（胸徑 >7.5 cm）。在面積2 500 m2的樣方內(nèi)，隨機選取59 株空間上均勻分布的無翼坡壘，3 種齡級分別有21（Ⅰ）、20（Ⅱ）和18（Ⅲ）株。選擇無病害的嫩葉，采下后立即用硅膠干燥，保存?zhèn)溆?。并記錄采樣個體的樹高和胸徑。

1.2 DNA 提取和PCR 擴增采用改良CTAB 法提取基因組DNA[30]?；蚪MDNA 的濃度和質(zhì)量用NanoDrop 2000 分光光度計測量。本實驗利用WANG 等[31]針對坡壘設(shè)計的35 對微衛(wèi)星引物，從中篩選出在無翼坡壘中能穩(wěn)定擴增，且多態(tài)的11 對引物用于后續(xù)試驗。PCR 擴增在Eppendorf的熱循環(huán)儀中進行。總反應(yīng)體積30 μL，由1 μL的模板DNA（50 μg·mL?1），1 μL 正反向引物（10 μmol·L?1），15 μL 2× Taq PCR MasterMix（TIANGEN

生物技術(shù)，北京）和12 μL ddH2O。循環(huán)程序如下：首先94 ?C 預(yù)變性4 min，然后循環(huán)30 次，其中94 ?C變性30 s，56～63 ?C 退火30 s，72 ?C 延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后再72 ?C 延伸12 min。使用ABI 3730XL 分析儀（Applied Biosystems）進行片段分析，使用GeneMarker 軟件進行微衛(wèi)星位點的基因分型（ SoftGenetics, State College, Pennsylvania,USA）。

1.3 數(shù)據(jù)分析無翼坡壘為同源四倍體，因此本研究采用MAC-PR 方法，根據(jù)峰值強度比值確定等位基因劑量[32]。由于MAC-PR 方法不能完全解決等位基因劑量未知導(dǎo)致基因分型的不確定性，同時考慮到多倍體物種在減數(shù)分裂時可能發(fā)生的雙減數(shù)，使標準群體遺傳分析結(jié)果出現(xiàn)偏差[33]。因此，筆者用GENDIVE version3.04[34]和POLYGENE version1.2b[35]2 個軟件解決因劑量信息缺失及減數(shù)分裂時發(fā)生雙減數(shù)等產(chǎn)生的問題。在POLYGENE version 1.2b 軟件實現(xiàn)了4 種多體遺傳模型，根據(jù)貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion,BIC）選擇最優(yōu)模型，基于最優(yōu)模型計算遺傳多樣性的各項指標，如等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）。

哈溫平衡近郊系數(shù)(Gis)GENODIVE期望雜合度(He)觀合度(Ho)測雜0.663 0.650 ?0.020 ?0.048標指效等位(Ne)性有基因數(shù)2.792樣多傳香農(nóng)指數(shù)(I)1.035遺的記SSR 標多態(tài)信息含量(PIC)0.550 11 個POLYGENE期望雜合度(He)群種壘觀測雜度(Ho)合0.664 0.628坡翼無的3算等位基因數(shù)(Na)/個GenDive 3.04 計產(chǎn)物長度/bp 140～180 Polygene version 1.2b 和單元重復(fù)TTCT(4*7)據(jù) 1 根表引物序列 (5′–3′)F:ACATGGTCTTTGTTATCTGCTTA R:CCATGGTGCTACAACCTTTCTTG位點Hre1 0.525 0.555 0.053 0.144 2.207 1.059 0.545 0.525 0.613 4 120～170 AT(2*10)F:TTCATGGTCATTGAGTCATAGGT R:GCCTCTACCTAGTGTATGAAGGC Hre2 0.600 0.515 ?0.166 ?0.144 2.039 0.839 0.433 0.601 0.540 AAAATA(6*4) 135～1703 F:TGCTATTCTACCCTAAAAACCCA R:TGGTTGATGCTCTCACAAGCTAT Hre3 0.555 0.480 ?0.157 ?0.085 1.901 0.845 0.436 0.561 0.538 3 100～150 AAG(3*5)F:GATGAGGGATAATGGTGCGTTTG R:CAACTCACGCCTCTGTGTTATTG Hre4 0.618 0.557 ?0.108 ?0.131 2.226 0.952 0.497 0.622 0.586 3 120～150 CTG(3*5)F:AAGTCACCTCCATCCATTTCTCC R:ATGCGGTGAAGAATCATTGGAAC Hre5 0.694 0.661 ?0.050 ?0.096 2.879 1.208 0.604 0.698 0.666 4 140～170 AC(2*8)F:CCTGGAAATCAAAGATGAATCAGCT R:TTGGGGAGGGTAAATAGCAGATG Hre6 0.697 0.614 ?0.134 ?0.230 2.539 1.061 0.540 0.698 0.616 4 140～170 GA(2*7)F:CCGTGGGAGATAGGACATCATTA R:GTTGTGCTTTCACTTATTCATCCCT Hre70.629 0.625 ?0.007 0.020 2.607 1.068 0.573 0.630 0.646 3 140～195 TTA(3*5)F:ATTGTGGATGTAGCTATGGTGAC R:TGTACGGACATTTGGTGGAATCA Hre8 0.342 0.303 ?0.128 ?0.030 1.428 0.535 0.289 0.343 0.350 75～1152 TTTTA(5*6)F:AGTTGGAGATTAAAGAAAGTGGCT R:TTCAATTTAGACCCGTGGACCTC Hre9 0.671 0.569 ?0.181 ?0.033 2.285 1.192 0.598 0.669 0.653 80～1354 AT(2*8)F:TGAGATTCACATGGTTACTGGAA R:ACCATAATTCAAGAAGCATACGCA Hre10 0.420 0.709 0.407 0.402 3.282 1.589 0.716 0.427 0.751 7 135～170 AT(2*9)F:GCTTTCTGCATTTCCTTGAGAGA R:TGATTAGCTGCTGAATTTGGCTG Hre11

使用Structure version 2.3.4[36]分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)。K 值從1 到10，每個K 值進行10 次獨立運算，burn-in 設(shè)置為100 000 次，然后是1 000 000次MCMC（馬爾科夫鏈蒙特卡羅）迭代。最佳K 值使用STRUCTURE Harvester 程序推斷[37]。使用Clumpp version 1.1.2[38]的Greedy 算法重排最優(yōu)K 值的10 次重復(fù)結(jié)果，最后由Distruct version 1.1[39]生成種群結(jié)構(gòu)的圖形表示。基于Cavalli-Sforza[40]的遺傳距離，使用MEGA 5.0 軟件包[41]構(gòu)建無翼坡壘個體的鄰接樹。根據(jù)Cavalli-Sforza 的弦距離做主坐標分析（PCoA），當(dāng)?shù)任换虻膭┝课粗獣r，弦距離是偏差最小的距離測度[42]。將微衛(wèi)星等位基因頻率劃分為10 個等級（0～0.1, 0.1～0.2, ..., 0.9～1.0），使用POLYGENE 的最佳多體遺傳模型估計各個等位基因的頻率，繪制微衛(wèi)星等位基因頻率的直方分布圖。采用定性的圖形法確定無翼坡壘是否經(jīng)歷了種群瓶頸[43]。圖解法的基本原理是，與普通等位基因相比，稀有等位基因會在瓶頸期間迅速丟失。因此，無論突變率和模型如何，在出現(xiàn)瓶頸后，低頻( < 0.1)的等位基因都會比中頻(0.101~0.200)的等位基因少。

2 結(jié)果與分析

2.1 無翼坡壘的遺傳多樣性針對坡壘開發(fā)的35 個微衛(wèi)星標記中，11 個能在無翼坡壘中穩(wěn)定擴增且有多態(tài)性，用于無翼坡壘遺傳多樣性分析，其中，擴增產(chǎn)物長度在75~190 bp 之間，最小重復(fù)單元為15，最大重復(fù)單元為30（表1）。POLYGENE軟件首先確定最優(yōu)多體遺傳模型，根據(jù)BIC 信息標準，選擇BIC 值最小的為最優(yōu)遺傳模型，結(jié)果顯示，CES（Complete equational segregation，完全等分式分離）為無翼坡壘的最優(yōu)多體遺傳模型，非自交無負PCR 為最佳參數(shù)，后續(xù)種群遺傳參數(shù)的計算將基于CES 模型進行（表2）。由POLYGENE 估計的等位基因個數(shù)在2（Hre9）至7（Hre11）之間，平均3.636 個；有效等位基因的個數(shù)在1.428（Hre9）至3.282（Hre11）之間，平均2.380 個。多態(tài)信息含量0.289（Hre9）至0.716（Hre11），平均值0.526；Shannon 信息指數(shù)0.535（Hre9）至1.589（Hre11），平均值1.035。觀測雜合度最小0.343（Hre9），最大0.698（Hre6、Hre7），平均值0.585。期望雜合度最小0.350（Hre9），最大0.751（Hre11），平均值0.599。GENODIVE 計算的觀測雜合度在0.342（Hre9）至0.697（Hre7）之間，平均值為0.583；期望雜合度在0.303（Hre9）至0.709（Hre11）之間，平均值為0.567。POLYGENE 和GENODIVE 估算的遺傳多樣性很接近，顯示多樣性的估計值是可靠的。11 個位點中有9 個（除Hre2 和Hre11）顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，可能是多體遺傳或近交導(dǎo)致的。通過POLYGENE 和GENODIVE 估算了無翼坡壘3 個齡級的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，無翼坡壘在不同齡級的有效等位基因個數(shù)、多態(tài)信息含量、香農(nóng)指數(shù)、觀測雜合度以及期望雜合度上沒有顯著差異，遺傳多樣性水平基本相同（圖1）。

表2 Polygene version 1.2 中4 個多體遺傳模型的BIC 評分

圖 1 基于11 個SSR 標記的無翼坡壘3 個齡級的遺傳多樣性1. Polygene version 1.2 計算結(jié)果， 2. GenoDive 3.04 計算結(jié)果；I（幼齡），齡級II（中齡），齡級III（成熟齡）。

2.2 無翼坡壘的遺傳結(jié)構(gòu)無翼坡壘遺傳結(jié)構(gòu)的Structure 分析結(jié)果（圖2）顯示，delta K 在K =2 時取得最大值，故最優(yōu)K 值為2，即祖先種群由2 種遺傳組分構(gòu)成。3 個齡級的遺傳組成沒有明顯分化，均包含2 種組分，除少量個體是2 種組分的混合外，大部分個體只有單一遺傳組分（圖2）。為進一步分析3 個齡級的關(guān)系，根據(jù)Cavalli -Sforza（1967）的公式計算遺傳距離并構(gòu)建NJ 樹（圖3）。無翼坡壘3 個齡級的個體聚為兩大支，不

圖 2 STRUCTURE 分析的結(jié)果(a) 使用ΔK 方法確定最優(yōu)K 值。(b) K 取值2 到9 似然值的變化情況。(c) K = 2 時的聚類結(jié)果，每個豎條代表1 個個體，顏色的比例對應(yīng)于分配到2 種遺傳組分的后驗概率。

圖 3 基于Cavalli-Sforza (1967)遺傳距離的個體NJ 樹不同顏色的條形圖對應(yīng)STRUCTURE 中各遺傳組分的比例，數(shù)字為個體編號，Ind01- Ind21 對應(yīng)齡級I，Ind22-Ind41 對應(yīng)齡級II，Ind42- Ind59 對應(yīng)齡級III。

同齡級的個體分散在兩大支中，不同齡級之間未顯示出明顯分化，與Structure 的結(jié)果一致。PCoA分析的第1 主坐標（PC1）和第2 主坐標（PC2）分別解釋了29.44%和13.50%的變異，所有個體大致分為2~3 個遺傳組，每個遺傳組中均包含3 個齡級的個體（圖4）。PCoA的結(jié)果與Structure 和NJ樹的結(jié)果基本一致，進一步說明無翼坡壘齡級間的遺傳差異很小，隨著齡級增加，沒有出現(xiàn)遺傳組成的明顯變化。無翼坡壘低頻等位基因（0～0.100，0.101～0.200）的比例與經(jīng)歷瓶頸的坡壘種群相似，與未經(jīng)歷瓶頸的其他龍腦香科種群相比顯著減少[29]（圖5）。這種等位基因頻率分布的變形，低頻等位基因的喪失，是種群經(jīng)歷瓶頸的1 個特征， 表明無翼坡壘可能最近發(fā)生了種群規(guī)模的縮減，導(dǎo)致大量低頻等位基因丟失，因此，等位基因頻率分布出現(xiàn)偏移。

圖 4 基于Cavalli-Sforza(1967)弦距離的無翼坡壘主坐標分析(PCoA)

圖 5 無翼坡壘與坡壘[29]SSR 等位基因頻率的直方分布圖

3 討 論

遺傳多樣性對于物種進化和適應(yīng)有重要影響[44?45]。物種的遺傳多樣性水平越低，適應(yīng)環(huán)境的能力越差，滅絕的風(fēng)險越大[46]。一般認為，瀕危、特有和狹域分布的植物遺傳多樣性較低[47]。海南島的坡壘屬有坡壘和無翼坡壘2 種，WANG等[29]采集了10 個位于海南熱帶雨林國家公園內(nèi)不同地點的坡壘種群，利用12 對微衛(wèi)星標記評估坡壘的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，坡壘的期望雜合度（He）為0.409，與同屬其他瀕危種如狹葉坡壘（Hopea chinensis）（He=0.473）、H. odorata（He=0.392）[48]的遺傳多樣性水平相當(dāng)。然而，海南島無翼坡壘的期望雜合度的均值為0.567（GenoDive）或0.600（Polygene），明顯高于同域分布的坡壘（He=0.409）。無翼坡壘微衛(wèi)星位點的等位基因個數(shù)（Na=3.515， Ne=2.397）也比坡壘（Na=2.458， Ne=1.964）多。盡管伐木等干擾導(dǎo)致無翼坡壘數(shù)量減小，但因剩余個體較多，有效種群規(guī)模仍然較大，與零星分布、個體數(shù)量稀少的坡壘相比，無翼坡壘能夠維持相對更豐富的遺傳變異。當(dāng)然與非瀕危種H. dryobalanoides（He=0.67）[49]相比，無翼坡壘的遺傳多樣性仍是降低的。無翼坡壘與坡壘具有類似的微衛(wèi)星等位基因頻率分布，低頻等位基因的數(shù)量都顯著減少，顯示出清晰的瓶頸信號。綜上所述，無翼坡壘很可能經(jīng)歷了種群瓶頸，導(dǎo)致低頻等位基因大量丟失，遺傳多樣性降低。

不同齡級的無翼坡壘代表了不同時期的種群。成熟無翼坡壘存活的時間長，代表了較早時期的種群；中齡個體可能是干擾時期或干擾停止后產(chǎn)生的；而幼齡無翼坡壘是經(jīng)歷干擾后存活個體繁殖的年輕后代。因此推測成熟無翼坡壘的遺傳多樣性比中齡和幼齡的更高。然而3 個齡級的遺傳多樣性沒有明顯差異。這一結(jié)果的可能解釋是種群瓶頸持續(xù)的時間長，直至保護區(qū)建立人為干擾才得以消除，因此，目前處于成熟齡的無翼坡壘，其遺傳多樣性已經(jīng)遭到破壞，故沒有表現(xiàn)出比中齡與幼齡個體更高水平的遺傳變異?；谥髯鴺朔治龊拓惾~斯聚類的遺傳結(jié)構(gòu)分析也再次證實不同齡級的無翼坡壘不存在明顯的遺傳分化。考慮到微衛(wèi)星提供的進化信息有限，計劃將使用全基因SNP 變異數(shù)據(jù)進一步研究無翼坡壘瓶頸開始與結(jié)束時間，以及瓶頸強度[50]。

無翼坡壘瀕危的主要原因是長期的人為干擾導(dǎo)致種群規(guī)?？s小，遺傳變異大量喪失，適應(yīng)環(huán)境變化的能力減弱。另一方面，無翼坡壘果實無翅，傳播距離很短，使得幼苗密度大，競爭激烈，加上冠層遮擋，難以成長為成年個體。要保護無翼坡壘，實現(xiàn)長期存活，首先要恢復(fù)其遺傳多樣性，增加種群的進化適應(yīng)潛力。建議在就地保護的基礎(chǔ)上，進行遠距離個體雜交授粉，提高種苗的遺傳變異。同時進行遷地保護，增加無翼坡壘的生存地點，避免因偶然因素導(dǎo)致原生地種群破壞而引起物種滅絕。