淫羊藿苷通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄共激活因子預(yù)防大鼠激素性股骨頭壞死進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究

何嘉怡 遲瑞敏 賀毅 蔡卓 許濤 郭風(fēng)勁 葉亞平

糖皮質(zhì)激素相關(guān)性股骨頭壞死是大劑量或長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的嚴(yán)重副作用［1］。隨著骨壞死進(jìn)展，股骨頭塌陷并導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎和疼痛，其致殘率高并嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量［2］。晚期股骨頭壞死病人最有效的治療是全髖關(guān)節(jié)置換，但其費(fèi)用高昂且存在晚期假體松動(dòng)和磨損等并發(fā)癥。如何在股骨頭壞死早期有效預(yù)防骨壞死進(jìn)展，加速骨壞死的康復(fù)治療已成為臨床上亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題［3-4］。

近期一項(xiàng)多中心的隨機(jī)雙盲對(duì)照臨床試驗(yàn)表明，復(fù)方仙靈骨葆膠囊（淫羊藿含量占70%［5］）可有效降低接受糖皮質(zhì)激素治療病人的股骨頭壞死發(fā)生率，但其分子機(jī)制不清［6］。有研究［7］顯示，淫羊藿苷可通過(guò)抑制血管內(nèi)血栓形成及血管外脂質(zhì)沉積來(lái)降低股骨頭壞死的發(fā)生率。有學(xué)者將淫羊藿苷與聚乳酸羥基乙酸/磷酸三鈣納米纖維支架結(jié)合，促進(jìn)股骨頭壞死病人的骨缺損修復(fù)［8］。據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨分化，TAZ 能激活Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcriptional factor 2，Runx2）依賴的成骨分化基因表達(dá)并抑制抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）依賴的成脂分化基因表達(dá)，但是TAZ在淫羊藿苷調(diào)控激素性股骨頭壞死中的作用尚無(wú)研究報(bào)道［9］。本研究擬通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，從分子水平去研究淫羊藿苷對(duì)激素性股骨頭壞死的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制，為股骨頭壞死的治療提供新的作用靶點(diǎn)，為有效降低激素性股骨頭壞死的發(fā)生率并加速早期股骨頭壞死病人的康復(fù)提供有價(jià)值的參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

淫羊藿苷（Sigma，美國(guó)），地塞米松（碧云天生物，中國(guó)），甲強(qiáng)龍（輝瑞，美國(guó)），siRNA-TAZ 和空白siRNA（廣州瑞博生物科技有限公司，中國(guó)），引物合成（擎科生物，中國(guó)），PPARγ抗體（Abcam，美國(guó)），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）抗體（Abcam，美國(guó)），TAZ 抗體（CST，美國(guó)），Runx2 抗體（博士德，中國(guó)），GAPDH 抗體（博士德，中國(guó)），辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（博士德，中國(guó)），骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）抗體（博士德，中國(guó)），血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）抗體（Santa Cruz，美國(guó)），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（Santa Cruz，美國(guó)），生物素化羊抗兔/小鼠抗體（博士德，中國(guó)）。蛋白定量檢測(cè)試劑盒（博士德，中國(guó)），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo 公司，美國(guó)），Trizol 抽提液（Invitrogen，美國(guó)），總RNA 提取試劑盒（Toyobo，日本），cDNA 合成試劑盒（Toyobo，日本），SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒（Toyobo，日本），CCK-8 試劑盒（博士德，中國(guó)），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（碧云天生物，中國(guó)）。成年雄性SD 大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)與分組

所有動(dòng)物操作均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）取自3 月齡SD 大鼠的股骨。取出股骨沖出骨髓，貼壁培養(yǎng)得到rBMSCs。本實(shí)驗(yàn)使用第3代rBMSCs。

分組如下：①對(duì)照組；②地塞米松組（10-6mol/L）；③聯(lián)合干預(yù)組［地塞米松（10-6mol/L）+不同濃度淫羊藿苷（1×10-8mol/L，1×10-7mol/L，1×10-6mol/L，1×10-5mol/L）］。

（二）細(xì)胞增殖檢測(cè)

使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。將rBMSCs 接種到96 孔板中（5×103個(gè)/孔）。24 h 后根據(jù)上述分組給藥。培養(yǎng)72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃黑暗孵育1 h。最后，使用IMAX190 光度計(jì)讀取450 nm 處的吸光度。通過(guò)比較光密度值（OD）來(lái)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞增殖情況。

（三）細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。按上述分組給藥72 h后收集細(xì)胞。加入Annexin V-FITC/PI 染色，再使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+的細(xì)胞分別被認(rèn)為是早期和晚期的凋亡細(xì)胞。

（四）成骨和成脂分化試驗(yàn)

成骨培養(yǎng)基由DMEM/F12、10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸酯、10-8mol/L 地塞米松和50 μg/mL 抗壞血酸組成；成脂培養(yǎng)基由DMEM/F12、10%FBS、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤和10 mg/mL 胰島素組成。接種細(xì)胞后每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，21 d 后進(jìn)行茜素紅-S 染色（成骨分化）和油紅-O 染色（成脂分化）［10-11］。

（五）小干擾RNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

將第3 代rBMSCs 以5×104個(gè)/孔的密度種植在6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到50%時(shí)，經(jīng)脂質(zhì)體將siRNA 轉(zhuǎn)染到rBMSCs 中以沉默TAZ 表達(dá)［10］。48 h 后，采用地塞米松（1×10-6mol/L）+淫羊藿苷（1×10-7mol/L）處理上述細(xì)胞72 h，以了解rBMSCs在地塞米松和淫羊藿苷聯(lián)合作用下，TAZ 蛋白的表達(dá)是否可影響其下游靶基因（CTGF）表達(dá)及細(xì)胞成骨分化（Runx2）。

（六）蛋白免疫印跡

使用Western Blot 法進(jìn)行蛋白表達(dá)定量分析。提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗（PPARγ、TAZ、CTGF、Runx2、GAPDH），孵育二抗，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察蛋白條帶。

（七）實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行基因表達(dá)定量分析。Trizol提取總RNA，按cDNA合成試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后擴(kuò)增處理，循環(huán)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性5 s和60 ℃下退火30 s，共循環(huán)40 次。Runx2 引物序列：上游CTACTCTGCCGAGCTACGAAAT，下 游 TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC；ALP 引 物 序 列 ：上 游AGGGAAGGGTCAGTCAGGTT，下 游CCTGGACCTCATCA-GCATTT；OPN 引物序列：上游CAAGGACCAACTACAACCA，下 游 GGAG - ACAGGAGGCAAGG；GAPDH 引 物 序 列：上 游 AACGACCCCTTCATTGACC - TC，下 游CCTTGACTGTGCCGTTGAACT。

（八）動(dòng)物模型制備

選用12 周齡、體重250～300 g 的SD 大鼠52 只，隨機(jī)分為三組。對(duì)照組（12只）不進(jìn)行特殊處理；甲強(qiáng)龍組（20 只）腹腔注射脂多糖（LPS，0.2 mg·kg-1），然后肌肉注射甲強(qiáng)龍（MP，40 mg·kg-1·d-1）連續(xù)3 d；聯(lián)合干預(yù)組（20只）腹腔注射LPS并肌肉注射MP，在首次注射MP后連續(xù)灌胃淫羊藿苷（100 mg·kg-1·d-1），直至動(dòng)物被處死［12］。

（九）免疫組化染色

造模6 周后對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理并取出股骨，使用10%EDTA 溶液脫鈣3 周，包埋于石蠟中。將股骨頭沿冠狀面以5 μm 厚度切片。使用蘇木精和伊紅（HE）染色評(píng)估小梁結(jié)構(gòu)；應(yīng)用免疫組化學(xué)染色方法檢測(cè)股骨頭OCN、TAZ、CD31、VEGF 蛋白表達(dá)情況。使用Image-Pro Plus 軟件分析。在鏡下至少選擇5 個(gè)隨機(jī)區(qū)域，根據(jù)每張圖片的累積光密度值（IOD）定量陽(yáng)性染色，并測(cè)量相應(yīng)區(qū)域面積（area），平均光密度=IOD/area。

（十）TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)

使用TUNEL 試劑盒檢測(cè)骨細(xì)胞凋亡情況。以胞核為褐色或胞漿中有褐色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。使用Image-Pro Plus軟件分析得到平均光密度，用以衡量各組細(xì)胞凋亡率。

（十一）股骨頭Micro-CT檢查

造模6周后對(duì)大鼠進(jìn)行安樂(lè)死處理并收集其股骨頭，使用Micro-CT 掃描。采用直接三維測(cè)量方法計(jì)算骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積/組織體積（bone volume per tissue volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間距（trabecular separation，Tb.Sp）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

（十二）血管造影

造模6 周后麻醉大鼠，分離腹主動(dòng)脈和靜脈。心臟注射肝素化鹽水后，通過(guò)遠(yuǎn)端腹主動(dòng)脈注射Microfil 造影劑，直到觀察到其從腹腔靜脈持續(xù)流出。隨后，上述大鼠4 ℃保存過(guò)夜，取雙側(cè)股骨頭，4%多聚甲醛固定，10% EDTA 溶液脫鈣。最后，按照上述方法對(duì)樣本進(jìn)行Micro-CT 掃描，利用內(nèi)置軟件重建并計(jì)算股骨頭血管體積。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0（IBM 公司，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組差異用Student-t 檢驗(yàn)確定，多組間的差異使用單因素方差分析確定，然后使用Bonferroni檢驗(yàn)來(lái)具體比較兩組之間的差異。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、淫羊藿苷可有效削弱地塞米松對(duì)rBMSCs的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用

研究結(jié)果表明地塞米松抑制rBMSCs增殖，促進(jìn)rBMSCs凋亡（圖1 a～c）。而采用不同濃度淫羊藿苷處理后，地塞米松對(duì)rBMSCs的上述作用均得到不同程度的削弱，其中10-7mol/L濃度的淫羊藿苷在削弱地塞米松對(duì)rBMSCs 的增殖抑制和促進(jìn)凋亡方面具有最佳的效果（圖1 a～c）。

圖1 地塞米松和不同濃度淫羊藿苷對(duì)rBMSCs增殖和凋亡的影響 a：CCK-8法檢測(cè)rBMSCs增殖情況；b、c：Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rBMSCs 凋亡情況［Dex：地塞米松；ICA8：淫羊藿苷（1×10-8 mol/L）；ICA7：淫羊藿苷（1×10-7 mol/L）；ICA6：淫羊藿苷（1×10-6 mol/L）；ICA5：淫羊藿苷（1×10-5 mol/L）；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05］

二、淫羊藿苷可有效改善地塞米松對(duì)rBMSCs成骨分化的抑制作用和對(duì)其成脂分化的促進(jìn)作用

本研究顯示，與對(duì)照組比較，地塞米松組中rBMSCs 的成骨分化被明顯抑制，而聯(lián)合干預(yù)組中rBMSCs 成骨分化增強(qiáng)（圖2 a）；此外，與對(duì)照組比較，地塞米松組中成骨分化相關(guān)基因Runx2 和ALP表達(dá)水平明顯下降，OPN 表達(dá)水平無(wú)變化；而與地塞米松組比較，聯(lián)合干預(yù)組中Runx2、ALP和OPN表達(dá)水平明顯增加（圖2 b）。此外，地塞米松可顯著增強(qiáng)成脂分化關(guān)鍵蛋白PPAR-γ表達(dá)，而淫羊藿苷可下調(diào)該基因在蛋白水平的表達(dá)（圖2 c）。油紅O 染色顯示地塞米松可促進(jìn)rBMSCs成脂分化，而淫羊藿苷可削弱地塞米松對(duì)rBMSCs成脂分化的促進(jìn)作用（圖2 d）。

圖2 地塞米松和不同濃度淫羊藿苷對(duì)rBMSCs 分化的影響 a：茜素紅-S 染色檢測(cè)rBMSCs 成骨分化，比例尺=400 μm；b：實(shí)時(shí)檢測(cè)Runx2、ALP、OPN的mRNA表達(dá)；c：Western blot 檢測(cè)PPAR-γ蛋白表達(dá)；d：油紅-O染色檢測(cè)rBMSCs成脂分化，比例尺=400 μm［Dex：地塞米松；ICA8：淫羊藿苷（1×10-8 mol/L）；ICA7：淫羊藿苷（1×10-7 mol/L）；ICA6：淫羊藿苷（1×10-6 mol/L）；ICA5：淫羊藿苷（1×10-5 mol/L）；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05］

三、淫羊藿苷可能通過(guò)促進(jìn)TAZ 表達(dá)來(lái)削弱地塞米松對(duì)rBMSCs增殖和成骨分化的影響

本研究顯示地塞米松可抑制rBMSCs 中TAZ 蛋白表達(dá)，而淫羊藿苷可有效改善地塞米松對(duì)TAZ蛋白的表達(dá)抑制作用（圖3 a）。使用siRNA 沉默rBMSCs 中TAZ蛋白表達(dá)，24 h后siTAZ組中TAZ蛋白表達(dá)被明顯抑制（圖3 b）。再采用地塞米松+淫羊藿苷處理上述細(xì)胞3 d，結(jié)果顯示，地塞米松可顯著抑制CTGF 及Runx2 蛋白表達(dá)；而地塞米松+淫羊藿苷可顯著增加CTGF 及Runx2 蛋白表達(dá)。這提示淫羊藿苷可有效改善地塞米松對(duì)CTGF 及Runx2 蛋白的表達(dá)抑制作用。當(dāng)TAZ 表達(dá)被沉默后，其下游的CTGF 蛋白和成骨分化相關(guān)蛋白R(shí)unx2 表達(dá)均發(fā)生不同程度的下降（圖3 c）。本部分實(shí)驗(yàn)提示，地塞米松可能通過(guò)抑制TAZ 表達(dá)來(lái)抑制Runx2，而淫羊藿苷則可能通過(guò)促進(jìn)TAZ 表達(dá)來(lái)達(dá)到削弱地塞米松對(duì)rBMSCs增殖和成骨分化的調(diào)控作用。

圖3 Western blot 檢測(cè)地塞米松和不同濃度淫羊藿苷對(duì)rBMSCs 中TAZ、CTGF、Runx2 蛋白表達(dá)的影響 a：各組中TAZ 蛋白表達(dá)情況；b：siRNA 轉(zhuǎn)染rBMSCs 后TAZ 蛋白表達(dá)情況；c：siRNA 轉(zhuǎn)染rBMSCs 后，各組中TAZ、CTGF、Runx2 蛋白表達(dá)情況［Dex：地塞米松；ICA8：淫羊藿苷（1×10-8 mol/L）；ICA7：淫羊藿苷（1×10-7 mol/L）；ICA6：淫羊藿苷（1×10-6 mol/L）；ICA5：淫羊藿苷（1×10-5 mol/L）；scramble：無(wú)義對(duì)照；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05；與聯(lián)合干預(yù)組比較，&P＜0.05］

四、淫羊藿苷能顯著改善激素相關(guān)的股骨頭壞死發(fā)生

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組中大鼠骨壞死發(fā)生率為0，甲強(qiáng)龍組骨壞死發(fā)生率為90%（18/20），聯(lián)合干預(yù)組骨壞死發(fā)生率為35%（7/20）。甲強(qiáng)龍組中可見(jiàn)大量壞死組織及空骨陷窩，而聯(lián)合干預(yù)組則少見(jiàn)（圖4）。TUNEL 凋亡染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，甲強(qiáng)龍組大鼠股骨頭軟骨下骨小梁的骨細(xì)胞凋亡明顯增加（圖5 a），而聯(lián)合干預(yù)組大鼠骨細(xì)胞凋亡減少（圖5 a）。免疫組化結(jié)果也提示，甲強(qiáng)龍可明顯抑制OCN和TAZ蛋白表達(dá)，而聯(lián)合干預(yù)組中OCN和TAZ蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（圖5 b、c）。

圖5 大鼠股骨頭TUNEL染色及OCN蛋白、TAZ蛋白表達(dá)情況，比例尺=200 μm a：TUNEL染色檢測(cè)大鼠股骨頭軟骨下骨細(xì)胞凋亡情況；b、c：免疫組化染色示大鼠股骨頭軟骨下OCN和TAZ表達(dá)情況（MP：甲強(qiáng)龍；ICA：淫羊藿苷；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與甲強(qiáng)龍組比較，#P＜0.05）

Micro-CT 顯示甲強(qiáng)龍組BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 較對(duì)照組顯著降低，同時(shí)Tb.Sp 增加，提示激素可破壞大鼠股骨頭近端軟骨下骨小梁結(jié)構(gòu)（圖6）。與甲強(qiáng)龍組比較，聯(lián)合干預(yù)組大鼠的骨破壞顯著減輕，其BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 與甲強(qiáng)龍組比較顯著增加，而Tb.Sp減少（圖6）。

圖6 Micro-CT分析股骨頭微觀結(jié)構(gòu) a：股骨頭代表性Micro-CT圖像；b～f：軟骨下骨小梁微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)（MP：甲強(qiáng)龍；ICA：淫羊藿苷；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與甲強(qiáng)龍組比較，#P＜0.05）

五、淫羊藿苷可有效改善激素對(duì)股骨頭內(nèi)血液供應(yīng)的破壞作用

血管重建三維CT 顯示，與對(duì)照組比較，甲強(qiáng)龍干預(yù)可顯著降低大鼠股骨頭血管體積，而聯(lián)合干預(yù)組的股骨頭內(nèi)血管體積較甲強(qiáng)龍組明顯增加（圖7 a）。此外，通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)股骨頭血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VEGF的結(jié)果顯示，甲強(qiáng)龍組中CD31 和VEGF 表達(dá)明顯被抑制，而聯(lián)合干預(yù)組中CD31 和VEGF 蛋白表達(dá)水平較甲強(qiáng)龍組顯著增加（圖7 b、c）。上述結(jié)果提示甲強(qiáng)龍可抑制大鼠股骨頭內(nèi)的血供，而淫羊藿苷可顯著改善激素對(duì)大鼠股骨頭血流灌注的抑制效應(yīng)。

圖7 大鼠股骨頭血供和血管生成情況 a：大鼠股骨頭血供的三維圖像及血管體積與總體積的比率；b、c：免疫組化顯示大鼠股骨頭軟骨下CD31和VEGF表達(dá)情況，比例尺=200 μm（MP：甲強(qiáng)龍；ICA：淫羊藿苷；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與甲強(qiáng)龍組比較，#P＜0.05）

討 論

既往研究顯示長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致股骨頭壞死發(fā)生［13-15］。激素相關(guān)性股骨頭壞死病人的BMSCs 增殖和成骨分化能力均低于未使用激素對(duì)照組病人［16］。也有研究發(fā)現(xiàn)激素可通過(guò)降低骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 的表達(dá)來(lái)抑制BMSCs 的成骨分化［17］。此外，激素還能促使BMSCs由成骨分化轉(zhuǎn)向成脂分化［18］。在本研究中，我們亦發(fā)現(xiàn)地塞米松可促進(jìn)rBMSCs的凋亡和成脂分化，并抑制rBMSCs的增殖、成骨分化和鈣質(zhì)沉積。我們還發(fā)現(xiàn)了淫羊藿苷可顯著逆轉(zhuǎn)地塞米松的上述效應(yīng)，其最佳濃度為10-7mol/L。

既往研究提示不同濃度的地塞米松對(duì)BMSCs分化具有截然相反的效應(yīng)。低濃度地塞米松（10-8mol/L）能促進(jìn)TAZ 表達(dá)和BMSCs 成骨分化，該作用可被糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486 阻斷［19］。高濃度地塞米松（10-7mol/L）卻能抑制TAZ 表達(dá)和BMSCs 成骨分化［19］。本實(shí)驗(yàn)中，我們重點(diǎn)關(guān)注了高濃度地塞米松（10-6mol/L）和淫羊藿苷對(duì)rBMSCs 內(nèi)TAZ表達(dá)和細(xì)胞分化的調(diào)控作用。結(jié)果顯示地塞米松顯著抑制了rBMSCs 中TAZ 及其下游靶基因CTGF表達(dá)，也能抑制Runx2的表達(dá)。而淫羊藿苷能削弱地塞米松對(duì)rBMSCs的作用，部分上調(diào)TAZ、CTGF和Runx2 蛋白的表達(dá)。Runx2 已被證實(shí)是控制BMSCs成骨分化最重要的轉(zhuǎn)錄因子［20］。而TAZ可與位于Runx2 調(diào)控區(qū)域的序列基序Pro-Pro-X-Tyr 結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化過(guò)程的啟動(dòng)［21］。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用siRNA-TAZ 沉默TAZ 表達(dá)后，地塞米松和淫羊藿苷組Runx2 蛋白表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果均提示，TAZ 應(yīng)該是地塞米松和淫羊藿苷調(diào)控Runx2 表達(dá)和rBMSCs成骨分化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

HE染色是評(píng)價(jià)骨壞死的組織學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)［22］。HE染色結(jié)果顯示激素干預(yù)可顯著促進(jìn)大鼠股骨頭軟骨下骨小梁骨壞死病變進(jìn)展，大量空骨陷窩被壞死骨髓包圍，而淫羊藿苷能顯著緩解激素導(dǎo)致的股骨頭壞死。骨壞死的主要病理變化是骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡［23-25］。TUNEL 染色進(jìn)一步證實(shí)，激素能明顯增加骨細(xì)胞凋亡，而淫羊藿苷處理可明顯緩解激素誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡。此外，免疫組化證實(shí)激素能抑制TAZ蛋白表達(dá)，而淫羊藿苷能消除激素對(duì)TAZ表達(dá)的影響。這些都進(jìn)一步證明TAZ 在激素和淫羊藿苷調(diào)控大鼠股骨頭壞死中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Micro-CT結(jié)果也顯示，激素干預(yù)6周后，大鼠股骨頭軟骨下骨小梁出現(xiàn)了明顯骨丟失，其股骨頭軟骨下骨小梁的BMD、BV/TV、Tb.N 和Tb.Th 顯著降低，Tb.Sp增加。而淫羊藿苷治療可消除激素對(duì)大鼠股骨頭的不良影響，具體表現(xiàn)為BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th 增加，而Tb.Sp 降低。此外，我們還對(duì)大鼠股骨頭內(nèi)的血管分布進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示激素干預(yù)使大鼠股骨頭血管體積明顯減小，而淫羊藿苷可顯著增加大鼠股骨頭血供，這提示淫羊藿苷可能通過(guò)增加股骨頭血供來(lái)抑制骨壞死的進(jìn)展。免疫組化進(jìn)一步證實(shí)激素可抑制股骨頭CD31 和子VEGF 表達(dá)，而淫羊藿苷顯著消除了激素對(duì)CD31和VEGF蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，我們研究證實(shí)淫羊藿苷可以通過(guò)拮抗糖皮質(zhì)激素，來(lái)調(diào)控rBMSCs 的凋亡和分化，而TAZ則可以作為地塞米松和淫羊藿苷的共同作用靶點(diǎn)起到調(diào)控rBMSCs的作用。此外，我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)淫羊藿苷能顯著逆轉(zhuǎn)激素對(duì)大鼠股骨頭內(nèi)TAZ表達(dá)、骨和血管形成的抑制性作用，淫羊藿苷可能通過(guò)促進(jìn)TAZ 蛋白表達(dá)來(lái)預(yù)防股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展。在下一步的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中，我們擬進(jìn)一步構(gòu)建能夠緩釋淫羊藿苷的生物材料對(duì)股骨頭壞死病灶清除后的骨缺損部位進(jìn)行移植手術(shù)，以觀察其對(duì)骨壞死病灶的修復(fù)作用?？傮w而言，本實(shí)驗(yàn)對(duì)激素性股骨頭壞死的早期預(yù)防和治療意義重大，為激素性股骨頭壞死提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。