十二指腸灌注色氨酸對綿羊門靜脈血漿中褪黑素和色氨酸代謝產物濃度的影響

潘 軍，李鳳鳴，王彩蝶，李曉斌，張仕琦，張文杰，楊開倫*

（1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830035；2.阿克蘇職業(yè)技術學院，新疆阿克蘇 843000）

褪黑素（Melatonin，MT）在機體內具有調控睡眠、增強機體抗氧化能力、提高免疫力、抗菌抗炎、抑制腫瘤和癌細胞等廣泛的生物學作用。在畜牧生產中MT具有調控動物繁殖、提高動物產絨量和絨毛質量、提高蛋雞產蛋性能、降低奶牛體細胞數(shù)和乳房炎等作用。目前在畜牧業(yè)生產中主要通過改變飼養(yǎng)環(huán)境光照周期和時間，埋植、靜脈注射、腹腔注射MT及靜脈注射、腹腔注射、口服前體物質色氨酸（Tryptophan，Trp）等方式來提高動物機體MT 水平，眾多方法中口服或補飼Trp 可能是簡便易行的操作方法。不同動物補喂或口服不同水平Trp 是否能提高動物機體5-羥色胺（Serotonin，5-HT）的水平尚存在爭議。并且通過不同灌注模式給牛皺胃灌注50 mg/kg 體重（BW）的Trp，發(fā)現(xiàn)頸靜脈血漿和血清中5-HT 濃度存在較大差異。然而上述Trp 調控機體MT 的研究中測定的均是動物頸靜脈血中MT 濃度，頸靜脈血主要反映大腦和松果體中合成的MT 回流至頸靜脈中，大腦和松果體中MT 的合成具有明顯的晝夜節(jié)律性。前人研究表明，除松果體外，腸道中也含有大量MT，約為松果體中400 倍。然而腸道中MT 合成是否具有節(jié)律性，前體物質Trp 能否提高腸道MT 合成等問題仍需深入研究。本試驗旨在揭示Trp 對綿羊腸道MT 濃度的動態(tài)變化規(guī)律的影響，為畜牧業(yè)生產中通過飼喂Trp 的方式調控MT 提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料-色氨酸（新疆阜豐生物科技有限公司）的純度≥98%。

1.2 試驗時間和地點 試驗于2019 年11 月2 日至11月20 日在新疆昌吉惠康畜牧有限公司進行，試驗期間當?shù)厝粘鰰r間為08:50—09:05，日落時間為18:50—18:40，外界環(huán)境溫度為-2～8℃，圈舍內溫度為10～15℃。

1.3 試驗設計 選用4 只10～12 月齡、體重（37.92±1.35）kg的哈薩克綿羊母羊，先安裝十二指腸瘺管恢復2 個月后，再安裝肝門靜脈血管插管恢復15 d 后，按照自身對照試驗設計進行3 期灌注試驗，設為對照組（n=4）、1.2 g 灌注組（n=4）、4.8 g 灌注組（n=3）每天分別灌注含0、1.2、4.8 g/d 的Trp 生理鹽水溶液700 mL。灌注試驗按照從低濃度到高濃度的順序實施，每次同時用4 只羊灌注1 種濃度，用20 滴/mL 的輸液器改裝成灌注管，700 mL 灌注溶液每天分2 次灌注，每次灌注時長為（660±20）min，設置灌注速度為9.7 滴/min（即29.17 mL/min）。

1.4 飼養(yǎng)管理 試驗綿羊單欄飼養(yǎng)、自由飲水，參照NRC（2007）肉羊飼養(yǎng)標準配制試驗羊日糧配方，試驗羊日糧配方及營養(yǎng)成分見表1。試驗羊按照精粗比5:5 進行飼喂，每只羊每天飼喂精料為600 g/d（粗蛋白質20.48%）、苜蓿青干草為400 g/d（粗蛋白質15.62%）、麥秸為200 g/d（粗蛋白質為5.64%）。粗飼料粉碎至2～3 cm 并按比例混合，每天分別于08:00、20:00 飼喂，并同時進行十二指腸灌注，日糧采用定量飼喂方式進行飼喂，以保證每只羊采食30 min 后料桶無剩料。

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分（風干基礎）

1.5 指標測定 試驗連續(xù)灌注3 d，于第4 天用肝素鈉抗凝管采集試驗羊肝門靜脈全天08:00、09:00、10:00、11:00、12:00、13:00、14:00、17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、00:00、01:00、02:00、05:00 共16 個時間點血液，用離心機3 500 r/min 離心15 min，吸取上清血漿到2 mL 凍存管中，置于冰箱-20℃保存待測。試驗羊血漿中MT 和5-HT 由北京華英生物技術研究所用酶免法測定，酶聯(lián)免疫試劑盒為北京華英生物技術研究所產品，酶標儀為華衛(wèi)德朗DR-200BS。試驗羊血漿中Trp和犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）參照Zhang 等方法用高效液相色譜法測定，色譜柱為（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為15 mmol/L 醋酸鈉溶液和乙腈（95:5，v/v），犬尿氨酸測定波長和出峰時間為360 nm，4 min以內，色氨酸測定波長和出峰時間為278 nm，6 min 以內。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 進行整理，用SPSS 21.0 軟件對各組血漿中MT、5-HT、Trp、Kyn 進行比較均值的單因素ANOVA 分析，差異顯著者采用Duncan's 法進行多重比較。

2 結果

2.1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 的影響由圖1 可知，08:00 飼喂后和20:00 飼喂后，對照組綿羊門靜脈血漿中MT 濃度均有提高趨勢；4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中MT 濃度在17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、0:00、01:00 均高于對照組（<0.01）。由表2 可知，與對照組相比，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿MT 的總體均值低于對照組（>0.05），但4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體均值高于對照組（<0.01）。1.2 g灌注組綿羊白天門靜脈血漿中MT 濃度低于對照組和4.8 g 灌注組（<0.05），但4.8 g 灌注組綿與對照組差異不顯著。4.8 g 灌注組綿羊夜間門靜脈血漿中MT 濃度高于1.2 g 灌注組和對照組（<0.01），1.2 g 灌注組與對照組差異不顯著。由此說明，對照組綿羊門靜脈中MT 濃度沒有明顯的晝夜節(jié)律，采食會引起綿羊門靜脈MT 濃度提高，4.8 g 灌注組明顯提高了綿羊門靜脈血漿中MT 濃度和夜間門靜脈血漿MT 濃度。

圖1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 濃度的影響

表2 灌注不同劑量的Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 濃度的影響 pg/mL

2.2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響由圖2 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中5-HT 濃度表現(xiàn)為10:00—14:00 高 于21:00—05:00（<0.01），對 照組綿羊門靜脈血漿中5-HT 濃度沒有明顯的晝夜節(jié)律，白天飼喂后4 h 內有提高趨勢；4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中5-HT 動態(tài)時間點濃度在11:00、14:00、17:00、20:00、21:00、22:00、23:00、00:00、05:00 均高于對照組（<0.01）。與對照組相比，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體5-HT 濃度（>0.05）、白天5-HT 濃度均值（<0.05）、夜間5-HT 濃度均值（>0.05）均低于對照組。4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿總體5-HT 濃度、夜間5-HT 濃度均值均高于對照組（<0.01），白天門靜脈血漿5-HT 濃度與對照組差異不顯著。由此說明，對照組綿羊門靜脈中5-HT 濃度表現(xiàn)出白天飼喂后高于夜間，4.8 g 灌注組明顯提高了綿羊夜間門靜脈血漿中5-HT 濃度。

圖2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響

表3 灌注不同劑量的Trp 對綿羊血漿5-HT 的影響 ng/mL

2.3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 由圖3 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度無明顯的晝夜節(jié)律；飼喂Trp 后，無論白天和夜間都表現(xiàn)出綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度開始降低，在飼喂后4 h開始升高。由表4 可知，1.2 g 和4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Trp 總體濃度均高于對照組（<0.01），1.2 g灌注組綿羊門靜脈血漿白天和夜間Trp 濃度均值均高于對照組（<0.05），4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿白天和夜間Trp 濃度均值均高于對照組（<0.01）和1.2 g灌注組（>0.05）。白天和夜間門靜脈Trp 濃度均隨著灌注劑量的增加而增加，白天和夜間的門靜脈Trp 濃度無明顯差異。由此說明，通過十二指腸灌注Trp 能提高綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度，并且綿羊門靜脈血漿中Trp 濃度隨著灌注劑量的提高而隨之提高。

圖3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 的影響

由圖4 可知，對照組綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度無明顯的晝夜節(jié)律，在全天各個時間段變化幅度都不大。由表4 可知，1.2 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Kyn 總體濃度和白天Kyn 濃度均值均高于對照組（<0.05），夜間Kyn 濃度均值高于對照組（>0.05）。4.8 g 灌注組綿羊門靜脈血漿中Kyn 總體濃度、白天Kyn 濃度均值和夜間Kyn 濃度均值均高于對照組（<0.01）和1.2 g灌注組（<0.01）。對照組、1.2 g 和4.8 g 灌注組Trp和Kyn 濃度在白天和夜間均無明顯差異，門靜脈中Kyn 濃度變化規(guī)律與Trp 相同。由此說明，通過十二指腸灌注Trp 能提高綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度，且綿羊門靜脈血漿中Kyn 濃度也隨Trp 灌注劑量的提高而提高。

表4 灌注不同劑量的Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 μg/mL

圖4 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Kyn 的影響

3 討論

3.1 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿MT 的影響本試驗通過十二指腸灌注Trp 提高了4.8 g 灌注組門靜脈血漿中MT 濃度。Trp 是合成MT 的前體物質，Trp在動物機體中首先在色氨酸羥化酶（TPH）的作用下轉化成5-羥基色氨酸（5-HTP），因此TPH 在腸道和松果體分布和表達量可能是影響松果體和腸道MT 合成的主要因素。通過靜脈注射、口服前體物質Trp均能提高動物頸靜脈血液中MT 水平。然而關于增加機體Trp 劑量對人和動物門靜脈血漿中MT 的研究極少，大多數(shù)研究集中在對機體頸靜脈血漿MT 濃度的變化。Ma 等給山羊灌服瘤胃保護性Trp，提高了山羊血清中MT 水平，并且夜間血清MT 水平顯著高于白天。Paredes 等給斑鳩飼喂125、300 mg/kg BW 的Trp均能提高白天和夜間斑鳩翅下靜脈血清中MT 水平，并且夜間血清中MT 水平明顯高于白天。但Herichová 等給雞飼喂150 mg/kg BW 的Trp 提高了白天松果體中MT 水平，而白天和夜間血漿中MT 水平卻沒有明顯變化。Sánchez 等給大鼠服喂125 mg/kg BW 的Trp 不僅能刺激MT 合成，并且能提高MT 峰值和促進峰值提前。但是，Esteban 等給大鼠服喂300 mg/kg BW 的Trp 僅提高了夜間血漿MT 水平，而白天血漿MT 水平降低。以上結果表明，Trp 調控動物機體MT 合成在不同品種動物之間存在一定差異，不同Trp 劑量水平對動物白天和夜間血液中MT 濃度的影響也不相同，動物血液中MT 濃度并沒有隨著Trp 劑量的增加而呈現(xiàn)出增加趨勢或降低趨勢，這一結果與本試驗門靜脈結果具有相似性。

肝門靜脈匯集胃、脾臟、胰腺和腸道靜脈進入肝臟的血液，能直接反映腸道吸收營養(yǎng)物質進入腸系膜靜脈并最終匯入門靜脈的情況。Huether 等給大鼠口服300 mg/kg BW 的Trp 同時結扎大鼠的門靜脈，大鼠外周循環(huán)血液中MT 的提高幅度顯著降低，此外大鼠灌服Trp 后10、20 min 門靜脈血漿中MT 水平均約為頸靜脈血漿MT 水平的4 倍，由此說明灌注Trp 在腸道中能迅速合成大量的MT。本試驗中，1.2 g 組和4.8 g 組灌注劑量分別為32 mg/kg BW 和126 mg/kg BW，1.2 g灌注組門靜脈MT 濃度顯著低于對照組，但4.8 g 灌注組門靜脈MT 濃度顯著高于對照組，約為對照組的1.5倍。這種差異一方面可能與灌注劑量、灌注模式有關；另一方面可能與Kyn 合成反應中關鍵控制酶色氨酸2,3-雙加氧酶（Tryptophan 2,3-Dioxygenase，TDO）和吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine 2,3-Dioxygenase，IDO）競爭共同底物Trp 有關，最終導致MT 合成途徑Trp 代謝產物減少。本試驗中，1.2 g 灌注組門靜脈白天MT 濃度低于對照組，夜間與對照組無顯著差異，白天灌注后MT 濃度較低與TDO 和IDO 競爭底物濃度有關，可能還與灌注初期未達到該2 種酶的飽和度也有關；而夜間門靜脈血漿MT 濃度高于白天且與對照組無顯著差異，可能與夜間大腦和松果體中合成了大量MT，導致整個機體血液循環(huán)系統(tǒng)中MT 濃度升高有關。Bubenik 等研究發(fā)現(xiàn)，豬門靜脈血液中MT 濃度比肝動脈和后腔靜脈高，門靜脈血液MT 濃度的升高與采食有關，而與光周期無關，門靜脈血液MT 濃度無晝夜節(jié)律性。本試驗也顯示，對照組綿羊門靜脈血液MT 濃度無晝夜節(jié)律性。

3.2 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿5-HT 的影響 5-HT 作為大腦的神經遞質，參與了大腦中許多功能，Trp 是合成5-HT 和MT 的前體物質。Mateos 等給大鼠連續(xù)7 d 口服125 mg/kg BW 的Trp，提高了大鼠白天和夜間頸靜脈血漿中5-HT 水平。本試驗中，4.8 g 灌注組也提高了門靜脈血漿5-HT 濃度。同時，Trp 會引起動物大腦5-HT 水平的顯著升高。松果體中5-HT 含量具有白天多夜間少的晝夜節(jié)律性，并且在夜間早期5-HT 濃度存在急劇增加的現(xiàn)象。但本試驗結果顯示，門靜脈血漿5-HT 均值在白天顯著高于夜間，4.8 g 灌注組增加了綿羊夜間門靜脈血漿中5-HT 濃度，但是表現(xiàn)出高低起伏的波動變化。Esteban 等認為，口服Trp 后會增加夜間MT 的合成，而合成MT 的底物5-HT 也會增加。門靜脈5-HT主要來源于腸道。Gershon 等報道，腸道黏膜嗜鉻細胞中含有大量5-HT，認為在腸道中亞型腸道嗜鉻細胞和血清素激活神經元合成了5-HT。此外，不同的灌注模式也會影響5-HT 濃度。每天1 次或2 次灌注同等劑量的Trp 均顯著提高了牛頸靜脈血清中5-HT 濃度，但對血漿中5-HT 濃度無提高趨勢，24 h 持續(xù)灌注Trp 對頸靜脈血清和血漿中5-HT 濃度提高幅度非常有限。本試驗中，1.2 g 灌注組綿羊Trp 灌注量為32 mg/kg BW，灌注方式也是24 h 持續(xù)灌注，各個時間點門靜脈血漿中5-HT 濃度與對照組相比不僅無提高趨勢，反而低于對照組。機體攝入的Trp 除了用于合成蛋白質外，其余Trp 約95% 經Kyn 途徑代謝，Trp 轉化形成Kyn 過程的第一步反應也是關鍵性控制步驟由TDO 和IDO 催化完成，TDO 和IDO 的活性會隨著Trp濃度的增加而提高，TDO 和IDO 活性的提高會促進Kyn 合成的增加，Kyn 合成增加會與5-HT 合成途徑競爭相同的底物Trp，最終導致5-HT 的合成減少。因此，機體中Trp 濃度只有超過了TDO 和IDO 的飽和度，額外的底物才會用于合成5-HT。本試驗中，白天開始灌注Trp 后1～4 h，1.2 g 和4.8 g 灌注組血漿中5-HT 濃度均低于對照組，可能與灌注初期未達到TDO和IDO 飽和度有關。

3.3 灌注不同劑量Trp 對綿羊門靜脈血漿Trp 和Kyn 的影響 Trp 在動物體內的分解代謝主要有Kyn、吲哚乙酸、5-HT 和MT 共4 條途徑，其中3 條途徑都分解成為小分子物質。在成年哺乳動物中，機體攝入的Trp主要在肝臟中經Kyn 途徑代謝（約95%），1%～2%在小腸中經5-HT 途徑轉化成MT，2%～3%在腸道和肝臟中轉化成吲哚乙酸。在本試驗中，增加綿羊腸道中Trp 劑量，綿羊門靜脈中Trp 和Kyn 的濃度也增加，并且隨著Trp 灌注劑量的增加，綿羊肝門靜脈血漿中Trp和Kyn 濃度在白天和夜間均呈現(xiàn)出增加的趨勢。給荷斯坦牛皺胃灌注Trp 的研究結果也顯示，其頸靜脈血漿和血清中Trp 和Kyn 濃度變化具有相似性，Trp 和Kyn濃度隨著單次灌注劑量的增加而增加。本試驗再次證明了Kyn 是Trp 的主要代謝產物，并由此說明Trp在綿羊腸道中大量被吸收，Kyn 大量被合成，且與晝夜節(jié)律無關。肝臟有合成Kyn 的所有酶，90%的Kyn 在肝臟中合成，5%～10% 的Kyn 在肝臟外的其他組織中合成。從本試驗門靜脈中Kyn 濃度可以看出，合成Kyn 的酶不僅存在于肝臟，在腸道中也存在。

4 結論

本研究結果表明，綿羊門靜脈血中MT 的濃度呈現(xiàn)出白晝低、夜間和凌晨高的變化規(guī)律，白晝期間的濃度與采食有關，5-HT 濃度的變化規(guī)律與MT 相似；Trp灌注量為4.8 g 時顯著提高了夜間綿羊門靜脈血MT 和5-HT 濃度；綿羊門靜脈血漿中Trp 和Kyn 濃度均隨著Trp 灌注劑量的增加而提高。