YWHA 蛋白在哺乳動物生殖中的作用研究進(jìn)展

趙怡凡，馬增友，秦 歌，孟碟方，彭 輝

（福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxyge nase Activation Protein，YWHA）家族廣泛表達(dá)于真核生物中，該蛋白家族在哺乳動物中有酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAB）、酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAG）、酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAQ）、酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAH）、酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAZ）、酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（YWHAE）和酪氨酸3-單加氧酶/ 色氨酸5-單加氧酶激活蛋白（SFN）7 個成員，不同亞型可以與相同的配體結(jié)合，因此該家族蛋白的功能在某種程度上有相似性。YWHA 蛋白是一個高度保守的同源蛋白家族，由不同基因編碼。研究表明YWHA 蛋白可以與靶蛋白的磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，如激酶、磷酸酶、跨膜受體、轉(zhuǎn)錄因子等，通過蛋白質(zhì)組學(xué)和生物化學(xué)方法已經(jīng)檢測到200 多種可能與YWHA 蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，這些蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期、信號傳導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等生命活動。

前期有關(guān)YWHA 蛋白的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、相互作用蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面，現(xiàn)在越來越多的研究表明YWHA 蛋白的一些亞型參與調(diào)控哺乳動物卵母細(xì)胞的生長發(fā)育、減數(shù)分裂進(jìn)程、早期胚胎發(fā)育和精子發(fā)生等過程。本文主要綜述YWHA 蛋白的結(jié)構(gòu)以及YWHA 蛋白在哺乳動物生殖中的研究進(jìn)展，揭示YWHA 蛋白在動物生殖系統(tǒng)中的表達(dá)、定位和功能，以期為闡明YWHA 蛋白在哺乳動物配子發(fā)生和生殖過程中的作用提供參考和借鑒。

1 YWHA 蛋白的結(jié)構(gòu)和結(jié)合基序

1.1 YWHA 蛋白的結(jié)構(gòu) YWHA 蛋白通常以單體分子量約為30 ku 的同源或異源二聚體形式存在。每個蛋白單體含有由9 個反向平行的-螺旋（H1-9）形成的帶負(fù)電荷的通道，二聚體分子呈U 形，中心通道大約長35?、寬35?、深20?，保守區(qū)主要位于通道內(nèi)部，可變殘基分布在蛋白外表面。YWHA 蛋白形成同源或異源二聚體的傾向略有不同，這些差異源于序列上的微小變化。YWHAZ 同源二聚體的二聚體界面由一個單體H1 螺旋和H2 螺旋通過3 個鹽橋（Arg18–Glu89、Glu5–Lys74、Asp21–Lys85）與另一個單體H3 螺旋和H4 螺旋相互作用而構(gòu)成。

YWHA 蛋白的C 端是一個15～40 個氨基酸殘基長度的柔性區(qū)域，最易發(fā)生序列變異。C 末端的伸展作用可以抑制YWHA 蛋白和配體之間的非特異性相互作用，研究表明C 端截短的YWHAZ 與多個配體的結(jié)合親和力增加。該片段的結(jié)構(gòu)仍然是未知的，它可能定位于配體結(jié)合域內(nèi)。根據(jù)能量共振轉(zhuǎn)移熒光成像技術(shù)和分子動力學(xué)模擬顯示，在沒有配體的情況下，C 端拉伸占據(jù)配體結(jié)合域，但與磷酸肽結(jié)合后，C 端被釋放出來。酵母YWHA蛋白亞型BMH1 和BMH2 具有明顯變異C 末端，這使它們區(qū)別于高等真核生物的亞型。BMH 的C 端較長，含有未知功能的polyQ。研究表明BMH 蛋白的C 端構(gòu)象可能阻礙了其折疊進(jìn)入配體結(jié)合域。因此，酵母YWHA 蛋白C 端片段不具有自抑制功能。

1.2 YWHA 蛋白的結(jié)合基序 YWHA 蛋白家族的所有亞型都能識別兩個高親和磷酸化依賴的結(jié)合基序:RSXpSXP 或RSXpTSXR（mode 1），RXXXpSXP 或RXXXpTXP（mode 2），其中pS 代表一個磷酸化絲氨酸，pT 代表一個磷酸化蘇氨酸。同時，YWHA 蛋白還可以與不同的磷酸化位點(diǎn)以及非磷酸化肽相互作用，YWHA 的一些相互作用獨(dú)立于磷酸化而存在。YWHA結(jié)合的分子和生物化學(xué)效應(yīng)是多種多樣的，取決于相互作用蛋白的性質(zhì)和相關(guān)的信號通路。YWHA 與靶蛋白相互作用可分為以下幾種不同的方式：①YWHA 蛋白與靶蛋白的相互作用通過改變靶蛋白的構(gòu)象或半衰期直接改變其活性，這種方式是最常見的，特別是蛋白激酶和蛋白磷酸酶的激活或失活；②YWHA 蛋白作為支架蛋白，將2 種蛋白結(jié)合在一起，調(diào)節(jié)兩種蛋白的相互作用；③YWHA 蛋白可以與靶蛋白的特定序列結(jié)合控制蛋白質(zhì)定位。由于YWHA 蛋白結(jié)合靶蛋白主要依賴于磷酸化，YWHA 蛋白相互作用主要由調(diào)節(jié)靶蛋白磷酸化狀態(tài)的激酶和磷酸酶調(diào)控。YWHA 蛋白不僅調(diào)控靶蛋白的活性，其自身的活性也受其他蛋白磷酸化狀態(tài)的控制，例如YWHAZ 的Ser、YWHAH 的Ser和YWHAB的Ser60 發(fā)生磷酸化后可以破壞其二聚體的形成。

2 YWHA 蛋白在雌性動物繁殖中的作用

2.1 YWHA 蛋白在卵母細(xì)胞中的表達(dá)、定位和功能 在哺乳動物中，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂表達(dá)開始于胎兒期，卵母細(xì)胞長期處于第1 次減數(shù)分裂前期的雙線期，Cdc2-CyclinB 復(fù)合物維持在非活性狀態(tài)，成熟促進(jìn)因子（MPF）失活導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯。排卵前，卵泡中的卵母細(xì)胞由于LH 峰恢復(fù)減數(shù)分裂。LH 啟動多種信號通路，包括通過失活鳥苷酸環(huán)化酶抑制降鈣素基因相關(guān)肽（Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP）的流動，以及通過激活磷酸二酯酶調(diào)節(jié)CGRP 水解。卵母細(xì)胞內(nèi)磷酸二酯酶的激活降低了cAMP 水平和PKA 活性。Cdc2 被蛋白磷酸酶CDC25B 去磷酸化后被激活。MPF的激活重啟了減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞成熟過程，首先是生發(fā)泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），然后是第一極體排出，在大多數(shù)哺乳動物中，卵母細(xì)胞在第2 次減數(shù)分裂中期再次停止，此時卵母細(xì)胞具有受精的能力。早期研究表明，在爪蟾卵母細(xì)胞中，CDC25磷酸酶被PKA 磷酸化，并與細(xì)胞質(zhì)中的YWHA 蛋白結(jié)合并錨定在胞質(zhì)中，從而維持減數(shù)分裂停滯，有研究認(rèn)為在哺乳動物中可能存在同樣的機(jī)制。YWHA蛋白的7 個亞型均在小鼠卵巢和不同時期卵母細(xì)胞中表達(dá)，Eisa 等通過PLA 技術(shù)揭示YWHA 蛋白的所有亞型都與小鼠卵母細(xì)胞中的CDC25B 相互作用，將YWHA 蛋白抑制肽R18 顯微注射到卵母細(xì)胞中，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的GVBD 率顯著高于對照組，該研究表明YWHA 蛋白參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。

YWHA 蛋白不同亞型在卵母細(xì)胞中的表達(dá)和定位存在差異。De 等研究發(fā)現(xiàn)YWHAB、YWHAE、YWHAH 和YWHAZ 的表達(dá)隨著卵母細(xì)胞的成熟減少，而YWHAG 和YWHAQ 的表達(dá)量在卵母細(xì)胞成熟后增加。YWHAG、YWHAZ、YWHAQ、YWHAH 和SFN 僅在小鼠GV 期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，隨著GVBD 的發(fā)生，這些亞型均勻的分布于卵母細(xì)胞中，其中YWHAH 部分定位于卵母細(xì)胞的紡錘體。YWHAH在MI 和MII 紡錘體中均有定位，通過PLA 技術(shù)發(fā)現(xiàn)YWHAH 與微管蛋白-tubulin 在MII 中期相互作用。為了證明YWHAH 在卵母細(xì)胞成熟中的功能，用嗎啉代寡核苷酸（MOs）對小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微注射，以抑制YWHAH 翻譯，從而減少卵母細(xì)胞成熟過程中YWHAH 蛋白的合成，研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中卵母細(xì)胞紡錘體變形或缺失，這些細(xì)胞含有成簇的染色體，但沒有排出極體。在果蠅中，YWHAE缺失可導(dǎo)致卵母細(xì)胞不能形成紡錘體或形成多極紡錘體。YWHAE 對控制卵母細(xì)胞雙極紡錘體形成有重要作用，該功能可能主要與Ncd 馬達(dá)蛋白有關(guān)。Ncd 是一種負(fù)向馬達(dá)蛋白，在果蠅卵母細(xì)胞減數(shù)分裂紡錘體的組裝中起重要作用，介導(dǎo)反平行微管的滑動并交聯(lián)平行微管。YWHAE 與Aurora B 激酶共同調(diào)節(jié)Ncd 蛋白，YWHAE 可與Ncd 蛋白S96 磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，抑制Ncd 與微管蛋白結(jié)合。Aurora B 激酶存在于染色體附近，可以將Ncd 蛋白S94 磷酸化，S94 磷酸化可抑制YWHAE 與Ncd 相互作用，Aurora B 激酶磷酸化可以將Ncd 蛋白從YWHAE 的抑制作用中釋放出來，以允許與微管結(jié)合。YWHAE 與Aurora B 激酶共同作用，通過抑制與非紡錘體微管的結(jié)合，將Ncd 蛋白靶向減數(shù)分裂紡錘體。Ncd 蛋白可能不是唯一的目標(biāo)蛋白，在哺乳動物有絲分裂中，MKLP1 驅(qū)動蛋白受類似機(jī)制調(diào)節(jié)。該機(jī)制在哺乳動物減數(shù)分裂中是否存在還需要進(jìn)一步研究。

2.2 YWHA 蛋白在早期胚胎發(fā)育中的作用 YWHA 蛋白在早期胚胎發(fā)育中也可能發(fā)揮一定作用。PADI6 是一種關(guān)鍵的母源效應(yīng)蛋白，該蛋白催化肽基精氨酸轉(zhuǎn)化成瓜氨酸，參與調(diào)控早期胚胎的網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu)形成。研究發(fā)現(xiàn)YWHA 與成熟卵母細(xì)胞中磷酸化的PADI6 相互作用，但與GV 期卵母細(xì)胞中未磷酸化的PADI6 不存在相互作用。秀麗隱桿線蟲YWHA 蛋白PAR-5 在早期胚胎非對稱發(fā)育中起重要作用，PAR-5 水平顯著降低會導(dǎo)致胚系缺陷和不育。

大量研究表明，YWHA 蛋白是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和細(xì)胞有絲分裂過程中細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，YWHA 蛋白作為各種細(xì)胞信號通路的關(guān)鍵中間體，在卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟中發(fā)揮重要作用。

3 YWHA 蛋白在雄性動物繁殖中的作用

3.1 YWHA 蛋白在睪丸細(xì)胞中的表達(dá) 精子發(fā)生是一個復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，精原干細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂增殖產(chǎn)生A 型、中間型和B 型精原細(xì)胞，B 型精原細(xì)胞又分化為初級精母細(xì)胞，初級精母細(xì)胞再經(jīng)過兩次減數(shù)分裂產(chǎn)生精子細(xì)胞，最后精子細(xì)胞變形為成熟的精子。精子發(fā)生的全部過程與支持細(xì)胞有密切關(guān)系。YWHA 是一個高度保守的蛋白質(zhì)家族，存在于公牛、倉鼠、恒河猴、大鼠、火雞、馬蹄蟹和爪蟾的睪丸中。雖然YWHA 在睪丸中表達(dá)，但是YWHA 蛋白的7 種亞型在睪丸不同細(xì)胞類型中表達(dá)還沒有完全闡明。如表1 所示，YWHAB，YWHAQ 和YWHAE 在大鼠睪丸中表達(dá)，據(jù)報道這3 種YWHA 亞型也在睪丸支持細(xì)胞中表達(dá)YWHAQ 和YWHAE 在睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)，但是YWHAB 亞型的表達(dá)僅限于大鼠睪丸中的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。Berruti 等證明YWHAZ 存在于發(fā)育中的精子細(xì)胞和精母細(xì)胞中，然而這種亞型在睪丸或附睪的精子中都沒有檢測到。使用能檢測YWHA 所有亞型的抗體檢測精子，YWHA 蛋白主要存在于頂體后區(qū)和精子中部。

表1 YWHA 各亞型在睪丸及睪丸內(nèi)細(xì)胞中的表達(dá)[4,32-35]

3.2 YWHA 蛋白在精子發(fā)生中的作用 YWHA 蛋白在動物睪丸和精子中也有多個結(jié)合配偶體。使用串聯(lián)親和標(biāo)記YWHAZ（tap-YWHAZ）的轉(zhuǎn)基因小鼠來分離YWHA 結(jié)合蛋白，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定。在睪丸中發(fā)現(xiàn)有135 種蛋白質(zhì)與YWHA 相關(guān)，通過與已知的YWHA 結(jié)合蛋白比較，鑒定出71 種蛋白是新的YWHA 相互作用蛋白。這些新的YWHA 相互作用蛋白中有8 種主要在睪丸中表達(dá)，分別為：絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白磷酸酶12（PP12）、精子發(fā)生相關(guān)蛋白18（SPATA18）、磷酸甘油酸激酶2（PGK2）、睪丸特異性基因A-2（TSGA-2）、生殖細(xì)胞特異性蛋白DDX4、PIWI 樣蛋白1（PIWIL1）、睪丸發(fā)育特異性蛋白-25（NYD-SP25）和EAN57。研究表明上述部分蛋白對于精子發(fā)生是不可或缺的，YWHAZ 在體外與牛精子中的PP12 和PGK2 相互作用，這兩種酶對維持生育能力至關(guān)重要。缺乏PP12 的小鼠不育并且具有高磷酸化的PGK2，這表明PP12 可以將PGK2 維持在去磷酸化狀態(tài)。PP12 和PGK2 都與YWHA 結(jié)合，因此YWHA 蛋白可以作為有利于PP12 和PGK2 相互作用的支架蛋白。這表明YWHA 蛋白在調(diào)控上述蛋白在生殖細(xì)胞分裂和成熟中的功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

精子發(fā)生和精子形成過程中，YWHA 蛋白與參與調(diào)控生殖細(xì)胞運(yùn)動和細(xì)胞粘附的蛋白存在相互作用。在7 種哺乳動物YWHA 亞型中YWHAQ 亞型表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，在睪丸和腦中表達(dá)最高。血睪屏障將生精上皮分為了基底區(qū)和管腔區(qū)，血睪屏障是由緊密連接、錨定連接、縫隙連接和外胞質(zhì)特異結(jié)構(gòu)等各種連接復(fù)合體共同形成連續(xù)不離散的屏障結(jié)構(gòu)，YWHAQ 主要定位于頂端外胞質(zhì)特異結(jié)構(gòu)，在生殖細(xì)胞中的表達(dá)高于在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)。成年大鼠用Adjudin（一種男性避孕藥）處理12 h 后，睪丸裂解物中YWHAQ 蛋白水平隨時間下降。在靠近管腔的精子細(xì)胞中YWHAQ蛋白明顯減少。在支持細(xì)胞中敲除YWHAQ 使得支持細(xì)胞-支持細(xì)胞界面的N-鈣黏蛋白和ZO-1 錯誤定位到細(xì)胞質(zhì)中。YWHAQ 與N-鈣黏蛋白部分共定位，調(diào)節(jié)睪丸中支持細(xì)胞連接。同時YWHAQ 的敲除會影響血睪屏障支持細(xì)胞的蛋白質(zhì)內(nèi)吞作用，導(dǎo)致這些蛋白從支持細(xì)胞-支持細(xì)胞界面轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，YWHAQ 通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)吞作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。

YWHAE亞型在睪丸及睪丸內(nèi)不同細(xì)胞中高度表達(dá)。Subramanian 等研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與精子發(fā)生的開始時間一致，并隨著年齡的增長而增加，在成年小鼠睪丸中水平最高。在睪丸中，YWHAE 存在于分化的生殖細(xì)胞中，但在精原細(xì)胞中檢測不到。YWHAE 亞型主要存在于精子中段，缺失YWHAE 影響精子能量代謝和形態(tài)發(fā)生。YWHAE 睪丸特異性敲除（Conditional Knockout，CKO）小鼠生育能力受到損害，精子數(shù)量明顯低于同窩出生的野生型小鼠，精子活力顯著降低。用熒光探針檢測YWHAE CKO 小鼠精子線粒體膜電位明顯降低，線粒體功能存在差異。有證據(jù)表明YWHAE參與細(xì)胞線粒體功能，使用類固醇誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致YWHAE 從細(xì)胞質(zhì)向線粒體外膜轉(zhuǎn)移。YWHAE與YWHAZ 或YWHAG 形成的異源二聚體也被稱為線粒體輸入刺激因子（Mitochondrial Import Stimulation Factor，MSF）。在線粒體外膜，電壓依賴性陰離子通道（VDAC）與類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）競爭結(jié)合YWHAE，VDAC 有助于轉(zhuǎn)移脂肪酸離子、活性氧、鈣、膽固醇和代謝物通過線粒體外膜，也與細(xì)胞凋亡有關(guān)。YWHAE CKO 小鼠的畸形精子增加，如空泡狀頭部、無定形頭部、彎曲和不規(guī)則的中段，與野生型相比正常精子數(shù)量明顯減少，這與PP1CKO 小鼠生殖細(xì)胞中的精子異常相似。組織學(xué)檢查表明，與野生型小鼠睪丸相比，YWHAE CKO 小鼠睪丸中精子異常定位在生精細(xì)胞基底附近。由于生殖細(xì)胞脫落，一些生精小管出現(xiàn)空泡。YWHAE 對于精子形成和正常精子功能至關(guān)重要，YWHA 的其它亞型不能補(bǔ)償睪丸中該亞型的缺失。YWHAE 的缺失改變了精子發(fā)生，也改變了其它已知調(diào)節(jié)精子運(yùn)動的關(guān)鍵蛋白。導(dǎo)致YWHAE CKO小鼠不育的確切機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

4 YWHA 蛋白與生殖系統(tǒng)疾病

研究表明癌癥中的YWHA 蛋白主要作為伴侶分子結(jié)合其磷酸化的靶蛋白，以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲。YWHAZ 在多種癌癥中研究最廣泛，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和胃癌等多種癌癥中高度表達(dá)，其表達(dá)豐度與預(yù)后不良和對癌癥的耐藥性有關(guān)。在卵巢癌樣本中，53.4% 樣本顯示YWHAZ 高表達(dá)，其高表達(dá)與卵巢癌晚期的病理分期呈正相關(guān)。YWHAZ 過表達(dá)可能是卵巢癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物，抑制YWHAZ 活性可能是抗腫瘤治療的一個選擇。

精索靜脈曲張（Varicocele,VAC）是導(dǎo)致雄性不育的常見原因，生精細(xì)胞凋亡在VAC 所致的生精障礙中起重要作用。有研究表明，YWHAE 蛋白在VAC大鼠睪丸中表達(dá)減少。根據(jù)YWHA 蛋白的特性，分析YWHAE 的結(jié)合配偶體有助于揭示生殖細(xì)胞凋亡的機(jī)制。在體外研究中，經(jīng)YWHAE siRNA 處理后，GC-1 spg 細(xì)胞（小鼠精原細(xì)胞系）中YWHAE 蛋白表達(dá)減少，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。免疫印跡結(jié)果顯示，在YWHAE siRNA 處理的GC-1 spg 細(xì)胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2 顯著下調(diào)，促凋亡蛋白Bax 和caspase-3 顯著上調(diào)。下調(diào)的YWHAE 可能降低其結(jié)合Bcl-2 家族抗凋亡蛋白的能力。精索靜脈曲張切除術(shù)并非對所有患有精索靜脈曲張的不育患者都有效，而YWHAE 的過表達(dá)是抑制生殖細(xì)胞凋亡的新途徑，可能具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

5 小結(jié)與展望

本文主要概述了YWHA 蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、分布以及在哺乳動物生殖方面的功能，揭示了YWHA 蛋白與互作蛋白調(diào)控哺乳動物配子發(fā)生和生殖發(fā)育的可能機(jī)制。目前，雖然對YWHA 蛋白在哺乳動物生殖方面的功能進(jìn)行了一定的研究，但還存在以下問題：①YWHA 亞型通常形成同源二聚體或異源二聚體發(fā)揮功能，在細(xì)胞內(nèi)存在的YWHA 蛋白二聚體到底是同源的還是異源的很難鑒定；②YWHA 蛋白二聚體的解離受磷酸化調(diào)控，能夠磷酸化YWHA 蛋白的激酶還未可知；③YWHA 不同亞型間的可互換性和功能重疊性導(dǎo)致了研究單個亞型參與生殖過程和相關(guān)作用機(jī)制存在一定的難度，且特定亞型在哺乳動物繁殖過程中的功能還有待近一步闡明。因此，深入研究YWHA 蛋白二聚體的形成和解離、不同亞型之間的差異以及發(fā)展新的方法揭示不同亞型在哺乳動物生殖中的生理功能將是未來研究YWHA 蛋白家族功能的重要方向。