高地芽胞桿菌CQC1抗菌肽抑制金黃色葡萄球菌的生物活性研究

陳 陳，佘媛媛，熊蘇婉，楊 成

（1.皖南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002）

芽孢桿菌作為一種重要菌種資源，可產(chǎn)生多種類型的抗菌成分，包括脂肽類、胞外蛋白和抗菌多肽等，表現(xiàn)出對腸道致病菌抑制活性，從而起到調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、防治消化道疾病以及提高機體免疫力等多重作用，在醫(yī)藥、食品及飼料添加劑等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1-3]。自Johnson等[4]在1945年報道枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)以來，后續(xù)多種抗菌活性成分陸續(xù)被分離出來，且對多種病原微生物具有抑制活性[5-7]。金黃色葡萄球菌在臨床上常引起化膿性感染，是一類重要的食源性病原體，可引發(fā)食物中毒。隨著大量抗生素的不合理使用，耐藥性金黃色葡萄球菌菌株出現(xiàn)的概率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[8-10]。目前，國內(nèi)關(guān)于車前草內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌方面[11-15]，有關(guān)車前草內(nèi)生芽孢桿菌拮抗金黃色葡萄球菌尚未見報道。高地芽胞桿菌CQC1是本實驗室從車前草組織中分離獲得的一株對金黃色葡萄球菌等多株革蘭氏陽性菌產(chǎn)生較強抑制作用的活性菌株，且主要活性成分為抗菌肽類物質(zhì)，而這些肽類物質(zhì)往往能夠造成細胞膜的損傷，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄而具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲和抗腫瘤等活性[16]。本實驗利用不同方式對菌株CQC1 胞外抗菌肽進行提取，考查其對金黃色葡萄球菌的抑制效果和穩(wěn)定性，同時通過考查活性肽對金黃色葡萄球菌細胞膜結(jié)構(gòu)影響來探討其作用機制，為高地芽胞桿菌CQC1的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 供試菌和病原菌

高地芽胞桿菌CQC1，從車前草組織中分離鑒定，本實驗室；金黃色葡萄球菌，本實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

NA 固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6。NA 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6。種子/發(fā)酵培養(yǎng)基（液體PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.3 菌株CQC1抗菌肽的制備及活性檢測

1.3.1 菌株CQC1種子及搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵

將菌株CQC1 接種于50 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h 作為種子。按10%體積比接種到裝有200 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h。然后12000 r/min 離心30 min，棄沉淀，取上清液用于抗菌肽提取物的制備。

1.3.2 菌株CQC1抗菌肽的提取[17]

1.3.2.1 正丁醇提取

取100 mL 上述發(fā)酵上清液，加入100 mL 正丁醇，兩種溶液充分混合后靜置過夜（12 h），用分液漏斗分離得到正丁醇，重復(fù)一次，60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮正丁醇，用水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的沉淀，冷凍干燥得到正丁醇提取物。

1.3.2.2 氯仿提取

取50 mL 上述發(fā)酵上清液，加入50 mL 氯仿，兩種溶液充分混合后靜置過夜（12 h），分離出氯仿層，55℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿，用水溶解旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的沉淀，冷凍干燥得到氯仿提取物。

1.3.2.3 硫酸銨飽和沉淀法

取50 mL 上述發(fā)酵上清液并向其中緩慢加入100% 飽和度的硫酸銨，邊加邊攪拌。待全部溶解后，置于4℃下靜置過夜，12000 r/min 離心30 min，保留沉淀，用蒸餾水溶解后冷凍干燥得抗菌肽提取物。

1.3.3 抗菌肽提取物的抗菌活性測試

采用牛津杯法：將保存的金黃色葡萄球菌在營養(yǎng)平板上培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)取一環(huán)轉(zhuǎn)接到50 mL NA 液體培養(yǎng)基37℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h，用無菌棉簽直接取少許培養(yǎng)物均勻涂布于NA固體培養(yǎng)基表面，然后放入牛津杯，并讓其自然下沉后，將上述制備的抗菌肽配制成濃度為5 mg/mL 的溶液，并用無菌0.22 μm 過濾除菌，吸取150 μL 作為活性測試樣品加入牛津杯中，輕輕移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，并測量抑菌圈直徑。重復(fù)3 次，取平均值作為該樣本抑菌結(jié)果。

1.4 正丁醇相抗菌肽提取物的理化性質(zhì)測定

1.4.1 溫度穩(wěn)定性測定

將裝有10 mL 抗菌肽提取物的試管分別置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃中處理1 h，121℃處理30 min，以未處理的樣品為對照，采用牛津杯法測量菌落直徑，處理及計算方法同1.3.3，每處理3 次重復(fù)。

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性測定

將10 mL 抗菌肽溶液分別調(diào)pH 值為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 ，在常溫下處理1 h后，再調(diào)回pH為7.0，以未處理的樣品為對照，采用牛津杯法測量菌落直徑，處理及計算方法同1.3.3，每處理3次重復(fù)。

1.4.3 水解酶穩(wěn)定性測定

將10 mL 抗菌肽溶液分別與等體積的胰蛋白酶溶液、蝸牛酶溶液和胃蛋白酶溶液混勻（各種酶終濃度為1 mg/mL），于37℃水浴鍋中反應(yīng)60 min，4℃冷卻。以未處理的樣品為對照，采用牛津杯法測量菌落直徑，處理及計算方法同1.3.3，每處理3次重復(fù)。

1.5 菌株CQC1抗菌肽對金黃色葡萄球菌細胞膜的損傷

1.5.1 大分子釋放量的測定

參照文獻[18]方法，將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期（24 h），用NA 液體培養(yǎng)基重懸后，加入菌株CQC1 抗菌肽，使其終質(zhì)量濃度為5 mg/mL（處理組），對照組加入等體積的無菌水，于37℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)，每隔2 h 取10 mL 菌懸液，6000 r/min 離心10 min 后棄沉淀，分別測定上清液在260 nm和280 nm波長處的吸光度。每組3次重復(fù)，數(shù)據(jù)取平均值。

1.5.2 β-半乳糖苷酶活力的測定

參照文獻[19]，取金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)期菌液，混合后分為抗菌肽處理組和對照組。抗菌肽處理組測3 個濃度，最終質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL；對照組加等量無菌水，37℃培養(yǎng)箱中處理1 h后，分別吸取1 mL，12000 r/m 離心10 min，取上清液，加入4 mL 0.05 mol/L ONPG，37℃水浴40 min，然后加入0.5 mol/L Na2CO35 mL 終止反應(yīng)，420 nm 處測量其OD 值。重復(fù)3次，計算平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗，數(shù)據(jù)以xˉ±S 表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株CQC1 發(fā)酵液不同提取方式獲得抗菌肽提取物抗菌活性的比較

高地芽胞桿菌發(fā)酵液中抗菌活性成分一般為抗菌肽類及蛋白類物質(zhì)[20]，而對該類活性成分的提取最常用的方法為硫酸銨飽和沉淀法、有機溶劑萃取及酸沉淀法。硫酸銨飽和沉淀法比較適用于大分子肽類及蛋白類，酸沉淀一般適用于脂肽類物質(zhì)，而有機溶劑提取主要根據(jù)極性不同而分別提取不同極性的物質(zhì)，如正丁醇屬于極性有機溶劑，適合于極性物質(zhì)提取，而氯仿屬于中低極性有機溶劑，適合提取極性小的物質(zhì)[21-23]。結(jié)果，不同提取方式提取的菌株CQC1 抗菌肽對金黃色葡萄球菌抑制效果也不盡相同，見圖1 所示，從抑菌直徑可以看出，正丁醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，平均直徑達到（28.6±0.2）mm；其次是硫酸銨飽和沉淀法提取的抗菌肽，對金黃色葡萄球菌也顯示明顯抑制作用，平均抑菌圈直徑為（19.7±0.4）mm；而氯仿提取物效果最差，沒有形成明顯的抑菌圈，表明抗菌物質(zhì)屬大極性類物質(zhì)。

圖1 不同提取方式對金黃色葡萄球菌的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different extraction methods on Staphylococcus aureus

2.2 菌株CQC1正丁醇提取抗菌肽提取物的穩(wěn)定性

2.2.1 熱穩(wěn)定性試驗

將抗菌肽提取物分別用40℃～121℃共8 個溫度處理，結(jié)果見表1所示，隨著處理溫度的升高，不同溫度處理后的抗菌肽提取物抑菌活性之間存在一定的差異，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.073，P＜0.05）。組間兩兩比較，經(jīng)S-N-K 檢驗顯示40℃、50℃、60℃、70℃、80℃及對照組（CK）相比之間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），60℃與90℃、100℃處理組間相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），在121℃下抑菌活性與CK 相比，活性為85.7%，降低了14.3%。

2.2.2 酸堿穩(wěn)定性試驗

抗菌肽提取物經(jīng)6個不同pH 處理后，其穩(wěn)定性結(jié)果見表1 所示，經(jīng)不同酸堿處理后，抗菌肽提取物抑菌活性之間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=40.466，P＜0.05）。經(jīng)S-N-K 檢驗顯示，pH 分別為1.0、3.0、5.0、9.0時組間兩兩比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），pH=7.0與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5）。表明該抗菌肽在酸性、中性或偏堿性環(huán)境中都比較穩(wěn)定，在強堿性環(huán)境中穩(wěn)定性有所下降。

2.2.3 水解酶穩(wěn)定性試驗

抗菌肽提取物被胰蛋白酶、蝸牛酶和胃蛋白酶處理，表現(xiàn)出抑菌活性之間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=34.028，P＜0.05），經(jīng)S-N-K 檢驗顯示，蝸牛酶和胃蛋白酶處理間比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.5），結(jié)果見表1。

表1 溫度、pH和蛋白酶對菌株CQC1正丁醇抗菌肽提取物的影響（n=3）Tab.1 Effect of temperature，pH，proteases on antimicrobial peptide extract from strain CQC1

2.3 菌株CQC1抗菌肽對金黃色葡萄球菌細胞膜的損傷

2.3.1 大分子釋放量分析

細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏是細胞膜通透性改變或破損的重要指標之一，因此，可以通過檢測胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)泄漏情況，間接地反映細胞膜的損傷程度。金黃色葡萄球菌經(jīng)抗菌肽提取物處理后胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況如圖2 所示。隨著時間的延長，處理組核酸和蛋白釋放量都高于對照組，尤其在4 h 之后，相比于對照組，二者差距逐漸增大，核酸釋放量急劇上升，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=85.361，P＜0.05），見圖2A。而蛋白釋放量相比于對照組，增加得比較平緩，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.852，P＜0.05），見圖2B，且不同時間處理組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明該抗菌肽能通過改變金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，引起膜內(nèi)物質(zhì)泄漏到胞外，進而達到誘使菌體死亡的目的。

圖2 抗菌肽提取物對金黃色葡萄球菌胞內(nèi)大分子釋放量的影響Fig.2 Effect of antimicrobial peptide extract on intracellular macromolecule release of Staphylococcus aureus

2.3.2 抗菌肽提取處理后對金黃色葡萄球菌菌液中β-半乳糖苷酶活力變化的影響

β-半乳糖苷酶位于細胞膜內(nèi)，正常情況下不會向細胞外分泌，但如果細胞膜的通透性增大，β-半乳糖苷酶就可能從胞內(nèi)釋放到細胞外，因此，通過檢測培養(yǎng)液中β-半乳糖苷酶活性可間接反映細胞膜的通透性[19]。經(jīng)不同濃度抗菌肽作用后菌液中β-半乳糖苷酶活力測定結(jié)果見圖3?？咕臐舛仍? mg/mL 時，處理組和對照組β-半乳糖苷酶活力基本沒有變化，表明胞內(nèi)β-半乳糖苷酶未出現(xiàn)外漏，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.865，P＞0.05）；當抗菌肽濃度高于5 mg/mL 時，菌液中β-半乳糖苷酶活性開始升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.536，P＜0.05），表明大量的β-半乳糖苷酶從胞內(nèi)泄漏到菌液中。低濃度（1 mg/mL）與中濃度（5 mg/mL）處理組和高濃度（10 mg/mL）處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中濃度（5 mg/mL）處理組和高濃度（10 mg/mL）處理組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中β-半乳糖苷酶活力測定Fig.3 Determination of β-galactosidase activity in culture medium of Staphylococcus aureus

3 結(jié)論

本實驗通過不同提取方式來獲取高地芽胞桿菌CQC1發(fā)酵液中肽類抗菌物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸銨飽和沉淀法和正丁醇提取物均能提取肽類抗菌物質(zhì)，且正丁醇提取物活性強于硫酸銨飽和沉淀物，氯仿相沒有顯示出抗菌活性，表明發(fā)酵液中抗菌肽提取物活性成分極性可能比較大，易溶于正丁醇，且正丁醇在一定程度上起到提取和濃縮的作用。因此，選取正丁醇相抗菌肽提取物進行穩(wěn)定性和抗菌機制的研究，結(jié)果表明，正丁醇相抗菌肽提取物經(jīng)不同pH、溫度和水解酶處理后，抗菌活性之間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)121℃處理30 min 活性僅降低了14.3%；pH 11.0 處理后，抑菌活性下降了9.5%；通過大分子釋放量和β-半乳糖苷酶活性測定結(jié)果表明，高地芽胞桿菌CQC1產(chǎn)抗菌肽可以改變金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，引起膜內(nèi)物質(zhì)泄漏到胞外，從而產(chǎn)生抗菌活性。