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    Hp感染通過上調(diào)miR-192促進胃癌細胞增殖的機制研究

    2022-06-12 15:37:41劉洪福林森海趙華麗張蕾余年發(fā)曾翔輝劉宇一曾祥福
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2022年14期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶胃炎胃癌

    劉洪?!×稚!≮w華麗 張蕾 余年發(fā) 曾翔輝 劉宇一 曾祥福

    [摘要] 目的 探討miR-192與胃癌患者幽門螺旋桿菌(Hp)感染的關(guān)系并分析其對細胞增殖的影響及機制研究。方法 收集2019年7月至2021年4月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的胃癌患者50例作為GC組,選取同期行胃鏡檢查的淺表性胃炎患者50例作為對照組。采用尿素酶法檢測Hp感染,RT-PCR檢測miR-192的表達,分析Hp+胃癌患者miR-192表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。在Hp+ MKN-45細胞中轉(zhuǎn)染miR-192模擬物、miR-192抑制物及無關(guān)對照(NC),并將細胞分為Inhibitor組、Mimics組和NC組。MTT法檢測細胞增殖,熒光素酶報告基因驗證miR-192與P53基因的靶向關(guān)系,Western blot檢測P53蛋白表達。結(jié)果 胃癌患者Hp+率(74.00% vs. 32.00%)顯著高于對照組(P<0.01)。和對照組相比,胃癌組織miR-192表達顯著升高,P53 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。GC組和對照組Hp+者miR-192表達水平顯著高于Hp-者(P<0.05)。miR-192表達與Hp感染、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05)。轉(zhuǎn)染成功后,Inhibitor組細胞增殖活力降低(P<0.05),Mimics組細胞增殖活力升高(P<0.05)。熒光素酶報告分析確定P53是miR-192的下游靶基因,且Inhibitor組P53蛋白水平高于對照組和NC組(P<0.05)。結(jié)論 miR-192在胃癌患者中表達升高,其變化與Hp感染、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)。miR-192是一種促癌miRNA,通過靶向P53基因促進Hp+胃癌細胞增殖。

    [關(guān)鍵詞] 胃癌;幽門螺旋桿菌;miR-192;P53;增殖

    [中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701(2022)14-0004-05

    Study on mechanism of Hp infection promoting gastric cancer cell proliferation by up-regulating miR-192

    LIU Hongfu1? ?LIN Senhai2? ? ZHAO Huali3? ?ZHANG Lei4? ?YU Nianfa1? ?ZENG Xianghui1? ?LIU Yuyi1? ?ZENG Xiangfu1

    1.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou? 341000, China; 2.Department of General Surgery, Yudu People′s Hospital in Jiangxi Province, Yudu? 342300, China; 3.Department of Outpatient, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou? 341000, China; 4.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University, Ganzhou? 341000, China

    [Abstract] Objective To investigate the relationship between miR-192 and Helicobacter pylori (Hp) infection in gastric cancer patients, and to analyze its effect on cell proliferation and its mechanism. Methods A total of 50 patients with gastric cancer admitted to the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University from July 2019 to April 2021 were collected as the GC group, and 50 patients with superficial gastritis who underwent gastroscopy at the same period were selected as the control group. The Hp infection was detected by the urease method and miR-192 expression was detected by RT-PCR to analyze the relationship between miR-192 expression and clinicopathological features of gastric cancer in Hp+ gastric cancer patients. Hp+ MKN-45 cells were transfected with miR-192 mimics, miR-192 inhibitors, and normal controls (NC) and divided into Inhibitor group, Mimics group, and NC group. The cell proliferation was detected by the MTT assay; the targeting relationship between miR-192 and P53 gene was verified by the luciferase reporter gene; the expression of P53 protein was detected by the Western blot. Results The Hp+ rate of gastric cancer patients (74.00% vs. 32.00%) was significantly higher than that of the control group (P<0.01). Compared with the control group, the expression of miR-192 was significantly increased and the expression of P53 mRNA was significantly decreased in the gastric cancer tissues (P<0.01). In GC group and the control group, the expression levels of miR-192 in Hp+ patients were significantly higher than those in HP- patients (P<0.05). The miR-192 expression was significantly correlated with Hp infection, lymphatic metastasis and clinical stage (P<0.05). After transfection, the proliferation activity of cells in the Inhibitor group was decreased (P<0.05), and that in the Mimics group was increased (P<0.05). The luciferase report analysis confirmed that P53 was the downstream target gene of miR-192, and the protein level of P53 in the Inhibitor group was higher than those in the control group and the NC group (P<0.05). Conclusion The miR-192 expression is elevated in gastric cancer patients, and its changes were related to Hp infection, lymphatic metastasis and tumor stage. The miR-192 is a cancer-promoting miRNA that promotes the proliferation of Hp+ gastric cancer cells by targeting P53 genes.117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

    [Key words] Gastric cancer; Helicobacter pylori (Hp); miR-192; P53; Proliferation

    胃癌是常見的惡性腫瘤,我國每年新發(fā)胃癌近41萬人,死亡約30萬人,嚴(yán)重危害國民的生命健康[1]。目前,胃癌尚缺乏理想的腫瘤標(biāo)志物,從而給其診斷、療效評價、預(yù)后及康復(fù)等造成困難。microRNA(miR)是一類小的非編碼RNA,通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,參與各種生物過程[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),多種microRNAs在胃癌中異常表達[4-5]。幽門螺桿菌(helicobacter pylori,Hp)在胃炎到胃癌的演變中發(fā)揮重要作用,且與多種microRNA的異常表達相關(guān)[6]。miR-192參與多種腫瘤的發(fā)生,但其與胃癌相關(guān)的報道甚少。本研究旨在探討miR-192在胃癌中的表達,并分析其與Hp的相關(guān)性及其促進胃癌細胞增殖的分子機制,現(xiàn)報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 材料

    PCR儀購自Bio-Rad公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibio公司,Trizol試劑購自Invitrogen公司;細胞增殖和凋亡試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司;Hp快速診斷試劑盒購自本溪斯特捷生物科技有限公司;P53、β-actin抗體購自Abcam公司;miR-192抑制物(inhibitor),miR-192模擬物(mimics)及無關(guān)對照(NC)引物由上海博銳生物科技公司設(shè)計合成;miR-192和β-actin引物由上海吉瑪基因公司完成。

    1.2 研究對象

    收集2019年7月至2021年4月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的胃癌患者50例作為GC組,所有患者均經(jīng)病理確診,排除合并其他腫瘤及經(jīng)過放化療者。其中男32例,女18例;平均年齡(67.69±5.38)歲。另選取同期行胃鏡檢查的淺表性胃炎患者50例作為對照組,采集其胃黏膜組織進行研究。其中男30例,女20例;平均年齡(68.21±5.72)歲。兩組性別(χ2=0.170,P=0.680)、年齡(t=-0.101,P=0.920)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.3 菌株和細胞

    Hp菌株購自ATCC,人胃癌細胞系MKN-45購自協(xié)和細胞庫。細胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中,待密度至80%左右,以100∶1的倍數(shù)與Hp共培養(yǎng)。24 h后提取總RNA;將Hp+MKN-45細胞接種于6孔板轉(zhuǎn)染miR-192 inhibitor、miR-192 mimics或miR-192 NC,將其分為Inhibitor組、Mimics組和NC組。

    1.4 Hp感染檢測

    胃癌組織和對照組胃黏膜組織行快速尿素酶試驗,具體操作方法參照試劑盒說明書,5 min內(nèi)試劑由黃色變成紅色,則為陽性。

    1.5 細胞增殖

    將轉(zhuǎn)染后的各組細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)12、24、36、48、72 h后,加入20 μl MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入二甲基亞砜150 μl,酶標(biāo)儀(490 nm)檢測吸光度值,計算細胞增殖率。

    1.6 RT-PCR

    取-80°C保存的組織,液氮中研磨至粉末,Trizol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參,置于RT-PCR上進行擴增,引物序列見表1,2-ΔΔCt法計算miR-192和P53 mRNA相對表達量。

    1.7 熒光素酶報告基因檢測

    TargetScan軟件預(yù)測miR-192與P53 3′-UTR結(jié)合序列,將其插入熒光素酶質(zhì)粒上,構(gòu)建野生型載體(P53-WT)。另外,構(gòu)建P53 3′-UTR核苷酸突變的突變型載體(P53-MUT),將P53-WT、P53-MUT分別與miR-192 mimics、miR-192 NC共轉(zhuǎn)染至Hp+ MKN-45細胞中,24 h后檢測熒光素酶活性。

    1.8 Western blot

    采用Western blot法,以β-actin為內(nèi)參,檢測組織和細胞內(nèi)P53蛋白相對表達量。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間采用t檢驗,多組間采用單因素方差分析;計數(shù)資料以[n(%)]表示,組間采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Hp感染情況

    GC組胃癌患者中Hp+37例,陽性率為74.00%,對照組淺表性胃炎患者Hp+16例,陽性率為32.00%。GC組Hp+率顯著高于對照組(χ2=17.704,P<0.01)。

    2.2 組織中miR-192、P53 mRNA表達水平比較

    RT-PCR結(jié)果顯示,和對照組比較,GC組胃癌組織miR-192表達顯著升高(P<0.01),P53 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。比較mRNA在不同Hp感染者中的表達,結(jié)果顯示,GC組Hp+者miR-192表達顯著升高(P<0.05),P53 mRNA表達顯著降低(P<0.05);對照組Hp+miR-192表達顯著升高(P<0.05),P53 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果說明,miR-192和P53 mRNA表達異常與Hp感染和胃癌相關(guān)。見圖1。

    2.3 胃癌組織miR-192表達與臨床病理因素的關(guān)系

    miR-192表達水平與Hp感染、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)(P<0.05),而與年齡、性別和分化程度無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

    2.4 轉(zhuǎn)染效果驗證

    RT-PCR結(jié)果顯示,對照組與NC組細胞miR-192表達水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與對照組比較,Inhibitor組細胞miR-192表達顯著降低(P<0.05),Mimics組細胞miR-192表達顯著升高(P<0.01),說明轉(zhuǎn)染成功。

    2.5 細胞增殖能力比較

    MTT結(jié)果顯示,對照組與NC組細胞增殖活力比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),相較于對照組和NC組,Inhibitor組增殖活力顯著降低(P<0.05),Mimics組細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)。

    2.6 miR-192與P53靶向關(guān)系驗證

    熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,在Hp+ MKN-45細胞中,miR-192 mimics抑制P53-WT質(zhì)粒熒光強度(P<0.05),而對P53-MUT質(zhì)粒熒光強度無影響(P>0.05)。Western blot結(jié)果顯示,對照組與NC組比較,P53蛋白相對表達量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與NC組比較,Mimics組P53蛋白表達量顯著降低,Inhibitor組P53蛋白表達水平顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見封三圖1。

    3 討論

    Hp是胃炎、胃潰瘍的主要病因,與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[7]。Hp從多個方面引發(fā)胃癌:①引發(fā)胃黏膜致癌物形成:Hp通過粘附作用定植于胃黏膜細胞表面,通過自身分泌的多種酶和細胞毒素誘發(fā)癌變,或通過炎癥誘發(fā)癌變[8]。②促進胃黏膜細胞的增殖和凋亡:Hp感染導(dǎo)致機體釋放的炎癥因子、活性氧、活性氮可促進細胞增殖。Hp產(chǎn)生的毒力因子對細胞有損傷作用,Hp尿素酶活性與凋亡呈正相關(guān)[9-10]。③影響癌基因的表達:ras基因突變后的產(chǎn)物P21蛋白可持續(xù)向細胞內(nèi)傳遞增殖信號,刺激細胞無限增殖,研究發(fā)現(xiàn)胃癌或胃癌前病變組織中ras基因突變者在Hp+組顯著高于無感染組,且在Hp+組P21蛋白質(zhì)表達明顯高于無感染組[11]。P53基因監(jiān)視DNA分子的完整性,當(dāng)DNA受損不能完成修復(fù)時,P53蛋白可誘導(dǎo)細胞凋亡,P53基因突變后則失去該功能。Hp感染時胃內(nèi)炎癥產(chǎn)生的氧自由基、超氧化物等可使P53基因突變或失活[12]。

    miRNA是一種單鏈RNA,以干擾mRNA翻譯的方式調(diào)控基因表達。miRNA在胃癌發(fā)病中起重要作用,且與Hp感染密切相關(guān)。Matsushima等[13]發(fā)現(xiàn),Hp感染可導(dǎo)致30個miRNA表達下調(diào),抗Hp治療后14個下調(diào)的miRNA 恢復(fù)表達,提示miRNA與Hp感染所致胃炎有關(guān),其機制可能與cagA有關(guān)。Hp+胃癌標(biāo)本較Hp-胃癌標(biāo)本miR-2l,miR-221及miR-222表達顯著增加,miR-218表達下降[14-15],表明Hp感染可能是通過miRNA異常表達促進胃癌發(fā)生。

    miR-192能調(diào)控細胞的生長、增殖和細胞周期等多種生物學(xué)行為,與基因的激活、失活和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),是研究癌變機制的熱點。miR-192在肝臟和結(jié)腸組織中表達豐富,在相應(yīng)腫瘤組織中表達下調(diào),是一種抑癌miRNA,其在腎臟[16]、大腸腺癌組織[17]均有表達。miR-192可抑制細胞周期,轉(zhuǎn)染miR-192后,大腸癌Hct 116細胞周期停滯在G1和G2-M期[18]。有研究提示,胃癌組織較正常組織miR-192表達上調(diào),miR-192模擬物顯著促進胃癌細胞株HFE145生長,其抑制劑抑制胃癌細胞株NCI-N87生長[19]。本研究顯示,miR-192在胃癌患者中表達升高,且Hp+胃癌組織中miR-192表達上調(diào),miR-192表達與Hp感染、淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān),提示Hp感染能促進miR-192表達上調(diào),并導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展,與文獻研究結(jié)果一致。在Hp+MKN-45細胞中抑制miR-192表達,可抑制細胞增殖。在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)P53 3′-UTR區(qū)能夠與miR-192結(jié)合,熒光素酶報告實驗證實miR-192與P53的靶向關(guān)系。此外,在Hp+胃癌細胞中,miR-192負(fù)調(diào)控P53在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平上的表達。P53是與人類腫瘤相關(guān)的且被廣泛研究的基因,正常P53蛋白是一種能通過控制G0~G1期細胞進入S期而抑制細胞增殖的調(diào)控因子,發(fā)生突變的P53基因會影響蛋白抑制細胞增殖的作用,令腫瘤更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-192可通過直接負(fù)調(diào)控下游抑癌基因P53的表達,促進Hp+胃癌細胞的增殖過程。

    綜上所述,miR-192在胃癌患者中表達升高,其變化與Hp感染、淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)。miR-192是一種促癌miRNA,可能通過靶向抑癌基因P53來促進Hp+胃癌細胞增殖。但關(guān)于Hp與miR-192如何相互作用及miR-192是否通過其他機制來調(diào)控Hp+胃癌的發(fā)生發(fā)展仍需進一步深入研究。

    [參考文獻]

    [1]? ?王少明,鄭榮壽,張思維,等.2015年中國胃癌流行特征分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2019,40(12):1517-1521.

    [2]? ?Hajibabaie F,Kouhpayeh S,Mirian M,et al. MicroRNAs as the actors in the atherosclerosis scenario[J].J Physiol Biochem,2020,76(1):1-12.

    [3]? ?Karatas OF,Oner M,Abay A,et al. MicroRNAs in human tongue squamous cell carcinoma: From pathogenesis to therapeutic implications[J].Oral Oncol,2017,67:124-130.117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

    [4]? ?Azarbarzin S,Safaralizadeh R,Khojasteh MB,et al. Current perspectives on the dysregulated microRNAs in gastric cancer[J].Mol Biol Rep,2020,47(9):7253-7264.

    [5]? ?Yan Y,Wang R,Guan W,et al. Roles of microRNAs in cancer associated fibroblasts of gastric cancer[J].Pathol Res Pract,2017,213(7):730-736.

    [6]? ?Abuderman AWA,Syed R,Mateen A,et al. Epidemiological characterization,genetic alterations of Helicobacter pylori infection in chronic gastric disorder and prognostic values of heterozygosity loss in chromosome 3p[J].Mol Biol Rep,2019,46(4):4323-4332.

    [7]? ?魏華,張蕾蕾,李艷,等.PGⅠ、PGⅡ、G-17和Hp IgG抗體篩查慢性萎縮性胃炎和胃癌的價值[J].中國免疫學(xué)雜志,2016,32(9):1360-1363.

    [8]? ?劉改芳,林三仁.幽門螺桿菌感染與胃癌關(guān)系的研究進展[J].中國實用內(nèi)科雜志,2003,23(9):573-574.

    [9]? ?He Y,Wang C,Zhang X,et al. Sustained exposure to Helicobacter pylori lysate inhibits apoptosis and autophagy of gastric epithelial cells[J].Front Oncol,2020,10:581 364.

    [10]? Yao X,Liu D,Zhou L,et al. FAM60A,increased by Helicobacter pylori, promotes proliferation and suppresses apoptosis of gastric cancer cells by targeting the PI3K/AKT pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2020, 521(4):1003-1009.

    [11]? 李舒,劉滿華.胃癌與幽門螺桿菌感染及p53、ras基因突變的關(guān)系[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報,2012,33(9):966-967,985.

    [12]? 魏茜,余樹林,黃宜峰.胃癌組織中P53、IL-1β、NF-κB的表達及與幽門螺桿菌感染的相關(guān)性分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2019,27(3):228-231.

    [13]? Matsushima K,Isomoto H,Inoue N,et al. MicroRNA signatures in Helicobacter pylori-infected gastric mucosa[J].Int J Cancer.2011,128(2):361-370.

    [14]? Li F,Guo Y,Liu J,et al. The significance of elevated plasma expression of microRNA 106b~25 clusters in gastric cancer[J].PLoS One.2017,12(5):e0178 427.

    [15]? Liu W,Song N,Yao H,et al. miR-221 and miR-222 simultaneously target RECK and regulate growth and invasion of gastric cancer cells[J].Med Sci Monit,2015,21:2718-2725.

    [16]? Zhang L,Xu Y,Xue S,et al. Implications of dynamic changes in miR-192 expression in ischemic acute kidney injury[J].Int Urol Nephrol,2017,49(3):541-550.

    [17]? Ast V,Kordaβ T,Oswald M,et al. MiR-192,miR-200c and miR-17 are fibroblast-mediated inhibitors of colorectal cancer invasion[J].Oncotarget.2018,9(85):35 559-35 580.

    [18]? Georges SA,Biery MC,Kim SY,et al. Coordinated regulation of cell cycle transcripts by p53——Inducible microRNAs,miR-192 and miR-215[J].Cancer Res.2008,68(24):10 105-10112.

    [19]? 郭鵬.血清miR-192表達與晚期胃癌化療效果的關(guān)系[J].中國現(xiàn)代普通外科進展,2020,23(2):145-146,149.

    [20]? 朱明華.腫瘤抑制基因p53的生物學(xué)功能研究進展和意義[J].中華病理學(xué)雜志,2000,29(1):59-61.

    (收稿日期:2021-09-07)117D23AB-06A7-412F-8A2B-D3B8AC70CA84

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