響應(yīng)面法優(yōu)化蔗葉纖維素乙酸酯的制備工藝

周永升，張思原，龍勇益，蘇 龍，韋巧艷，蔡吉祥，唐 森，柳富杰*

(1廣西科技師范學(xué)院，廣西現(xiàn)代蔗糖業(yè)發(fā)展研究院，廣西來賓 546199；2廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004)

0 引言

纖維素(Cellulose)是由β-D-葡萄糖基之間以β-1,4-糖苷鍵形成的鏈狀高分子，其分子鏈中每個葡萄糖單元上有3個活躍羥基，可以進(jìn)行羥基的醚化反應(yīng)、酯化反應(yīng)及接枝共聚反應(yīng)等[1]。由于纖維素具有可降解、無毒、無環(huán)境污染、來源廣泛等特點(diǎn)[2]，纖維素已廣泛應(yīng)用于建筑[3]、造紙[4]、食品[5]、醫(yī)藥[6]等多個領(lǐng)域。纖維素廣泛存在于自然界中，植物纖維素的提取方法主要有堿處理法[7]、生物酶法[8]、蒸汽爆破法[9]、有機(jī)溶劑法[10]等?，F(xiàn)如今，纖維素改性主要集中在以下3種方法：①物理改性，如高能電子輻照處理[11]、溶劑交換[12]、微波[13]和超聲波[14]處理等；②化學(xué)改性，如酯化反應(yīng)[15]、醚化反應(yīng)[16]、接枝共聚反應(yīng)[17]等；③生物改性，包括酶的水解[18]、微生物降解氧化[19]等。

近年來，甘蔗葉資源浪費(fèi)已經(jīng)成為我國較大的環(huán)境問題，甘蔗葉是制糖工業(yè)過程中的廢棄物，是一種可再生生物質(zhì)資源，甘蔗葉中含有50%左右的纖維素[20]。但是國內(nèi)對甘蔗葉的利用不合理，在采集甘蔗時直接對甘蔗葉進(jìn)行丟棄或者就地焚燒，大大浪費(fèi)了資源且污染環(huán)境[21]。因此，為了合理利用廢棄物資源，可以從甘蔗葉中提取出優(yōu)質(zhì)的纖維素并進(jìn)行高附加值的加工生產(chǎn)，將很大程度上拓寬甘蔗葉的綜合利用渠道。

本研究是利用堿處理手段提取蔗葉纖維素，并且對蔗葉纖維素進(jìn)行乙?；男?，制備出取代度較高的蔗葉纖維素乙酸酯(Sugarcane Leaf Cellulose Acetate，SLCA)。纖維素乙酸酯(Cellulose Acetate，CA)是一種食品、化工的重要原輔材料，本研究主要以蔗葉纖維素為原料，考慮?；瘎┡c蔗葉纖維素的液料比、酰化劑的組成比例、濃硫酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間作為考察因素，探索它們與酯化取代度(Degree of Substitution，DS)的關(guān)系，再通過響應(yīng)面設(shè)計試驗(yàn)優(yōu)化蔗葉纖維素乙?；男缘臈l件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗葉是甘蔗梢和種植期間剝離的混合樣品。酶制劑：熱穩(wěn)定α-淀粉酶(酶活≥3.5 U/mg，上海穎心實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；堿性蛋白酶(酶活≥200 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；脂肪酶(酶活≥30 U/mg，上海源葉生物有限公司)。其他試劑均為分析純。儀器設(shè)備：FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004型分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海識捷實(shí)業(yè)有限公司)；GZX-GF101-3 BS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；HH-S8型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；H1850型臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蔗葉的預(yù)處理

⑴粉碎過篩：將清洗過的甘蔗葉在65℃±5℃下烘干，然后剪切成小段，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩密封保存。

⑵參考林杰[22]等人的方法去除蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪：用相對于蔗葉粉末質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%混合酶(蛋白酶和α-淀粉酶質(zhì)量比為1∶3)溶液浸泡蔗葉粉末，其中液料比為20∶1，在65℃下酶解90 min，過濾，再將酶解后的濾渣用蒸餾水洗凈。將濾渣用液料比為20∶1的脂肪酶溶液進(jìn)行酶解，脂肪酶用量為0.4%、溫度為50℃、酶解時間為60 min，之后使用100℃水浴滅酶10 min，再用蒸餾水將濾渣洗至中性，放入65℃±5℃烘干，粉碎過40目篩備用。

⑶參考李春光[23]、Gil-López[24]、Ann[25]等人的方法去除木質(zhì)素和半纖維素：稱取上述粉末，按液料比30∶1加入體積分?jǐn)?shù)0.7%的H2O2和質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH混合溶液，在85℃下攪拌4 h，濾渣用蒸餾水洗凈，65℃±5℃干燥后粉碎過40目篩。然后取堿液處理后的粉末，按液料比30∶1加入31 mL/L乙酸和9.5 g/L NaClO2混合溶液，在75℃下處理1 h，過濾后用蒸餾水洗滌至中性，65℃±5℃烘干后粉碎過100目篩備用。纖維素含量的測定按照李春光[23]的方法平行測定3次。

1.2.2 乙?；崛~纖維素的制備

將2 g蔗葉纖維素和一定體積的乙酸酐-冰乙酸混合溶液加入到圓底燒瓶中，并且加入一定量的濃硫酸作為反應(yīng)催化劑。在一定溫度下，于回流冷凝裝置中反應(yīng)一段時間，反應(yīng)結(jié)束后，將圓底燒瓶取出，冷卻至室溫后加入50 mL的無水乙醇沉淀1 h，抽濾，用蒸餾水沖洗濾渣至中性，除去沒有反應(yīng)完全的乙酸。最后將濾渣在30℃下真空干燥至恒重，測定DS值。按照傅七蘭[26]的醇皂法平行測定3次。

1.2.3 制備乙?；崛~纖維素的單因素試驗(yàn)設(shè)計

按照1.2.2節(jié)的制備步驟進(jìn)行?？紤]液料比(15∶1，20∶1，25 1∶，30∶1，35 1∶)、相對于冰乙酸的乙酸酐體積分?jǐn)?shù)(40%、45%、50%、55%、60%)、相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液的濃硫酸體積分?jǐn)?shù)(0、0.25%、0.5%、0.75%、1%)、酯化溫度(80、85、90、95、100℃)、酯化時間(1.5、2、2.5、3、3.5 h)等因素和水平。固定相對于冰乙酸的乙酸酐體積分?jǐn)?shù)為50%、相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液的濃硫酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%、酯化溫度為90℃、酯化時間為2.5 h，以DS為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)得到最佳液料比，再依次確定其他因素的水平。最后進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果，篩選合適的3個因素進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以DS為指標(biāo)進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計見表1。確定最佳制備工藝，并建立數(shù)學(xué)模型，分析因素間的相互作用。通過規(guī)劃求解后得到工藝條件的理論值，重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢查工藝的穩(wěn)定性、模型的準(zhǔn)確性。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計表

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、標(biāo)準(zhǔn)偏差計算及表格制作，使用Minitab 18進(jìn)行Tukey多重比較分析(α=0.05)，運(yùn)用Excel 2016和Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 液料比

蔗葉經(jīng)過預(yù)處理后得到了纖維素含量為92.56%的樣品。使用該樣品進(jìn)行乙酰化改性，研究料液比對DS的影響，結(jié)果見圖1。液料比在15～35 mL/g范圍內(nèi)，DS呈先上升后下降的趨勢，但是不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。液料比過低時底物較少，乙?；Ч缓?，隨著液料比的升高，酯化反應(yīng)向正方向進(jìn)行，DS也在上升，在液料比達(dá)到25 mL/g時，DS為2.248。但當(dāng)液料比超過25 mL/g時，DS反而減小。原因可能有2方面：一是過量的乙?；噭┮种屏朔磻?yīng)的進(jìn)行，二是過量的乙酸酐使得反應(yīng)體系呈較強(qiáng)的酸性，導(dǎo)致生成的纖維素乙酸酯發(fā)生分解[27]。綜上，確定最佳液料比為25 mL/g。 2.1.2 乙酸酐體積分?jǐn)?shù)

圖1 料液比對DS的影響

試驗(yàn)考察了乙酸酐體積分?jǐn)?shù)(相對于冰乙酸40%～60%)對DS的影響，由圖2可知，DS先顯著上升后(P＜0.05)再略微下降，即當(dāng)乙酸酐體積分?jǐn)?shù)大于45%之后，DS差異不顯著(P＞0.05)。DS隨著乙酸酐體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸上升，在乙酸酐體積分?jǐn)?shù)為50%時DS達(dá)到最大，DS等于2.250。因?yàn)楫?dāng)乙酸酐體積分?jǐn)?shù)增加時，酯化反應(yīng)平衡向正方向移動；同時，隨著酯化反應(yīng)的進(jìn)行，酯化反應(yīng)生成的水會參與水解反應(yīng)，促進(jìn)酯化反應(yīng)，有利于提高DS[28]。當(dāng)乙酸酐體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，會導(dǎo)致DS逐漸下降。因?yàn)轷セ磻?yīng)是可逆的，而且酸對纖維素有一定的降解作用，所以DS低于理論值3.0[28]。綜上，確定最佳乙酸酐體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖2 乙酸酐體積分?jǐn)?shù)對DS的影響

2.1.3 濃硫酸體積分?jǐn)?shù)

試驗(yàn)考察了濃硫酸體積分?jǐn)?shù)(相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液0～1%)對DS的影響，由圖3可知，DS先顯著上升后再顯著下降(P＜0.05)，當(dāng)濃硫酸體積分?jǐn)?shù)為0.50%時DS達(dá)到最大，DS等于2.231。因?yàn)槔w維素的乙?；磻?yīng)需要在無水體系中進(jìn)行，使用濃硫酸作催化劑可以減少反應(yīng)體系中的水，從而減少產(chǎn)物水解；當(dāng)濃硫酸用量過大時，纖維素發(fā)生氧化降解，且在乙?；^程中會生成少量的纖維素硫酸酯、纖維素磺醋酸混合酯、乙酰硫酸等[26,28]。綜上，確定最佳濃硫酸體積分?jǐn)?shù)為0.50%。

圖3 催化劑用量對DS的影響

2.1.4 酯化溫度

試驗(yàn)考察了酯化溫度(80～100℃)對DS的影響，由圖4可知，DS先顯著上升后(P＜0.05)再略微下降。DS隨著酯化溫度的增加逐漸上升，在酯化溫度為95℃時DS達(dá)到最大，DS為2.252。因?yàn)闇囟容^低時，酯化反應(yīng)不完全導(dǎo)致DS不高；當(dāng)溫度過高時，少量的纖維素在高溫酸環(huán)境中會發(fā)生脫水、氧化、縮水等副反應(yīng)，造成DS降低[26]。綜上，確定最佳酯化溫度為95℃。

圖4 反應(yīng)溫度對DS的影響

2.1.5 酯化時間

試驗(yàn)考察了酯化時間(1.5～3.5 h)對DS的影響，由圖5可知，DS先顯著上升后再顯著下降(P＜0.05)，當(dāng)酯化時間為2.5 h時DS達(dá)到最大，DS等于2.246。因?yàn)樵谒岬淖饔孟拢S著時間的延長，纖維素分子原有結(jié)構(gòu)受到破壞，羥基不斷暴露出來，DS增加；而作用時間過長導(dǎo)致纖維素在酸性環(huán)境中發(fā)生輕度降解導(dǎo)致DS略微減小。綜合考慮，確定反應(yīng)時間以2.5 h為宜。

2.1.6 單因素方差分析

各因素的方差分析見表2，由表可知，各因素對DS的影響顯著性程度依次是：酯化溫度、濃硫酸體積分?jǐn)?shù)、酯化時間、乙酸酐體積分?jǐn)?shù)、液料比。選取影響較顯著的3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化酯化工藝。

表2 各因素方差分析表

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及驗(yàn)證

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酯化溫度、濃硫酸體積分?jǐn)?shù)、酯化時間為考察因素，以DS為指標(biāo)，設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。利用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以得到DS的多項(xiàng)式回歸方程(自然變量)。方程為：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。F值可用于測試每個變量對響應(yīng)值的意義。F越大，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。當(dāng)顯著性檢驗(yàn)P＜0.05時，說明其具有統(tǒng)計學(xué)意義。從表4可以得出結(jié)論，模型P＜0.0001，該模型已達(dá)極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.5276＞0.05(不顯著)，決定系數(shù)R2=0.9883，說明具有較高的顯著性，而R2adj=0.9732，能夠解釋實(shí)驗(yàn) 97.32%的響應(yīng)值變化，且預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2Pred=0.9150，C.V.%=3.36，說明此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真實(shí)數(shù)據(jù)擬合程度良好，擬合度較高，可用于分析和預(yù)測蔗葉纖維素乙酸酯的制備效果?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析：A、B、C、A2、B2、C2對DS的影響達(dá)到極顯著水平，AC達(dá)顯著水平。A、B、C 3個因素對DS影響大小順序?yàn)椋篈＞C＞B，即反應(yīng)溫度＞催化劑用量＞反應(yīng)時間。

表4 方差分析結(jié)果

圖6是根據(jù)上述回歸方程繪出的各因素交互作用對DS影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。等高線越接近橢圓表明兩因素交互作用越強(qiáng)，且等高線越密集則影響效果越大；響應(yīng)曲面圖呈凸面，直觀地反映了這些因素對DS的影響。在所研究的區(qū)域內(nèi)均存在一個極值點(diǎn)，隨著各因素從小到大變化，DS呈現(xiàn)先增后減(或先增后緩)的趨勢，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。其中，結(jié)合表4可知，交互項(xiàng)AC的P值為0.0392，表明反應(yīng)溫度和催化劑用量之間的交互影響達(dá)到顯著水平。

圖6 各因素交互作用對DS影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.2.2 最佳條件的確定及驗(yàn)證

通過對試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與分析，得到最佳條件為：反應(yīng)溫度97℃、反應(yīng)時間2.4 h、催化劑用量0.57%，此時模型理論結(jié)果為DS=2.600。進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，DS分別為2.484、2.591、2.561、2.624、2.555，DS平均值2.563與模型預(yù)測結(jié)果接近。通過t檢驗(yàn)分析(α=0.05)，經(jīng)過雙尾檢驗(yàn)可知重復(fù)實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測值沒有顯著差異，再經(jīng)過單尾檢驗(yàn)可知重復(fù)實(shí)驗(yàn)的DS沒有顯著減小，表明所建回歸模型具有良好的預(yù)測效果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蔗葉纖維素為原料進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，制備蔗葉纖維素乙酸酯。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果可知，蔗葉纖維素乙酸酯最佳制備條件為液料比25 mL/g、乙酸酐體積分?jǐn)?shù)50%、反應(yīng)溫度97℃、反應(yīng)時間2.4 h、催化劑用量0.57%，此時蔗葉纖維素乙酸酯DS為2.600。建立的數(shù)學(xué)模型與真實(shí)數(shù)據(jù)擬合度較高，可用于分析和預(yù)測蔗葉纖維素乙酸酯的制備效果。研究成果為蔗葉纖維素乙酸酯的制備及應(yīng)用提供了參考依據(jù)。