貫葉連翹-舍曲林聯用對抑郁模型大鼠的藥效學和藥動學相互作用研究

李如月 戴國梁 楊欣怡 陳閃閃 曹 陽 劉美琛 王一清 李斐然 居文政

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇南京 210029）

抑郁癥是一種心理或情感障礙疾病，主要表現為心情低落、興趣減低、思維遲緩、認知功能受損，具有高發(fā)病率、高致殘率和高自殺率的特點。世界衛(wèi)生組織預測，到2030年抑郁癥將成為全球疾病負擔第一位的病種[1]。抑郁癥病因病機復雜、類型多樣、伴發(fā)癥狀多，臨床治療常采用綜合療法，其中中藥在改善癥狀、減輕不良反應、保護神經細胞等方面具有較好的效果[2]。研究顯示，中西藥聯用在治療抑郁癥方面優(yōu)于單用西藥，起效時間快、臨床療效較好且安全性高[3-4]。

貫葉連翹的主要成分為金絲桃素和貫葉金絲桃素，現代藥理學研究表明貫葉連翹具有抗抑郁、抗病毒、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[5]。貫葉連翹在歐洲用于治療抑郁癥已有百余年歷史且療效確切[6]，其可能通過抑制5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）和去甲腎上腺素（NE）的再攝取，產生抗抑郁作用[7-8]。舍曲林是選擇性5-HT再攝取抑制劑（SSRI）的代表藥物之一，臨床用于抑郁癥的治療，療效確切，但起效較慢。課題組對貫葉連翹與舍曲林聯用改善皮質酮誘導大鼠抑郁樣行為的效果及機制進行了研究，同時通過藥代動力學研究，揭示舍曲林在正常大鼠體內、舍曲林聯合貫葉連翹和單獨給藥在抑郁模型大鼠體內藥代動力學的差異，以期能為臨床合理用藥提供依據，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，體質量（220±10）g，購自南通大學動物實驗室，許可證號：SCXK（蘇）2019-0001，實驗前適應性喂養(yǎng)1周，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫（22±2）℃，自由攝食飲水。本研究經南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過（批件號：2022DW-08-02）。

1.2 實驗儀器 Waters Quattro Micro液質聯用儀（美國Waters公司）；Masslynx 4.0色譜工作站；CPA225D型 電子天平（德國Sartorius）；Legend Micro17R型冷凍離心機（美國Thermo公司）；Drict-Q5超純水機（美國Millipore公司）；WH-2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Labconco離心濃縮儀（美國Labconco公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；全波長酶標儀Rayto RT-6100（美國Thermo公司）。

1.3 藥物與試劑 貫葉連翹提取物片（德國拜耳制藥，規(guī)格：900 mg/片，生產批號：6041810）；鹽酸舍曲林片（輝瑞制藥有限公司，規(guī)格：50 mg/片，生產批號：DH7541）；皮質酮（CORT，梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；舍曲林標準品（批號：100702-201602，規(guī)格：50 mg）和替米沙坦標準品（批號：100629-201803，規(guī)格：100 mg/支）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度經HPLC法檢測均大于99.0%；大鼠5-HT、NE、DA和腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥 將雄性SD大鼠按照隨機數字表法隨機分為空白組與造模組，造模組大鼠采用皮下注射20 mg/kg皮質酮（以0.1%二甲基亞砜和0.1%吐溫80生理鹽水為溶媒）的方法建立抑郁癥模型，空白組皮下注射相同劑量的溶媒，每日1次于上午9∶00—11∶00之間注射，連續(xù)21 d。隨后所有大鼠進行糖水偏好試驗，造模組大鼠糖水消耗率明顯低于空白組，說明造模成功。將造模組和空白組大鼠分別隨機分為8組，每組6只。其中藥效學實驗5組，分別為空白組、模型組、舍曲林組（20 mg/kg）、貫葉連翹組（90 mg/kg）、貫葉連翹和舍曲林聯用組（給藥劑量同單用組）；藥動學實驗3組，分別為空白舍曲林組（20 mg/kg）、模型舍曲林組（20 mg/kg）、模型貫葉連翹和舍曲林聯用組（貫葉連翹90 mg/kg、舍曲林20 mg/kg）。

藥效學實驗各組于造模完成后第2日開始，連續(xù)灌胃給予藥物或等量溶劑14 d，每日于同一時間灌胃1次。藥動學實驗，于造模完成后第2日開始模型貫葉連翹和舍曲林聯用組連續(xù)灌胃給藥貫葉連翹提取物14 d，其余2組灌胃等量溶劑，在灌胃開始后第15日3組大鼠灌胃給予舍曲林1次。

2.2 藥效學實驗

2.2.1 糖水偏好試驗 分別于造模完成后與給藥結束后對各組大鼠進行糖水偏好試驗。試驗前讓大鼠提前適應2 %蔗糖水1 d，隨后禁水18 h，每只大鼠給予1瓶500 mL 2%蔗糖水溶液和1瓶純凈水，測試4 h，其中2 h后2瓶交換位置，測試結束后計算糖水消耗率。糖水消耗率（%）=糖水攝入量/（糖水攝入量+純凈水攝入量）×100%，其中糖水或純凈水攝入量均按克（g）計。

2.2.2 體質量檢測 分別于造模完成后與給藥結束后按照動物編號對各組大鼠進行稱重，記錄體質量。

2.2.3 強迫游泳試驗 給藥結束后對各組大鼠進行強迫游泳試驗。試驗前進行游泳適應，將大鼠置于（24±2）℃水桶中，保持大鼠懸浮，四肢不能接觸桶底，試驗過程中保持安靜。次日在相同條件下強迫游泳5 min，記錄后4 min的大鼠不動時間，即大鼠僅有頭部露出水面，呈漂浮狀態(tài)，四肢可有微動狀態(tài)的時間。

2.2.4 動物取材及樣本處理 行為學實驗結束后，各組大鼠采用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，1530×g離心10 min后取血清，-80 ℃冰箱保存待測。隨后大鼠頸椎脫臼法處死，冰上快速分離海馬組織，液氮速凍后存儲于-80 ℃冰箱備用。

2.2.5 ELISA檢測大鼠海馬及血清中5-HT、DA、NE及BDNF水平 取大鼠海馬組織和血清，按試劑盒說明書中的方法檢測各組大鼠海馬組織和血清中5-HT、DA、NE和BDNF水平。

2.3 藥動學實驗

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，流動相：乙腈/0.1%甲酸（41∶59）；流速為0.2 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量5 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧（ESI）離子源，噴霧電壓為3500 V，溫度320 ℃。陽離子方式掃描，掃描方式為多反應監(jiān)測（MRM）。m/z：305.9 →158.6（舍曲林）；m/z：515.1→276.0（替米沙坦）。

2.3.3 動物取材及樣本處理 各組大鼠于舍曲林給藥 后0、0.25、0.35、1.25、3、4、5、6、8、9、10、11、12、16、24 h眼眶取血約0.25 mL，肝素鈉抗凝，1530×g離心10 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱備測。

2.3.4 血漿樣品處理 血漿樣品于室溫下解凍，精密吸取100 μL至1.5 mL離心管，加入濃度為500 ng/mL內標替米沙坦10 μL，渦旋10 s，加入800 μL乙酸乙酯，振蕩3 min，13 800×g離心10 min，取750 μL上清液至另一個離心管，置于離心濃縮儀揮干后用100 μL流動相溶解，取10 μL于具內襯管的進樣瓶中運用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定血漿中舍曲林含量。

2.3.5 藥動學參數計算 根據LC-MS/MS所得數據，采用DAS 2.0軟件計算藥動學參數：半衰期（t1/2）、達峰時間（Tmax）、血藥峰濃度（Cmax）、藥時曲線下面積[AUC（0-t）和AUC（0-∞）]。

2.4 統計學方法 使用SPSS 19.0軟件通過單因素方差分析（One-Way ANOVA）對各組數據進行比較，計量數據用（）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。藥動學參數采用DAS 2.0軟件計算，結果用（）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 藥效學實驗

3.1.1 各組大鼠行為學指標比較 除空白組外，其余各組大鼠造模完成后糖水消耗率、體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），說明基線平衡。干預結束后，模型組大鼠糖水消耗率、體質量顯著低于空白組（P＜0.01，P＜0.05），游泳不動時間顯著高于空白組（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組上述行為學指標均有顯著改善（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠干預結束后行為學指標比較（）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.1.2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、NE、DA和BDNF水平比較 與空白組比較，模型組大鼠海馬和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平顯著降低（P＜0.01）。貫葉連翹組大鼠海馬組織5-HT、DA、BDNF水平和血清NE水平，舍曲林組海馬組織DA水平，貫葉連翹和舍曲林聯用組海馬組織5-HT、DA、NE、BDNF水平和血清5-HT、NE水平均顯著高于模型組（P＜0.05）；貫葉連翹和舍曲林聯用組海馬組織5-HT水平顯著高于貫葉連翹組、舍曲林組（P＜0.05，P＜0.01），海馬組織NE、BDNF和血清5-HT、NE水平顯著高于舍曲林組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平比較（）

表2 各組大鼠海馬組織和血清5-HT、DA、NE和BDNF水平比較（）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與貫葉連翹組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與舍曲林組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

3.2 藥動學實驗 3組大鼠灌胃給予舍曲林后藥動學參數結果見表3，血藥濃度-時間曲線見圖1。與空白舍曲林組比較，模型舍曲林組大鼠血漿中舍曲林Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）顯著增加（P＜0.01，P＜0.05）；與模型舍曲林組比較，模型貫葉連翹和舍曲林聯用組舍曲林Tmax顯著降低（P＜0.05），Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）顯著增加（P＜0.01）。另外，由分析結果可知，舍曲林在大鼠體內的藥動學符合一室開放模型。

表3 各組大鼠血漿舍曲林藥動學參數比較（）

表3 各組大鼠血漿舍曲林藥動學參數比較（）

注：與空白舍曲林組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型舍曲林組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

圖1 各組大鼠體內舍曲林平均血藥濃度-時間曲線（n=6）

4 討論

對嚙齒類動物重復注射皮質酮已經被公認是一個可靠的制作慢性應激性抑郁障礙動物模型的方法[9]。皮質酮重復皮下注射給藥可以誘導小鼠抑郁樣行為，下調海馬區(qū)5-HT水平[10]，還可以降低海馬組織內的BDNF表達[11]。本實驗結果亦證明皮質酮皮下注射制作抑郁癥大鼠模型成功。

5-HT受體是單胺類神經遞質受體的一部分，單胺類神經遞質受體的降低是抑郁癥發(fā)病的重要原因[1]。研究表明，5-HT、NE和DA等神經遞質對情緒、心理壓力的反應性、自我控制、動機、驅動力和認知表現產生重大影響[12]。研究發(fā)現，5-HT、NE和DA在抑郁癥患者血清中的表達明顯低于正常人，且含量越低臨床癥狀越嚴重[13]。隨著對抑郁癥發(fā)病機制更為深入的研究，腦內海馬區(qū)BDNF的表達異常也逐漸受到重視[14]。BDNF是哺乳動物腦內分布最廣、含量最高的神經營養(yǎng)因子，主要集中在中樞神經系統，尤其是大腦皮質和海馬區(qū)域[15]。本研究結果表明，與模型組比較，在大鼠海馬組織中，舍曲林組只有DA水平顯著回調，貫葉連翹組5-HT、DA和BDNF水平有顯著回調，貫葉連翹和舍曲林聯用組5-HT、DA、NE和BDNF水平都有顯著回調；在血清中，舍曲林組大鼠上述4個指標均無顯著變化，貫葉連翹組只有NE水平顯著回調，貫葉連翹和舍曲林聯用組5-HT和NE水平有顯著回調。舍曲林組5-HT水平雖然較模型組比較差異無統計學意義，但是也有回調趨勢，可能與舍曲林起效時間長有關。各給藥組之間比較，貫葉連翹和舍曲林聯用組大鼠海馬組織5-HT水平顯著高于2個單獨給藥組，血清5-HT水平顯著高于舍曲林組，可能由于兩種藥物作用機制相似，都能抑制5-HT的再攝取，從而在聯合治療時5-HT水平改善更為顯著。綜合以上結果，雖然部分指標組間比較無統計學差異，但是整體看來4項指標經藥物干預均有回調趨勢，其中貫葉連翹和舍曲林聯用組改善最為明顯。

藥動學結果顯示，模型舍曲林組的Cmax、AUC（0-t）和AUC（0-∞）分別是空白舍曲林組的1.48、1.50、1.50倍，模型貫葉連翹和舍曲林聯用組的Cmax，AUC（0-t）和AUC（0-∞）分別是模型舍曲林組的1.62、1.53、1.53倍，Tmax僅為其的0.67倍，說明聯合使用了貫葉連翹后，縮短了舍曲林的起效時間，提高了吸收率，生物利用度更高。舍曲林在體外與P糖蛋白（P-gp）具有很高的親和力[16]，而P-gp表達的缺失可能導致抑郁癥[17]，因此抑郁狀態(tài)下P-gp下調可能導致舍曲林在血漿中暴露量增加。另據文獻報道，貫葉連翹提取物的一種有效成分貫葉金絲桃素能夠抑制P-gp的外排[18]，這也可能導致舍曲林在血漿中的暴露量增加。有文獻報道，貫葉連翹雖可以誘導CYP2C19活性[19]，但是抑郁狀態(tài)下的大鼠單胺類神經遞質紊亂、炎癥因子增加等病理狀態(tài)，也可能導致體內的一些代謝酶活性的變化[20]，從而導致體內血藥濃度的變化。因此，我們推測，在大鼠抑郁狀態(tài)下，與單用舍曲林相比貫葉連翹與舍曲林聯合應用后舍曲林在血漿中暴露量發(fā)生了顯著性變化，可能是一種或者多種因素共同作用的結果，其具體作用機制可應用Cocktail探針和Western Blot方法分別證實，這是我們下一步的研究方向。值得注意的是，抑郁癥狀態(tài)下也可能導致血藥濃度發(fā)生變化，提示臨床上對抑郁癥患者的用藥劑量要及時調整。

抑郁癥發(fā)病機制復雜、影響因素較多，西藥多數只針對單一機制治療，存在著治療效果差、起效時間長、不能涵蓋所有抑郁類型等不足。中西藥聯合應用具有多機制、多靶點共同作用的優(yōu)勢，已成為臨床治療抑郁癥的有效手段。不同的藥物聯合應用，其抗抑郁作用可能增加，但是由于藥物相互作用，也可能降低療效甚至產生毒副作用。本研究結果表明，貫葉連翹和舍曲林聯合應用對改善皮質酮誘導的大鼠抑郁樣行為有較好的作用，且起效時間短，對癥狀和血清學指標的改善效果優(yōu)于單用舍曲林或貫葉連翹，結合藥動學實驗結果，推測其可能的原因是由于二者聯合用藥后舍曲林在血漿中暴露量增加，也可能由于二者聯合用藥協同增效。本實驗的給藥劑量為臨床等效劑量，實際臨床中如何控制好量效關系，使之最優(yōu)化也至關重要，這也是我們下一步的研究方向。