椰子油對海南黑山羊羔羊瘤胃氫代謝、甲烷生成及相關(guān)酶活性的影響

施力光，張 雨，吳靈麗，劉 強，侯冠彧，周漢林*

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

我國是世界上碳排放量較多的國家之一，隨著聯(lián)合國大會“碳中和”目標(biāo)的提出，二氧化碳（CO）、甲烷（CH）等溫室氣體（GreenHouse Gas GHG）的減排受到越來越多的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計，在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域由反芻動物通過瘤胃發(fā)酵以噯氣和反芻等方式產(chǎn)生的CH約占到人類活動GHG 排放總量的五分之一，如能通過營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)降低反芻動物CH排放及飼料營養(yǎng)物質(zhì)損耗，無論在環(huán)境保護還是提高飼料利用率和動物生產(chǎn)性能等方面都具有積極意義。長期以來，大量研究聚焦于改變?nèi)占Z中飼料品質(zhì)或精粗料配比或直接在日糧中添加特異性化合物、生物制劑以調(diào)控反芻動物瘤胃甲烷的生成，添加油脂已成為較為通行的甲烷減排方法。Zhang 等在山羊日糧中添加玉米油，改善了瘤胃發(fā)酵特征并抑制了甲烷的生成；Judy 等在奶牛日糧中添加約2%的玉米油能降低奶牛瘤胃甲烷的生成；Patra等發(fā)現(xiàn)，椰子油可能通過改變瘤胃微生物區(qū)系，進而降低甲烷產(chǎn)生；Panyakaew 等在瘤胃體外產(chǎn)氣試驗中，推測富含中長鏈飽和脂肪酸的油脂參與生物氫化過程從而降低甲烷產(chǎn)生。目前油脂調(diào)控反芻動物瘤胃甲烷產(chǎn)生的機制說法仍不一致，且瘤胃發(fā)酵中間氫代謝的情況還鮮有報道，尤其在幼齡反芻家畜甲烷生成及氫代謝特征還未見研究。且前期研究發(fā)現(xiàn)，添加適量椰子油能提高初生羔羊生長性能。本試驗采用富含大量中短鏈飽和脂肪酸植物油脂的椰子油作為瘤胃發(fā)酵調(diào)控劑，重點探索椰子油對羔羊瘤胃發(fā)酵過程氧化還原態(tài)和中間氫代謝的影響，以期為營養(yǎng)調(diào)控反芻動物甲烷的生成提供試驗數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及日糧 選用24 只（公母各半）10 日齡、平均體重（2.05±0.16）kg 海南黑山羊羔羊（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所海南黑山羊種羊場），隨機分成4 組，每組6 個重復(fù)。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別添加4、6、8 g/d 椰子油（海南品椰品實業(yè)有限公司）。試驗羊日糧組成為代乳粉+精料+鮮王草，日糧組成成分及營養(yǎng)成分見表1。代乳粉（北京精準(zhǔn)動物營養(yǎng)研究中心，表2）經(jīng)溫水溶解后飼喂量為羔羊體重的2%，椰子油通過一次性注射器直接飼喂到羔羊口中，精料（種羊場自配）和鮮王草（表2）則按照50:50（干物質(zhì)基礎(chǔ)）提供給羔羊自由采食，自由飲水。每日（07:00、17:00）飼喂2 次，試驗期為60 d。

表1 精料原料組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 代乳粉及王草營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集和分析

1.2.1 瘤胃液的采集 各組羔羊于試驗期第58、59 天晨飼后2 h，使用瘤胃液采樣器收集瘤胃內(nèi)容物，4 層紗布過濾收集瘤胃液，分置于15 mL 離心管內(nèi)，現(xiàn)場測定pH 和氧化還原電位（pH 測定儀/氧化還原電位檢測儀，上海儀電雷磁PXSJ-216），剩余樣品-20℃保存待測其他指標(biāo)。

1.2.2 微生物蛋白（MCP） 參照熊文秀等測定方法進行部分改進，將瘤胃液超聲破碎15 min（功率400 W，超聲3 s，間隔5 s，工作40 次，重復(fù)2 次）后，按照總蛋白（TP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）推薦的步驟采用考馬斯亮藍法測定MCP 濃度。

1.2.3 瘤胃液溶解H（dH）、溶解CH（dCH）等測定 參照Wang 等使用的方法，先將不同個體固定體積的瘤胃液體外充N培養(yǎng)，氣相色譜法測定氣態(tài)H、CH，再根據(jù)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量進行測算。

1.2.4 瘤胃液氧化還原態(tài)指標(biāo)的測定 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+/NADPH）含量按照檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）提供的酸性堿性提取液分別提取瘤胃液中NAD+和NADH、NADP+/和NADPH，通過噻唑蘭（MTT）還原法，在570 nm 比色測定。NADH 氧化酶（NOX）活性測定按照試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）推薦方法將瘤胃液中NADH氧化為NAD，通過2,6 二氯酚靛藍（DCPIP）顯色，在570 nm 比色測定。

1.2.5 瘤胃液氫代謝相關(guān)酶活測定 乳酸脫氫酶（LDH）測定按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）推薦方法將瘤胃液中乳酸催化為丙酮酸，堿性條件下顯色，在440 nm 比色測定。蘋果酸脫氫酶（MDH）測定采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）按單位時間瘤胃液中MDH 的氧化還原活性速率通過340 nm 比色測定。琥珀酸脫氫酶（SDH）測定按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）推薦方法，將瘤胃液中黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）還原成還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），通過DCPIP 顯色，在600 nm 比色測定。PDH 測定采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）通過催化瘤胃液丙酮酸脫氫，DCPIP 顯色，在605 nm 比色測定。AADH測定按照ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）推薦的方法，通過HRP 標(biāo)記的羥酯酰輔酶A 抗原抗體復(fù)合物經(jīng)底物與TMB 顯色后，在450 nm 比色測定樣品與底物的顏色變化進行酶活性換算。

1.3 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 整理，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，進行Duncan's 多重比較，試驗結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 椰子油對羔羊瘤胃pH 和MCP 的影響 由表3 可知，在羔羊日糧中添加椰子油后，會改變瘤胃pH，其中添加4 g/d 和8 g/d 椰子油可提高瘤胃pH（<0.05）；添加椰子油不會對羔羊瘤胃發(fā)酵MCP 的濃度產(chǎn)生影響（>0.05）。隨著椰子油使用量的增加，羔羊瘤胃液中dH和dCH濃度下降（<0.05）。

表3 椰子油對羔羊瘤胃發(fā)酵和H2、CH4 代謝含量影響

2.2 椰子油對羔羊瘤胃氧化還原態(tài)的影響 如表4 所示，添加椰子油對羔羊瘤胃液中NAD+影響不顯著，對羔羊瘤胃液中NOX 活性也無顯著影響。NADH 濃度隨椰子油添加量增多呈上升趨勢，且6、8 g/d 椰子油NADH 濃度與對照組和4 g/d 差異顯著。添加椰子油對羔羊瘤胃液中NADP+和NADPH 濃度影響顯著，NADPH 隨著椰子油添加量增加而上升（<0.05），6 g/d 椰子油組NADP+濃度較對照組增加約20%。經(jīng)檢測，與對照組相比，瘤胃液氧化還原電位的變化隨著椰子油使用量的增加呈現(xiàn)出升高趨勢（>0.05）。

表4 椰子油對羔羊瘤胃氧化還原態(tài)參數(shù)的影響

2.3 椰子油對羔羊瘤胃氫代謝酶活性的影響 由表5 可見，6、8 g/d 椰子油組羔羊瘤胃液LDH 活性高于對照和4 g/d 椰子油組（<0.05）。與對照組相比，8 g/d椰子油組羔羊瘤胃液中PDH 活性為2.21 U/mL（<0.05），添加椰子油可增強羔羊瘤胃液中SDH 活性（<0.05），MDH 和AADH 活性未受椰子油添加影響（>0.05）。

表5 椰子油對羔羊瘤胃氫代謝酶活性的影響

3 討論

3.1 椰子油對羔羊瘤胃發(fā)酵特性的影響 反芻動物瘤胃微生物的發(fā)酵受瘤胃內(nèi)溫度、pH 和日糧組成等因素影響。瘤胃pH 作為評價瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的第一指標(biāo)，直接影響瘤胃內(nèi)微生物組成及發(fā)酵特性。在水牛和山羊體外瘤胃發(fā)酵中分別添加亞油酸和亞麻籽油可顯著降低發(fā)酵液pH，而在綿羊和肉牛體外瘤胃發(fā)酵葵花籽油或蘇子油對瘤胃pH 和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）無顯著影響。結(jié)合本研究前期在體內(nèi)外發(fā)酵模式下VFA 含量的變化趨勢，推測可能是由于隨著椰子油添加劑量的增加，造成瘤胃發(fā)酵乙酸比例降低，相對降低了乙酸丙酸比值，使羔羊瘤胃發(fā)酵向丙酸發(fā)酵模式轉(zhuǎn)變，一定程度上提高了瘤胃pH。

本試驗中不同處理組間瘤胃MCP 未受到椰子油的添加產(chǎn)生顯著變化。Shang 等、Vargas 等研究也表明，在奶牛日糧中、在體外模擬發(fā)酵試驗中分別使用大豆油、葵花籽油和魚油對MCP 無顯著影響。其原因是通過粗蛋白質(zhì)形式體現(xiàn)的瘤胃細菌和原蟲等菌體蛋白，其含量由細菌和原蟲的數(shù)量決定，基本保持穩(wěn)定，除非在微生物結(jié)構(gòu)或多樣性發(fā)生劇烈變化時MCP 才會出現(xiàn)改變。

反芻動物瘤胃微生物（主要是產(chǎn)甲烷菌）會通過氫營養(yǎng)途徑利用氫生產(chǎn)CH，對飼料的利用效率和環(huán)境都造成了不利影響。前期研究發(fā)現(xiàn)椰子油對甲烷的產(chǎn)生有顯著的抑制效果。本試驗主要關(guān)注瘤胃液中dH和dCH，其中dH不僅有影響瘤胃發(fā)酵VFA 的生物活性，還是瘤胃中甲烷形成的前體，添加椰子油后能夠顯著降低羔羊瘤胃液中dH，導(dǎo)致發(fā)酵途徑產(chǎn)生的H較少，從而降低乙酸濃度，提高了丙酸濃度。Wang 等在奶牛模型試驗中證明，dH與dCH呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)>0.58）。本研究中所測瘤胃發(fā)酵dCH也隨著椰子油添加量提高呈降低趨勢，尤其是6、8 g/d 椰子油均可顯著降低dCH，也解釋了前期體外試驗CH降低、瘤胃發(fā)酵特征變化的原因。

3.2 椰子油對羔羊瘤胃氧化還原態(tài)參數(shù)的影響 氧化還原電位（勢）作為反映瘤胃內(nèi)被氧化的分子和被還原的分子的比例的參數(shù)，與瘤胃pH 均能直觀判斷瘤胃發(fā)酵機能，在瘤胃發(fā)酵過程中隨著厭氧微生物發(fā)酵，瘤胃內(nèi)生長環(huán)境需要保持較低的氧化還原電勢。本試驗中羔羊瘤胃液中氧化還原電位在-285～-315 mV，隨著椰子油添加量增多呈升高趨勢，表明瘤胃的發(fā)酵特性受到影響。鄭超等在體外模擬發(fā)酵試驗中，增加通氣量會造成氧化還原電位的顯著提高；陳偉在不同消化底物的體外試驗中也檢測到了氧化還原電位的改變；Dijkstra 等報道，氧化還原電位與pH 呈負相關(guān)，與乳酸濃度呈顯著正相關(guān)。

NAD+/NADH 和NADP+/NADPH 作為機體每一種活細胞中都存在的兩對輔酶，在氧化還原態(tài)穩(wěn)定的維持過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。在瘤胃微生物發(fā)酵過程中，氧化還原反應(yīng)是大多數(shù)微生物產(chǎn)生能量的關(guān)鍵生化過程，NAD+能夠結(jié)合1 個H和2 個e轉(zhuǎn)換為還原態(tài)的NADH。通過影響氫離子供體或者NAD 前體，均能夠改變體外發(fā)酵培養(yǎng)液氧化還原狀態(tài)，而電子受體對瘤胃氧化還原狀態(tài)影響的相關(guān)研究還鮮有報道。本試驗中，添加椰子油改變了羔羊瘤胃液pH 和發(fā)酵特征，NADH 濃度則隨椰子油添加量增加呈顯著升高，但未檢測到NAD+濃度顯著變化，推測可能是因為椰子油中大量的中鏈飽和脂肪酸的代謝不是經(jīng)過丙酮酸的氧化脫羧直接代謝造成的。已有研究證實，厭氧微生物細胞發(fā)酵的途徑中單糖能被瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生丙酮酸，進而通過發(fā)酵乙酸產(chǎn)生乳酸這一途徑補充所需的NAD+；而NADH 則不能直接被氧化，只能通過NADH 脫氫酶的作用進行脫氫變成NAD+。van Lingen 等在肉牛瘤胃氣體、溶解代謝產(chǎn)物和菌群分析中發(fā)現(xiàn)，氫氣分壓增加會抑制NADH 氧化，這也可能是添加椰子油組羔羊瘤胃NADH 有顯著差異的原因。NADH 轉(zhuǎn)化為NAD另一個重要途徑是NADH 氧化酶NOX 的催化作用。陳偉研究發(fā)現(xiàn)，添加煙酸能提高培養(yǎng)液中NADH 濃度，NOX 酶活性也增加。本試驗中，每日添加6 g 以上的椰子油可顯著增加NADH 濃度，而對NOX 活性沒有影響，推測可能是因為NOX 催化NADH 具有明顯的底物偏好性，型的NADH 作為NOX 最適底物，會受到乳酸菌濃度的影響。

NADP+/NADPH 作為另一對氧化還原過程脫氫酶的輔酶，同樣是重要的遞氫體。Lewis 等研究發(fā)現(xiàn)，在氧化還原反應(yīng)體系中，還原的NADPH 比氧化的NADP+豐富10 倍，而NAD+/NADH 氧化還原對主要用于生物氧化，因此它在活細胞中的穩(wěn)態(tài)平衡有利于氧化的NAD+而不是NADH。NADPH 不能從細胞外來源獲得，而必須通過每個細胞內(nèi)NADP+的減少來產(chǎn)生。本試驗中，添加椰子油可顯著增加瘤胃液NADPH 濃度，一方面因為NADP+濃度隨著椰子油添加量增加而升高后，NADPH 還原性加強導(dǎo)致NADPH 濃度隨著椰子油添加劑量增加而顯著增加；另一方面NADH 可以通過糖酵解途徑利用NADP+和中間氫和2 個電子完成轉(zhuǎn)化，這也是本試驗中NAPH 和NADP+變化趨勢一致的原因。

3.3 椰子油對羔羊瘤胃發(fā)酵中間氫代謝的影響 瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌主要通過氫的氧化生成甲烷，其他瘤胃微生物也是通過高效的氫傳遞來降低瘤胃內(nèi)氫分壓（包括gH和dH）進而保障自身發(fā)酵功能的維持。乳酸、蘋果酸、丙酮酸等有機酸作為瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物，在各自對應(yīng)的脫氫酶作用下，實現(xiàn)分解和生成的平衡。丙酮酸可以通過LDH 催化生成乳酸，在此過程中需NADH 提供的H作為供體。Liu 等在熱應(yīng)激條件下，肉牛飼料中添加丙酮酸鹽后顯著增加了瘤胃LDH 活性和氧化還原酶活性；Rutherford 等研究表明，遠距離運輸后屠宰肉牛的瘤胃LDH 活性極顯著增加；楊艷研究分析認為，牛瘤胃發(fā)酵過程中高比值的NADH/NAD+使LDH活性大幅升高。本試驗結(jié)果也表明，添加6、8 g/d 椰子油后，NADH/NAD+比值高于對照組（約為3.7），LDH 活性也增加了50%以上，表明椰子油可影響瘤胃乳酸發(fā)酵途徑的氫傳遞過程。潘曉花等研究發(fā)現(xiàn)，在高精料奶牛飼養(yǎng)時添加硫胺素和羥基硫胺素能顯著增加體外發(fā)酵試驗PDH 活性。本試驗中，添加高劑量的椰子油后PDH 有顯著升高，結(jié)合前期瘤胃發(fā)酵試驗數(shù)據(jù)，瘤胃正常的發(fā)酵機能受到影響，產(chǎn)生了類似于高精料導(dǎo)致酸中毒的丙酮酸氧化脫羧反應(yīng)加強，添加椰子油可提高PDH 活性而減少丙酮酸的積累。MDH 是另一個能以NAD+和NADP+為底物進行氫傳遞的酶。Maeda等報道，牛發(fā)生瘤胃酸中毒反應(yīng)后，血漿LDH 和MDH 活性與應(yīng)激反應(yīng)呈正相關(guān)。本試驗中，MDH 活性未受到添加椰子油的影響，推測可能是因為NADP依賴型的MDH 通過CH-OH 基團形式進行氫傳遞的。

在調(diào)控瘤胃甲烷生成過程中，Tomkins 等研究發(fā)現(xiàn)，硝基化合物競爭結(jié)合氫生成氨，在體外發(fā)酵試驗中降低甲烷的排放量達90% 以上；Latham 等研究發(fā)現(xiàn)，使用硝酸鹽和某些短鏈硝基化合物可抑制SDH活性。本試驗檢測到SDH 活性隨著椰子油添加量的增加而顯著升高，是因為在反芻動物日糧中添加硝酸鹽通常會增加乙酸和乙酸鹽以及丙酸鹽濃度，椰子油也能造成乙酸丙酸濃度的顯著改變，可以考慮在添加椰子油的基礎(chǔ)上添加一定劑量硝基化合物，作為阻斷氫生成甲烷的新思路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，添加6、8 g/d 椰子油能降低羔羊瘤胃液中dCH和dH分壓濃度，使NADH、NADP+和NADPH 濃度顯著升高，LDH、PDH 和SDH 活性增強，改變瘤胃發(fā)酵中間氫的傳遞，從而抑制瘤胃CH的生成。