葛根提取物對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞生長性能和腸道屏障功能的影響

劉 陽，張 釗，郭雙雙，李 冰，滕 奕，鄧翠芳，丁斌鷹，易 丹

（武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（，CP）為芽孢桿菌科梭狀芽孢桿菌屬，屬于革蘭氏陽性菌，是一種厭氧病原微生物，最常見類型為由毒素致病的A型，可引起禽壞死性腸炎（Necrotic Enteritis，NE）和其他動物腸道疾病。1961 年，NE 首次被發(fā)現(xiàn)，該病主要防治的方法是在畜禽飼糧中添加抗生素，但抗生素的長期使用會導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌抗藥性和傳播性大大增加，威脅環(huán)境和食品安全。隨著飼料禁抗、養(yǎng)殖減抗的深入實施，NE 已成為家禽業(yè)的最大挑戰(zhàn)。因此，尋找出綠色安全、有效緩解畜禽腸道疾病負(fù)面影響的飼料添加劑尤為重要。

葛根提取物（Pueraria Extract，PE）中含有葛根素、大豆苷元、葛根皂苷、葛香豆雌酚以及甘露醇、5-甲基海因等活性成分。研究表明，PE 具有-腎上腺素受體阻斷、調(diào)節(jié)血管舒張收縮、緩解風(fēng)寒感冒癥狀及解酒護(hù)肝等藥理作用，還具有一定抗氧化、清除自由基能力，小劑量PE 能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，抑制瘤細(xì)胞DNA 表達(dá)。Wu 等研究表明，葛根素可改善感染PEDV 仔豬的腸道功能；Li 等研究證實，葛根素可減輕黏膜屏障功能障礙，增加黏蛋白（MUCIN-2 和MUCIN-4）水平和杯狀細(xì)胞數(shù)。當(dāng)前，PE 在大鼠、豬、奶牛上的研究較多，但在家禽中的研究較少。為此，本研究利用Du 等構(gòu)建的CP 感染肉雞模型，研究PE 對CP 感染肉雞生長性能、腸道組織形態(tài)和屏障功能相關(guān)基因表達(dá)的影響，探明PE 改善肉雞生長性能和腸道健康的作用效果，為PE 在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與基礎(chǔ)日糧 A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。試驗所用葛根提取物購于上海阿拉丁生化科技有限公司。基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2004）配制，其組成和營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗設(shè)計 選取264 只1 日齡健康的科寶肉雞母雛，采用2×2 雙因素設(shè)計，隨機(jī)分為對照組、CP 組、PE 組、PE+CP 組4 個處理，每個處理6 個重復(fù)（籠），每個重復(fù)11 羽，試驗期為30 d。試驗全期，對照組和CP組飼喂基礎(chǔ)飼糧，PE 組和PE+CP 組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加400 mg/kg PE。CP 組和PE+CP 組肉雞在18～23日齡連續(xù)灌服的A 型CP 新鮮菌液（1×10CFU/mL），每只雞每天灌服1 mL。同時對照組和PE 組肉雞灌服不含產(chǎn)氣莢膜梭菌的滅菌肉湯培養(yǎng)基1 mL。

1.3 飼養(yǎng)管理 肉雞網(wǎng)上平養(yǎng)，試驗前對雞舍和試驗所用設(shè)備進(jìn)行徹底消毒滅菌，雞舍熏蒸處理。肉雞進(jìn)行常規(guī)疫苗接種，自由采食和飲水，定期打掃雞舍并消毒。試驗溫度控制：第1 周32～34℃，溫度每周降低2～3℃，直到降至22℃，維持至試驗結(jié)束。雞舍濕度控制在50%～60%。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長性能 分別于試驗第1、17、23、30 天以重復(fù)（籠）為單位對試驗雞進(jìn)行空腹稱重（稱重前8 h 斷料不斷水），并計算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（FCR）。每天記錄各組肉雞的健康情況。

1.4.2 樣品采集 在試驗第23 天，每個重復(fù)隨機(jī)抽取2只雞，使用抗凝真空采血管進(jìn)行翅下靜脈采血，然后采用頸動脈放血法致死。血樣靜置30 min，在4℃條件下使用低溫高速離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min，取上清分裝于干凈的EP 管中，-80℃冷凍保存。無菌條件下打開腹腔，取十二指腸、空腸、回腸中段各1 cm 于預(yù)冷的4%多聚甲醛中固定。另取十二指腸、空腸、回腸中間部分（長約10 cm），剖開腸段后用預(yù)冷的無RNA酶水沖洗腸道內(nèi)容物，刮取腸黏膜，置于無RNA 酶離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測。

1.4.3 腸道形態(tài)測定 腸道組織固定樣送往武漢博士德公司生物工程有限公司進(jìn)行石蠟包埋，制作HE 染色切片。每張切片選擇10 個走向平直且相對完整的絨毛，在OLYMPSBX-41TF 型光學(xué)顯微鏡下對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，測量所選絨毛的絨毛高度（VH）及其對應(yīng)的隱窩深度（CD），并計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD），取10 根絨毛數(shù)據(jù)的平均值作為此切片的最終測量值。

1.4.4 血清二胺氧化酶（DAO）活力檢測 取分裝好的血清，按照檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）操作說明書檢測血清DAO 活力。

1.4.5 腸黏膜屏障基因mRNA 相對表達(dá)量的檢測 將十二指腸、空腸和回腸黏膜樣品于液氮中研磨，采用RNAiso Plus 試劑（TaKaRa，大連）提取各樣本的總RNA，并使用Nanodrop 測定所提取的RNA 濃度和純度。采 用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBRPremix Ex Taq試劑盒（TaKaRa，大連）在實時熒光定量PCR 儀（ABI 7 500，ThermoFisher Scientific，美國）上進(jìn)行基因表達(dá)測定。檢測的屏障功能相關(guān)基因為閉合蛋白（）、緊密連接蛋白-2（）、黏蛋白-2（）、黏蛋白-5ac（）和鈣粘附蛋白-E（）。以-為內(nèi)參基因，以對照組為參照，采用2-ΔΔCt 法計算各基因的相對表達(dá)量?；虻囊镉蓪毶锕こ蹋ù筮B）有限公司合成，基因引物序列見表2。

表2 基因的引物序列

1.4.6 血清IgA 及腸道分泌型IgA（sIgA）含量測定采用ELISA 方法檢測血清中IgA 和腸道sIgA 含量。試驗前使用ELISA 試劑盒（Chicken IgA ELISA Kit，Bethyl Laboratories，Cat No.E33-103）提供的Dilution Buffer（需從10× 稀釋至1×）對血清進(jìn)行稀釋處理，腸道組織樣品需勻漿后再進(jìn)行稀釋處理。樣品前處理完成后，按試劑盒提供的試劑及方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行測定，反應(yīng)終止后使用全自動酶標(biāo)儀（SpectraMax190，Molecular Devices，美國）在450 nm 波長下讀取樣品吸光值，使用ELISACalc 軟件選擇四參數(shù)方程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，根據(jù)吸光值計算出血清樣品中IgA 及腸道樣本中sIgA 的含量。樣品蛋白質(zhì)濃度按照蛋白定量測定試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所）檢測。

1.5 統(tǒng)計分析 除1～17 日齡生長性能數(shù)據(jù)采用單因素分析外，其他數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件中一般線性模型（GLM）進(jìn)行雙因素方差分析，當(dāng)差異顯著時，采用Duncan's 多重比較進(jìn)行分析。<0.05 為差異顯著，試驗結(jié)果用平均值與SEM 表示。

2 結(jié)果

2.1 PE 對CP 感染肉雞生長性能的影響 由表3 可知，添加PE 降低了1～17 日齡肉雞的ADFI（<0.05），而對1～17 日齡肉雞ADG、FCR 無顯著影響；添加PE 與CP 感染對18～23 日齡肉雞FCR 具有交互作用（<0.05）；與對照組相比，CP 感染提高了18～23 日齡肉雞FCR；與CP 組相比，添加PE 有抑制18～23 日齡肉雞FCR上升的趨勢（>0.05），對18～23 日齡肉雞ADG 和ADFI 無顯著影響；添加PE 對24～30 日齡肉雞ADG、ADFI 和FCR 均無顯著影響。

表3 PE 對CP 感染肉雞生長性能的影響

2.2 PE 對CP 感染肉雞血清DAO 活力和腸道組織形態(tài)的影響 由表4 可知，與非感染組相比，CP 感染和PE處理均提高了23 日齡肉雞血清DAO 活力（<0.05）。對于23 日齡肉雞腸道組織形態(tài)，CP 應(yīng)激增加了十二指腸CD，并降低了VH/CD（<0.05）。添加PE 和CP 感染對23 日齡肉雞十二指腸VH 和VH/CD、回腸VH 和VH/CD 具有交互作用（<0.05）：與對照組相比，CP 感染降低了23 日齡肉雞十二指腸和回腸VH、VH/CD（<0.05）；與CP 組相比，添加PE 有抑制23日齡肉雞十二指腸和回腸VH 和VH/CD 降低的趨勢（>0.05）。

表4 PE 對23 日齡CP 感染肉雞血清DAO 活力和腸道組織形態(tài)的影響

2.3 PE 對CP 感染肉雞腸道屏障基因表達(dá)的影響 由表5 可知，在第23 日齡，添加PE 和CP 感染對肉雞十二指腸、空腸、回腸和及回腸和的相對表達(dá)量具有交互作用（<0.05）：與對照組相比，CP 感染下調(diào)了十二指腸和空腸、的相對表達(dá)量（<0.05）；與CP 組相比，添加PE 抑制了其相對表達(dá)量的下調(diào)并回調(diào)至對照組水平，其中十二指腸的相對表達(dá)量高于對照組。與對照組相比，PE 組和CP 組下調(diào)了肉雞回腸和的相對表達(dá)量（<0.05），PE+CP 組和的mRNA 表達(dá)量高于其他3 組（<0.05）。

表5 PE 對23 日齡CP 感染肉雞腸道屏障功能基因相對表達(dá)量的影響

2.4 PE 對CP 感染肉雞免疫球蛋白含量的影響 由表6可知，與不添加PE 相比，飼糧中添加PE 提高了23 日齡肉雞血清IgA、十二指腸和空腸sIgA 含量（<0.05）。與非感染組相比，CP 感染顯低了23 日齡肉雞回腸sIgA 含量（<0.05）。

表6 PE 對23 日齡CP 感染肉雞血清IgA 和腸道sIgA 含量的影響

3 討論

3.1 PE 對CP 感染肉雞生長性能的影響 葛根主要提取物——葛根素是一種異黃酮類化合物，而黃酮類物質(zhì)能改善腸道健康、促進(jìn)動物生長。葛根作為藥食同源性物質(zhì)，已被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入飼料原料目錄，但其在肉雞生產(chǎn)上的應(yīng)用較少且研究結(jié)果不一致。劉博等研究發(fā)現(xiàn)，添加10 mg/kg 葛根總黃酮能提高AA 肉雞的生長性能。呂夢云研究表明，飼糧添加不同含量葛藤黃酮提取物可在一定程度上提高肉雞ADG，但差異不顯著。汪紀(jì)倉等研究表明，飼喂不同水平的葛根素對AA 肉雞生長性能無顯著影響。本試驗發(fā)現(xiàn)，在未感染期（1～17日齡）PE 顯著降低了肉雞的ADFI，改善肉雞FCR，從而提高肉雞生長性能。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，CP 感染降低了肉雞的ADG，提高了FCR。同樣，本研究也表明，在CP 感染期（18～23 日齡），CP 感染顯著增加了肉雞FCR，但飼糧中添加PE 可明顯抑制CP 感染導(dǎo)致的肉雞FCR 增加，表明PE 可一定程度上緩解CP 感染導(dǎo)致的肉雞生產(chǎn)性能下降。本研究發(fā)現(xiàn)，在CP 感染后期（24～30 日齡），PE 對肉雞ADG、ADFI 和FCR 等指標(biāo)均無顯著影響。因此，PE 可能對處于應(yīng)激狀態(tài)肉雞的生長性能具有積極作用。

3.2 PE 對CP 感染肉雞腸道形態(tài)和屏障基因表達(dá)的影響 正常生理條件下血清DAO 水平很低，但當(dāng)腸屏障受損時，腸屏障通透性增加，大量DAO 被釋放到血液。Wang 等研究表明，雞白痢沙門氏菌感染使肉雞血清DAO 活力在數(shù)值上升高，但差異不顯著。Lan和Wu等研究表明，熱應(yīng)激顯著增加了肉雞血清DAO 活性。因此，血清DAO 活性可作為監(jiān)測腸道通透性和屏障損傷的指標(biāo)。本試驗中CP 感染肉雞的血清DAO 活力顯著上升，表明CP 感染可使肉雞腸道通透性增強(qiáng)、屏障功能受損，與Liu 等的研究結(jié)果一致。有關(guān)PE 飼糧提高了肉雞血液DAO 活性的原因有待進(jìn)一步研究。

腸道健康對肉雞生長至關(guān)重要，腸道VH、CD 和VH/CD 是衡量腸道健康狀況的重要指標(biāo)。絨毛頂端的細(xì)胞功能成熟且活躍，在腸道健康程度較高時，小腸絨毛較高，隱窩較淺，此時小腸消化吸收功能較強(qiáng)；而當(dāng)絨毛變短，隱窩變深，表明腸道上皮細(xì)胞正迅速周轉(zhuǎn)，頂端上皮細(xì)胞減少，消化能力減弱。當(dāng)腸黏膜組織受損時，腸黏膜層會變薄、絨毛變短、絨毛表面積減少、隱窩變淺。Cheng 等研究表明，CP 感染會使肉雞十二指腸和空腸產(chǎn)生壞死性病變。Li 等研究也發(fā)現(xiàn)，CP 感染后肉雞腸道的VH 和VH/CD 顯著降低。本試驗中，CP 感染顯著增加了肉雞十二指腸CD 并降低了十二指腸和回腸VH 及VH/CD，表明CP 應(yīng)激導(dǎo)致肉雞腸道組織形態(tài)異常，誘導(dǎo)腸道損傷，與Cheng 等的研究結(jié)果相似，但損傷腸段略有不同，可能與CP 感染方式不同有關(guān)。Prihambodo 等分析表明，當(dāng)飼糧中添加黃酮類化合物時，隨著黃酮劑量的增加，十二指腸VH 顯著增加，且十二指腸和空腸VH/CD 也明顯提高。盡管本研究中CP 感染顯著降低了23 日齡肉雞十二指腸和回腸VH 及VH/CD，但日糧中添加PE 有增加23 日齡肉雞十二指腸VH 和VH/CD 的趨勢，表明PE 可能具有改善CP 感染腸道組織形態(tài)異常的作用。

腸道屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障組成，其中機(jī)械屏障又稱物理屏障，由上皮細(xì)胞和連接復(fù)合體組成，連接復(fù)合體由緊密連接（TJ）組成。TJ 蛋白是維持上皮細(xì)胞完整性的關(guān)鍵，包括OCCLUDIN、CLAUDIN、CADHERIN 連接、GAP 連接和橋粒等。而腸道屏障功能受損或腸道通透性增加會導(dǎo)致細(xì)菌移位和致敏化合物從腸道進(jìn)入機(jī)體，從而誘發(fā)免疫反應(yīng)，增加機(jī)體感染風(fēng)險。CLAUDIN 是構(gòu)成緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架蛋白，其中CLAUDIN-2 與細(xì)胞旁孔道形成有關(guān)，可使細(xì)胞旁路通透性增強(qiáng)。研究表明，CP 腸毒素（CPE）是一種具有細(xì)胞毒性的毒素，能直接將CLAUDIN 家族作為細(xì)胞表面受體附著。Saitoh等認(rèn)為，CPE 可與特定的CLAUDIN 結(jié)合，導(dǎo)致TJ的解體和細(xì)胞旁跨上皮細(xì)胞層的通透性增加。此外，Singh 等研究表明，在Caco-2 細(xì)胞單層中腸毒素與其受體（CLAUDIN）結(jié)合后，CPE 還可以與其他TJ（如OCCLUDIN）相互作用。Song 等研究表明，患壞死性腸炎的肉雞空腸Claudin-1、Claudin-4、和的表達(dá)顯著下調(diào)，表明CP 分泌的腸毒素是損傷腸上皮細(xì)胞緊密連接的主要誘因之一。本試驗中，CP感染顯著下調(diào)了回腸相對表達(dá)量以及十二指腸、空腸和回腸的相對表達(dá)量，飼糧中添加PE 能抑制十二指腸和空腸相對表達(dá)量的繼續(xù)下調(diào)，并使之回調(diào)至對照組水平，這表明飼糧中添加PE 可能通過特異性調(diào)控腸道表達(dá)緩解CP 感染對腸道造成的損傷；而添加PE 對回腸相對表達(dá)量的下調(diào)沒有抑制效果，可能與PE 作用的腸段位點有關(guān)。

E-cadherin 是黏著連接（AJ）中腸黏膜屏障的關(guān)鍵成分，對腸道通透性至關(guān)重要。Zhang 等試驗表明，-茶氨酸可以提高肉雞腸道中的mRNA表達(dá)水平。本研究中，CP 感染可顯著下調(diào)肉雞腸道的相對表達(dá)量，進(jìn)一步說明CP 感染可能誘導(dǎo)腸道通透性變化；而添加PE 抑制了十二指腸和空腸相對表達(dá)量下調(diào)，使感染組的相對表達(dá)量上調(diào)至對照組水平，表明飼糧中添加PE 能起到一定緩解作用。消化道黏蛋白（MUCIN）是消化道屏障主要成分。研究表明，MUCIN-2 的合成發(fā)生在杯狀細(xì)胞，該蛋白的缺乏會造成細(xì)菌易位和腸道炎癥。Gharib-Naseri 等研究表明，感染壞死性腸炎下調(diào)了肉雞相對表達(dá)量，但上調(diào)了相對表達(dá)量。Kitessa 等研究表明，CP 和艾美耳球蟲混合感染能顯著下調(diào)的相對表達(dá)量。本研究結(jié)果也表明，CP 感染有下調(diào)肉雞回腸相對表達(dá)量的趨勢，但添加PE 能抑制其下調(diào)并回調(diào)至對照組水平；添加PE 可顯著上調(diào)回腸的相對表達(dá)量，表明添加PE 能在一定程度上調(diào)控CP 感染肉雞基因表達(dá)。Wu 等通過熒光強(qiáng)度檢測試驗也表明，葛根素能增加在結(jié)腸組織中表達(dá)。因此，飼糧中添加PE可能通過調(diào)控腸道屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)，緩解CP感染造成的肉雞腸道損傷。

3.3 PE 對CP 感染肉雞屏障免疫的影響 IgA 通常分為血清型IgA 和sIgA。血清型IgA 具有多種抗體活性，能與抗原特異性結(jié)合，從而減少這些抗原誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)生；sIgA 是由分泌IgA 的漿細(xì)胞產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白，它能保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受病原體侵襲，對保護(hù)消化道黏膜具有重要作用。Zhang 等研究表明，大腸桿菌感染降低了肉雞空腸sIgA，并使腸道通透性增加，增強(qiáng)了大腸桿菌在腸細(xì)胞上的定植，導(dǎo)致腸道屏障功能紊亂。本研究也發(fā)現(xiàn)，CP 感染在數(shù)值上降低了血清IgA、空腸和回腸sIgA 含量，但差異不顯著。Jiang 等研究中，傳染性法氏囊病病毒（IBDV）也對血清IgA 含量沒有顯著影響；Kulkarni研究表明，腸道抗體反應(yīng)主要由IgY 主導(dǎo)，系統(tǒng)免疫產(chǎn)生的特異性IgY 比特異性IgA 更多，黏膜IgY 對CP 誘導(dǎo)的壞死性腸炎的免疫反應(yīng)更重要，而CP 蛋白對黏膜IgA 的反應(yīng)性較弱，表明免疫球蛋白水平的變化可能與感染的病原體不同有關(guān)。Zhang 等發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加染料木黃酮能抑制大腸桿菌感染導(dǎo)致的sIgA 降低，提高空腸sIgA 水平。Jiang 等也認(rèn)為，大豆異黃酮能增加感染IBDV 肉雞的血清抗體含量。因此，IgA 在宿主防御黏膜傳播的病原體中起重要作用，可阻止病原體與上皮細(xì)胞結(jié)合，中和它們的毒素以維持黏膜表面動態(tài)平衡。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PE 能顯著提高血清IgA 及十二指腸、空腸和回腸sIgA 含量，表明飼糧中添加PE 能有效提高肉雞黏膜免疫功能與防御能力。Peng 等試驗證實，飼糧中添加800 mg/kg 葛根素能提高IgA、IgM 和IgG 含量。本研究中，當(dāng)肉雞處于CP 感染應(yīng)激時，添加PE 一定程度上提高了血清IgA、十二指腸和空腸sIgA，表明PE 具有緩解CP 感染肉雞腸道免疫功能下降的積極效果。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，飼糧中添加PE 可抑制CP 感染肉雞FCR 的增加，改善了腸道組織形態(tài)，提高了肉雞免疫功能，并調(diào)節(jié)腸道屏障功能相關(guān)基因表達(dá)。