多浪羊GnRHR 基因克隆、初情期組織表達研究及生物信息學分析

張繼虎，隋志遠，李慶瑾，張志帥，邢 鳳*

（1.塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

初情期是動物初次發(fā)情并排卵的時期，,也是繁殖能力開始的時期。下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-pituitary-gonad Axis，HPG 軸）在 初情期的啟動過程中發(fā)揮著重要作用，其中初情期開始的標志是下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）的脈動性分泌刺激垂體促性腺激素細胞中基因的表達。垂體GnRHR 和GnRH 結合可激活下游的幾個信號級聯，包括肌醇1,4,5-三磷酸、絲裂原活化蛋白激酶、二酰甘油和腺苷酰環(huán)化酶途徑，促使促黃體生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的合成與釋放。FSH 和LH 能夠作用于性腺，使得性腺釋放各類類固醇激素，從而使動物生殖器官開始發(fā)育直至成熟。具有7 個跨膜結構，還具有一個胞外氨基末端和一個胞內COOH末端，是典型的G 蛋白偶聯受體家族成員。自從在大鼠垂體中克隆得到第1 個后，許多物種GnRHR 也被成功克隆，其中包括鴨、雞、牛蛙、紋狀壁虎、黑鱸和蟹等動物。

多浪羊具有肉質好、初情期來臨早等優(yōu)點，是生產羔羊肉的理想品種，國內外少有對多浪羊初情期基因及TA 克隆表達等相關的研究報道。因此，本研究利用克隆測序、生物信息學分析和實時熒光定量PCR 的方法，對多浪羊基因的CDS 序列進行克隆、分析以及測定初情期前、初情期和初情期后HPG 相關組織的表達量，為研究基因的功能和進一步闡明GnRHR 如何影響綿羊初情期的啟動過程提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 于新疆麥蓋提縣良種多浪羊繁育中心，采用公羊試情法（每天10:00、18:00 2 次試情）和外陰觀察法，選取初情期前（90 日齡）、初情期（第1 次發(fā)情4～6 h 內）和初情期后（初情期結束10 d 后）的多浪羊各5 只，取適量上述多浪羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管5 種組織，無菌手術剪剪碎后放入凍存管中，迅速置于液氮中保存，并盡快轉移至-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑 DNA Marker2000、膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；PMD-19T 購自大連寶生物工程有限公司；反轉錄試劑盒、qPCR 試劑盒、DH5感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；藍白斑試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 多浪羊RNA 提取與cDNA 合成 利用Transzol 法提取組織RNA，提取后的RNA 利用核酸蛋白檢測儀檢測濃度。檢測合格后，統一濃度進行反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.4 引物設計及基因的克隆 從GeneBank 上找到綿羊基因的mRNA 序列（登錄號為：NM_001009397.1），根據Primer Premier 6.0 設計基因克隆的引物（表1）。PCR 反應體系：9.5 μL ddHO，12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，1 μL Primer-F（5 nmol/μL）、1 μL Primer-R（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反應總體系為25 μL。反應條件：95℃，3 min；95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min；重復35 個循環(huán)；72℃，5 min；4℃保存。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠檢測后，做膠回收純化處理并與PMD-19T 載體連接，連接后在16℃條件下反應30 min。取反應好的連接產物5 μL 與100 μL DH5感受態(tài)細胞混合，冰浴30 min 后，42℃條件下熱激90 s，然后快速轉入離心管中冰浴。隨后加入400 μL 不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，進行搖床復蘇，條件為37℃，225 r/min，90 min。待溶液變渾濁后，4 000 rpm 離心5 min，棄掉適量上清液，將剩余菌液均勻鋪在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，放置30 min。將培養(yǎng)皿倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。通過藍白斑試劑挑選重組子后進行PCR 擴增，合格菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序。利用測序獲得的序列設計熒光定量PCR 引物，以為內參基因。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 多浪羊GnRHR 克隆及熒光定量PCR 引物

1.5 實時熒光定量PCR 以多浪羊cDNA 為模板，利用實時熒光定量PCR 檢測各組織中的表達量。反應體系：5.5 μL ddHO，7.5 μL 2×Transtant qPCR Mix 上下游引物各0.5 μL（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反應總體系為15 μL。反應條件：95℃，2 min；95℃，15 s；55℃，15 s；68℃，20 s，重復反應40 次。

1.6 統計分析 采用2法計算得到的CT 值，使用SPSS 24.0 分析差異是否顯著。>0.05 表示差異不顯著，<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1基因的克隆 多浪羊基因通過PCR 擴增后，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）?？梢钥闯?，在1 170 bp 處有明顯的單一特異DNA 條帶，條帶大小符合預期，證明已成功擴增出了多浪羊基因的CDS 序列。將得到的序列通過BLAST對比發(fā)現，多浪羊基因的CDS 序列與綿羊的同源性為99.90%。

圖1 多浪羊GnRHR 基因PCR 產物

2.2 同源序列對比及進化樹構建 通過NCBI 分別獲取犬（登錄號：NP_001003121.1_1）、雞（登錄號：NP_001012627.1_1）、牛（登錄號：XP_005208079.1_1）、綿羊（登錄號：NP_001009397.1_1）、小鼠（登錄號：NP_001297580.1_1）、人（登錄號：NP_000397.1_1）的CDS 序列，利用MEGA 7.0 構建進化樹（圖2）。結果顯示，多浪羊與綿羊的親緣關系最近，同源性為99.90%，其次是牛，同源性為95.71%。

圖2 同源進化樹構建圖

2.3 GnRHR 蛋白生物信息學分析

2.3.1 GnRHR 蛋白理化性質預測分析 利用ExPASy軟件預測多浪羊GnRHR 蛋白的親水性和疏水性（圖3）及其理化性質，發(fā)現第68 位的谷氨酸（Glu）親水性最強，親水性分值為-3.589；第225 位的亮氨酸（Leu）疏水性最強，疏水性分值是3.300。GnRHR 氨基酸親水性/疏水性分布圖可以看出GnRHR 蛋白序列中疏水性的氨基酸區(qū)域多于親水性區(qū)域（圖3），疏水性總平均值為0.355，表明多浪羊GnRHR 屬于疏水蛋白。ExPASy 預測得出多浪羊GnRHR 蛋白的化學式為CHNOS；等電點為9.23；存在16 個帶負電殘基（天冬氨酸+谷氨酸）和26 個帶正電殘基（精氨酸+賴氨酸）；其N 末端氨基酸為蛋氨酸（Met），穩(wěn)定指數為32.28，屬于穩(wěn)定蛋白。

圖3 GnRHR 蛋白疏水性/親水性預測

2.3.2 多浪羊GnRHR 蛋白二級結構和三級結構預測 由圖4 可知，GnRHR 蛋白二級結構主要由-螺旋和無規(guī)卷曲組成，分別為38.41%和32.93%，其余結構為延伸鏈和-轉角，分別為26.52%和2.13%。利用PHYRE2在線軟件，預測分析多浪羊GnRHR 的三級結構（圖5），該結構基于c4djgA 模板進行建模。

圖4 多浪羊GnRHR 蛋白二級結構預測圖

圖5 多浪羊GnRHR 蛋白三級結構預測圖

2.3.3 GnRHR 蛋白結構域及跨膜區(qū)域預測分析 由圖6可知，多浪羊GnRHR 蛋白存在1 個低復雜度區(qū)域和7個跨膜區(qū)域。預測到多浪羊GnRHR 蛋白氨基酸序列從第22 位到第33 位為低復雜度區(qū)域；存在7 個跨膜結構，分別位于第39 到第58 位、第79 到101 位、第116 到第137 位、第158 到第180 位、第209 到第231 位、第270 到292 位、第307 到326 位氨基酸。由圖7 可知，GnRHR 蛋白存在7 個跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域起始位置與SMART 軟件預測序列一致。

圖6 多浪羊GnRHR 蛋白結構域預測圖

圖7 多浪羊GnRHR 蛋白跨膜預測圖

2.3.4 GnRHR 蛋白磷酸化位點預測分析 由圖8 可知，多浪羊基因編碼產物存在11 個絲氨酸、15 個蘇氨酸和1 個酪氨酸的潛力值大于閾值，表明多浪羊GnRHR 有26 個磷酸化位點。

圖8 多浪羊GnRHR 蛋白磷酸化位點預測圖

2.4基因初情期不同組織中的表達 通過實時熒光定量PCR 方法對基因在多浪羊下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管5 種組織中的表達進行檢測（圖9）。結果顯示，基因在初情期前、初情期和初情期后3 個時期中，5 種組織均有表達，其趨勢均為初情期時升高，初情期后開始降低?；蛟诙嗬搜? 個時期中均為垂體和卵巢中高表達，下丘腦、子宮和輸卵管中低表達。初情期前基因在垂體中表達量相對較高，顯著高于下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管；進入初情期時，垂體和卵巢中表達量最高，極顯著高于其他組織；初情期后垂體和卵巢相對表達量仍然較高，顯著高于其他組織。多浪羊垂體基因初情期時表達量極顯著高于初情期前和初情期后；初情期時卵巢中表達量顯著上升，初情期后卵巢中相對表達量開始下降，但并不顯著；初情期時下丘腦、子宮和輸卵管中表達量呈上升趨勢，但差異并不顯著。

圖9 不同組織各時期GnRHR 相對分泌量

3 討論

本研究克隆出多浪羊基因CDS 序列，對其進行同源比較以及構建進化樹發(fā)現，與綿羊的同源性最高，其次是牛，說明GnRHR 符合生物進化的特點，反映了進化過程中DNA 序列差異的功能限制。綿羊基因由3 個外顯子和2 個內含子組成，CDS 序列全長987 bp，編碼328 個氨基酸，是一個單一的拷貝基因。生物信息學分析顯示，多浪羊GnRHR 分子式為CHNOS，等電點為9.23，為堿性蛋白，與榕江小香羊GnRHR 蛋白CHNOS、等電點為9.39 相差不大，同屬于堿性蛋白；穩(wěn)定指數為32.51，其N 末端的蛋氨酸主要起到穩(wěn)定作用，屬于穩(wěn)定蛋白；疏水性總平均值為0.355，屬于疏水蛋白，其疏水性有利于該蛋白向內折疊生成穩(wěn)定的二級結構（主要是生成-螺旋以保證其穩(wěn)定性或者為跨膜蛋白），進而生成特定的空間構象和三級結構以發(fā)揮其作用。軟件分析顯示該蛋白最主要的二級結構是-螺旋，為39.94%，同時利用軟件預測到該蛋白存在7 個跨膜結構，且預測其功能域時發(fā)現存在7 個跨膜區(qū)域，表明該蛋白屬于跨膜蛋白，與榕江小香羊GnRHR 蛋白跨膜區(qū)域一致，這與該蛋白為疏水蛋白相符合；該蛋白含有26個磷酸化位點，可能成為蛋白激酶和磷酸酶的修飾位點，在調節(jié)細胞內通路的過程中發(fā)揮著重要作用。

通路能夠促進促性腺激素的合成與分泌，在動物初情期的啟動過程中發(fā)揮著重要的作用，其中基因是重要的介導者和組成部分。作為整合中心的下丘腦能夠產生脈動性GnRH 刺激垂體細胞基因表達，激活早已經建立好的垂體-性腺軸。進入初情期的牦牛血清中GnRH 含量極顯著高于伐情期的牦牛且在24 h 內有明顯的3 個峰值，同時Kadokawa 等證明哺乳動物的GnRHR 聚集在促性腺激素的表面，并且隨著GnRH 濃度的升高而增加，表明哺乳動物初情期時GnRH 能夠以脈沖的方式刺激垂體細胞基因從而發(fā)揮作用。初情期垂體分泌的LH 和FSH 隨血液循環(huán)到達卵巢，促進卵泡發(fā)育和完善卵巢功能，刺激卵巢分泌雌激素，從而使動物表現出第1 次發(fā)情和排卵。雌激素能夠直接作用于垂體，也可通過其正反饋過程中增加的GnRH 促使基因表達。與的相互作用能夠刺激對性腺功能有至關重要作用的促性腺激素合成與分泌，在初情期啟動過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，通過使用藥物，能夠調控基因的表達，從而調節(jié)人進入青春期和小鼠進入初情期的時間。Howard發(fā)現基因發(fā)生突變能夠阻礙性腺發(fā)育，造成繁殖障礙。本研究采用熒光定量PCR 的方法檢測了初情期和初情期前后3 個時期多浪羊基因在HPG 軸相關組織的相對表達量，結果顯示基因在垂體中高表達，且初情期時表達量最高，與前人研究結果一致；但與甘家藏綿羊發(fā)情后期卵巢中表達量最高不一致，推測原因可能是不同時期基因表達存在差異。卵巢是除垂體外表達最高的組織，與小鼠卵巢和卵巢顆粒細胞中存在mRNA 的結果一致，同時也表明在初情期時對卵巢發(fā)揮其功能具有重要作用。龍威海等對不同品種山羊在不同組織中的表達情況進行了檢測，發(fā)現黔北麻羊、貴州白山羊和小香羊垂體組織中表達量最高，在下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管中均有表達，與本實驗研究結果一致；貴州黑山羊下丘腦組織中表達量最高，推測不一致原因為不同物種不同環(huán)境下能夠影響基因表達。在HPG 軸相關組織初情期及初情期前后不同時期均有表達且表達量具有差異，說明基因對綿羊初情期的啟動以及生殖系統的發(fā)育完善和維持正常的繁殖活動密切相關。

4 結論

本研究通過克隆獲得了多浪羊基因的CDS序列，該序列長987 bp，編碼328 個氨基酸。生物信息學顯示該蛋白為疏水蛋白，屬于穩(wěn)定蛋白，存在7 個跨膜區(qū)域，有26 個潛在磷酸化位點。利用實時熒光定量PCR 的方法，發(fā)現多浪羊基因在垂體中表達量最高，其次為卵巢，在HPG 軸相關組織中均有表達，表明基因在多浪羊初情期啟動的過程中發(fā)揮著重要的作用。