肉牛DKK3 基因3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建及與miR-25 的靶向驗(yàn)證

張 鳳，陳明新

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064）

Wnt 蛋白是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌和旁分泌方式在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程中發(fā)揮作用，是一種重要的信號(hào)調(diào)節(jié)分子。按細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞鏈的不同，Wnt 信號(hào)通路又主要分為3 個(gè)分支：Wnt/-catenin通路、Wnt/Ca通路和Wnt/polarity 通路，其中Wnt/-catenin 通路是經(jīng)典的Wnt 信號(hào)通路。Prestwich等研究發(fā)現(xiàn)Wnt/-catenin 信號(hào)通路是脂肪生成的開關(guān)，在脂肪細(xì)胞成脂分化過程中起關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。DKK3（Dickkopf-3）是屬于DKK 蛋白家族的一種分泌型糖蛋白，通過調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，是Wnt/-catenin 信號(hào)通路的抑制劑。Xie 等研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪肝患者和肥胖小鼠的肝臟組織中以及體外培養(yǎng)的經(jīng)棕櫚酸刺激的肝臟細(xì)胞中，的表達(dá)量都顯著降低；此外，通過在肝臟細(xì)胞中過表達(dá)和抑制表達(dá)，證實(shí)可能通過抑制活性阻礙下游p38/JNK 通路激活的方式抑制肥胖、胰島素抵抗和肝臟脂肪變性。郭進(jìn)磊研究顯示基因多態(tài)性與中國黃牛品種之一南陽牛的經(jīng)濟(jì)性狀之間存在顯著關(guān)聯(lián)，提示基因可能影響肉牛的脂肪發(fā)育。

microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的長度為22 nt左右的單鏈非編碼RNA 小分子，是非編碼RNA 家族成員之一。盡管miRNAs 種類不同，但它們?cè)谏锵到y(tǒng)中發(fā)揮功能的機(jī)制基本一致，通常表現(xiàn)為結(jié)合到靶基因3'非編碼區(qū)（3'UTR），抑制靶基因翻譯或降解靶mRNA，從而降低靶基因的表達(dá)水平，影響基因發(fā)揮應(yīng)有的功能。成千上萬的miRNAs 已被確認(rèn)參與諸多生物學(xué)過程，比如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和新陳代謝等，故而miRNAs 對(duì)靶基因的調(diào)控研究是非常值得關(guān)注的領(lǐng)域。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p 可顯著降低小鼠C2C12 細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量；此外，miR-25-3p 也可靶向肉?；?'UTR，而基因可顯著提高肉牛肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞脂肪生成。另有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-25-3p 可通過靶向抑制DKK3 而激活Smad3 和纖維化相關(guān)基因的表達(dá)以增強(qiáng)心臟纖維化；miR-25-3p 也可通過靶向DKK3 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。但miR-25-3p 是否靶向?；蜻€未可知。

本實(shí)驗(yàn)擬利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)bta-miR-25 的靶基因是否包含基因，并初步劃定bta-miR-25與肉牛的結(jié)合位點(diǎn)位置；通過構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，測(cè)定雙熒光素酶活性試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合位點(diǎn)的可靠性；牛腎細(xì)胞（MDBK）中過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-25，研究miR-25 對(duì)基因表達(dá)的影響。通過上述工作，明確miR-25 對(duì)肉?；虻陌邢蛘{(diào)控作用，為今后進(jìn)一步開展miR-25 調(diào)控肉牛肌內(nèi)脂肪生成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MDBK 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)武大細(xì)胞庫；Taq PCR Mix 購自Thermo FisherScientific 公司；限制性內(nèi)切酶I 和I、T4 DNA 連接酶購自NEB 公司；大腸桿菌（）DH5購自TransGen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒（Gel Extraction kit）和無內(nèi)毒素小量質(zhì)粒提取試劑盒II（E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid Mini Kit II）購自O(shè)mega 公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen 公司；熒光染料SYBRGreen I 購自Bio-Rad 公司；Dual-LuciferaseReporter Assay System和pmirGLO Vector 購自Promega 公司；DMEM/F-12 1:1培養(yǎng)基、PBS 購自Hyclone 公司；Opti-MEM 購自Gibco；引物由武漢奧科生物技術(shù)有限公司合成；miRNA mimics/inhibitor 由廣州市銳博生物科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRBase（http://www.mirbase.org/）中獲取miR-25 的參考序列。利用TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)bta-miRNA-25 的靶基因，分析是否包含基因并預(yù)測(cè)bta-miR-25 與基因之間潛在的結(jié)合位點(diǎn)。從NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取肉牛基因3'UTR 序列。

1.2.2 DKK3-3'UTR 片段擴(kuò)增 采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)包含bta-miR-25 結(jié)合位點(diǎn)的DKK3 3'UTR 區(qū)擴(kuò)增引物，并分別在上、下游引物加入I、I 酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。引物序列為：DKK3-3'UTR-F：5'-GTTTA AACGGAGCCTGTCAGTGGAG-3'；DKK3-3'UTR-R：5'-CTCGAGGTTTAGCAGCCCTGTTCT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為321 bp。其中，斜體為保護(hù)堿基，下劃線為酶切位點(diǎn)，正向引物為I 的酶切位點(diǎn)，反向引物為I 的酶切位點(diǎn)。以MDBK cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增合成DKK3 3'UTR 序列片段，PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：上下游引物（10 uM/L）各 0.5 μL，Taq PCR Mix 12.5 μL，cDNA（100 ng/μL）1 μL，補(bǔ)充ddHO 10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s，60 ℃退火45 s，72℃延伸15 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；25℃保存2 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的片段進(jìn)行切割，利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，具體操作步驟見產(chǎn)品說明書。

1.2.3 pmirGLO-DKK3-3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建 將純化后回收的3'UTR 擴(kuò)增產(chǎn)物及pmirGLO Vector 質(zhì)粒經(jīng)I 和I 雙酶切。反應(yīng)體系為：I、I 各 1 μL，10×FastDigest Green Buffer 1.5 μL，回收產(chǎn)物約0.2 μg 或質(zhì)粒約1 μg，補(bǔ)充ddHO 至20 μL或30 μL，37℃酶切2～3 h。酶切結(jié)束后再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、純化，將回收的目的片段與載體片段用T4 連接酶按如下體系進(jìn)行連接：目的片段7 μL，載體片段1 μL，T4 連接酶1 μL，10×Buffer 1 μL。16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5中，12 h 后挑陽性菌擴(kuò)大培養(yǎng)并克隆檢測(cè)，檢測(cè)再次為陽性的菌液送去測(cè)序。測(cè)序正確后去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定成功后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DKK3 突變型質(zhì)粒構(gòu)建 以1.2.3 中構(gòu)建的野生型載體質(zhì)粒為模板，采用融合PCR 方法將預(yù)測(cè)的btamiR-25 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，所用引物序列為：DKK3-3'UTR-F：5'-GTTTAAACGGAGCCTGTCAGTGGA G-3'；DKK3-3'UTR-R：5'-CTCGAGGTTTAGCA GCCCTGTTCT-3'；DKK3-mut-F：5'-TTGTGTGGGT AGATagatccTAGAAGTAGCTAAT-3'；DKK3-mut-R：5'-ATTAGCTACTTCTAggatctATCTACCCACACAA-3'。其中小寫字母為突變后堿基。具體步驟為：以DKK3-3'UTR-F 和mut1-R 為引物PCR 擴(kuò)增出mut（上）片段，以mut-F 和DKK3-3'UTR-R 為引物PCR 擴(kuò)增出mut（下）片段，將片段mut（上）和mut（下）“搭橋”后再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?！按顦颉斌w系為：mut（上）1 μL；mut（下）1 μL；Taq PCR Mix12.5 μL；ddHO10.5 μL?！按顦颉背绦?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s，40℃ 30 s，45℃ 5s，50℃ 5 s，55℃ 5 s，60℃ 5 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72° C 5 min；25° C 5 min。之后以“搭橋”后的體系為模板，再分別以DKK3-3'UTR-F 和DKK3-3'UTR-R 為上下游引物，再進(jìn)行常規(guī)PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收、雙酶切、連接pmirGLO Vector 載體等之后一系列的分子克隆技術(shù)同上述野生型載體質(zhì)粒構(gòu)建方法，最終構(gòu)建的載體稱之為突變型載體。

1.2.5 DKK3 刪除型質(zhì)粒構(gòu)建 所用的引物序列為：DKK3-3'UTR-F 5'-GTTTAAACGGAGCCTGTCAGTGGAG-3'；DKK3-3'UTR-R 5'-CTCGAGGTTTAGCAGCC CTGTTCT-3'；DKK3-del-F 5'-TTGTGTGGGTAGATTA GAAGTAGCTAAT-3'；DKK3-del-R 5'-ATTAGCTACTT CTAATCTACCCACACAA-3'，其余同1.2.4 突變型載體質(zhì)粒構(gòu)建。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性測(cè)定 MDBK 細(xì)胞接種至48 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞長至80℃時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔加0.1 μg 質(zhì)粒和1 μLmiR-25mimics 于25 μL opti-MEM中稀釋，1 μL Lipofectamine 2000 于25 μLopti-MEM 中稀釋，5 min 后將兩部分混合，室溫靜置10～15 min 后一滴一滴地加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中。對(duì)照組是以同樣的方法將mimics NC（陰性對(duì)照）替代miR-25mimics。轉(zhuǎn)染24 h 后利用1×PLB（Passive lysis buffer）裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液，測(cè)定雙熒光素酶活性。利用Dual-Reporter Assay System 在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光載體質(zhì)粒的相對(duì)熒光活性：吸取10 μL 細(xì)胞裂解液加入酶標(biāo)板中，首先加入50 μL 的LARII 讀取樣品中熒火蟲熒光素酶的活性值A(chǔ)，再加入50 μL 的Stop&Glo Reagent讀取樣品中海腎熒光素酶的活性值B，A/B 比值即代表該熒光載體的活性。

1.2.7 熒光定量PCR 和Western blot MDBK 細(xì)胞接種至12 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞長至80% 時(shí)分別將miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitorNC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，48 h 后提取細(xì)胞總RNA 和總蛋白?？俁NA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR，引物序列見表1?？偟鞍子糜赪estern blot 檢測(cè)基因的蛋白表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR 擴(kuò)增引物序列

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)之間進(jìn)行t-test；多組數(shù)據(jù)先進(jìn)行單因素方差分析，兩兩之間再進(jìn)行t-test。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析 從miRBase 數(shù)據(jù)庫中獲取miR-25序列為CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA。通過在線生物信息學(xué)軟件TargetScan 分析肉牛miR-25 的靶基因，預(yù)測(cè)其潛在靶基因共944 個(gè)，包括1 066 個(gè)保守位點(diǎn)和170個(gè)低保守位點(diǎn)；其中，基因3'UTR 的25～32 bp處存在一個(gè)潛在的miR-25 結(jié)合位點(diǎn)（圖1），據(jù)此推測(cè)基因可能是bta-miR-25 的一個(gè)靶基因。

圖1 bta-miR-25 與DKK3 3'UTR 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2基因3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建利用常規(guī)PCR、融合PCR、雙酶切、回收純化、連接等過程分別構(gòu)建了野生型（wt）、突變型（mut）及刪除型（del）雙熒光素酶報(bào)告載體，結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。構(gòu)建的3 種報(bào)告基因質(zhì)粒經(jīng)I 和I 雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示釋放出與預(yù)期大小相符的片段（圖3），結(jié)合測(cè)序結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 bta-miR-25 結(jié)合位點(diǎn)突變及刪除結(jié)構(gòu)示意圖

圖3 野生型、突變型及刪除型雙熒光素酶質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 雙熒光素酶活性檢測(cè) 將野生型（wt）、突變型（mut）及刪除型（del）雙熒光酶報(bào)告基因質(zhì)粒分別與miR-25 mimics 共轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，mimics NC 作為對(duì)照。24 h后裂解細(xì)胞，取細(xì)胞裂解液測(cè)定雙熒光素酶活性。結(jié)果顯示，將潛在的miR-25 結(jié)合位點(diǎn)突變或刪除后質(zhì)粒的雙熒光素酶活性都顯著上升（圖4）；與對(duì)照組NC 相比，miR-25 mimics 超顯著地抑制了野生型質(zhì)粒的熒光活性，位點(diǎn)突變后抑制作用減弱，而位點(diǎn)刪除后抑制作用完全消失（圖5）。

圖4 miR-25 mimics 對(duì)3 種載體質(zhì)粒雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

圖5 miR-25 mimics 及mimics NC 對(duì)3 種載體質(zhì)粒雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

2.4 miR-25 對(duì)DKK3 表達(dá)量的影響 將miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，24 h 后提取細(xì)胞總RNA，首先利用熒光定量PCR 檢測(cè)miR-25 的表達(dá)量，評(píng)估m(xù)imics 及inhibitor 的效果，結(jié)果如圖6 所示。與mimics NC 相比，miR-25 mimics極顯著提高了miR-25的表達(dá)量；與inhibitor NC 相比，miR-25 inhibitor 顯著降低了miR-25 的表達(dá)量，表明miR-25 mimics、inhibitor 能達(dá)到預(yù)期效果，可用于后續(xù)研究。的mRNA 表達(dá)量如圖7 所示，miR-25 mimics 顯著抑制了的表達(dá)，但抑制miR-25 后的表達(dá)量顯著上升。Western blot 結(jié)果與之相同（圖8）。

圖6 miR-25 mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

圖7 DKK3 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

圖8 DKK3 基因蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

miR-25 是miR-106b-25 簇的一員，已有研究表明miR-25 在脂肪生成過程中具有一定的調(diào)控作用。Ma 等研究表明miR-25 可通過抑制調(diào)節(jié)山羊乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯和脂質(zhì)積累；Liang 等研究發(fā)現(xiàn)miR-25 可靶向和基因抑制小鼠前脂肪細(xì)胞的脂肪生成；miRNA 測(cè)序及組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，miR-25 在秦川牛背部脂肪組織中高表達(dá)，對(duì)miR-25 的靶基因進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示上百個(gè)靶基因富集到與脂肪形成或脂滴沉積相關(guān)的通路。課題前期研究結(jié)果顯示，miR-25-3p 可顯著降低小鼠C2C12細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量；miR-25-3p 也可靶向肉?；?'UTR，而基因可顯著提高肉牛肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞脂肪生成。據(jù)此推測(cè)，miR-25 可能參與調(diào)控肉牛肌內(nèi)脂肪生成，且表現(xiàn)為抑制作用。

DKK3 是Wnt/-catenin 信號(hào)通路的抑制劑，具有調(diào)控組織細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡、代謝和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，在心臟疾病、腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)發(fā)生和代謝疾病等方面有諸多研究。在脂肪發(fā)育方面的研究較少，迄今僅有一項(xiàng)研究報(bào)道基因多態(tài)性與南陽牛經(jīng)濟(jì)性狀之間存在顯著關(guān)聯(lián)，提示基因可能影響肉牛的脂肪發(fā)育。高等生物基因的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的精細(xì)調(diào)控，具有嚴(yán)格的時(shí)間及空間有序性。基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜有序的過程，由多階段調(diào)控水平共同完成，主要包括轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后5 個(gè)水平。miRNAs 具有降解靶mRNA 和抑制靶基因翻譯的作用，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析軟件TargetScan 預(yù)測(cè)到基因3'UTR 存在一個(gè)miR-25 的結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)可能是miR-25 的靶基因。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，開展了下述一系列工作：構(gòu)建包含miR-25 結(jié)合位點(diǎn)的3'UTR 野生型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并通過融合PCR 將結(jié)合位點(diǎn)突變、刪除構(gòu)建突變型和刪除型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒；將構(gòu)建的3 種質(zhì)粒分別與miR-25 mimics 和mimics NC 共轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，測(cè)定雙熒光素酶活性，結(jié)果證實(shí)miR-25 可通過預(yù)測(cè)到的結(jié)合位點(diǎn)與基因靶向結(jié)合。為進(jìn)一步研究miR-25 對(duì)表達(dá)量的影響，將miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC 分別轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，熒光定量PCR 和Western blot 檢測(cè)的表達(dá)量，結(jié)果顯示miR-25 mimics 顯著抑制的表達(dá)，而抑制miR-25 后的表達(dá)量顯著上升，表明miR-25 對(duì)基因發(fā)揮抑制作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)可能是miR-25 的靶基因，通過構(gòu)建3'UTR 雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、細(xì)胞共轉(zhuǎn)染、測(cè)定雙熒光素酶活性、熒光定量PCR 及Western blot 驗(yàn)證了miR-25 與肉?；蛑g的靶向關(guān)系，為今后進(jìn)一步開展miR-25 調(diào)控肉牛肌內(nèi)脂肪生成的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。