熒光免疫層析技術在毛發(fā)樣本嗎啡檢測中的應用

喻洪江，孔慶波*，方少華

(1.重慶警察學院，重慶 401331；2.浙江東方基因生物制品股份有限公司，浙江安吉 313300)

目前，研制一種靈敏度和準確性高、簡便快捷的毒品濫用檢測方法，一直是毒品濫用防控領域關注的重點問題之一。檢測濫用麻醉品主要有兩個目的，即甄別和確證，而不同的目的，往往選擇不同的檢測方法。甄別，也稱初步檢測，常被用于大批量分析多個樣品，主要是根據(jù)所選擇的某種麻醉品的臨界濃度，提供初步的定性分析結果，檢測結果預示了該種麻醉品的存在與否。這種檢測方法和器具一般要具備設計簡單、使用便捷、靈敏性高以及檢測場所條件要求不高等特點。確證，即準確證明某種麻醉品的存在，是對指定麻醉品更專門的分析。確證檢測方法的化學原理一般不同于甄別方法，可以選擇的方法有氣液層析法(GLC)、高效液相色譜法(HPLC)以及氣相色譜/質譜分析法(GC/MS)等[1]。但困擾毒品現(xiàn)場快速檢驗領域的國際性難題和關鍵技術是檢測時間窗口期偏短、檢測準確性不高、血液和尿液等檢材采集不夠便捷等問題。有鑒于此，依據(jù)對檢測準確性、時效性、便捷性和樣本儲存的需求，將熒光標記技術和傳統(tǒng)免疫層析技術相結合，建立一種采用毛發(fā)作為檢測嗎啡樣本的時間分辨熒光免疫層析技術，有望實現(xiàn)毒品分析的現(xiàn)場快速檢測方法。

1 嗎啡毛發(fā)熒光免疫檢測試劑盒

1.1 最低檢測濃度

由浙江東方基因生物制品股份有限公司研制的嗎啡毛發(fā)檢測試劑盒(熒光免疫層析法，生產(chǎn)許可證編號：浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20120108號)，采用高度特異性的抗體抗原反應及熒光免疫層析技術，通過抗體競爭結合毒品偶聯(lián)劑和毛發(fā)中可能含有的毒品的原理，結合配套儀器的使用可以定性和定量的檢測毛發(fā)樣本中是否含有嗎啡待測物，根據(jù)公安部2018年發(fā)布的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》規(guī)定的陽性檢測臨界濃度標準，毛發(fā)中嗎啡的最低檢測濃度定為0.2 ng/mg。

1.2 檢測原理

熒光免疫層析技術以固定有檢測線(包被抗原)和質控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，以測試液為流動相，熒光標記抗體固定于連接墊，通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。檢測時，毛發(fā)標本在毛細效應下向上層析會出現(xiàn)兩種顯示結果：如是陰性，毛發(fā)樣本與熒光抗體不結合，熒光抗體與特定毒品偶聯(lián)劑結合，配套儀器檢測結果為陰性；如是陽性，則毛發(fā)樣本的毒品與熒光抗體先發(fā)生反應，當毛發(fā)樣本中的毒品含量達到一定量時，熒光抗體就不再與測試區(qū)的特定毒品偶聯(lián)劑結合，配套儀器檢測結果為陽性。

1.3 定量檢測反應體系及試劑主要成分

1.3.1 定量檢測反應體系 反應體系如圖1所示。嗎啡毛發(fā)檢測試劑盒，采用高度特異性的抗體與毒品偶聯(lián)劑反應及免疫層析分析技術，試劑盒含有被事先固定于膜上測試區(qū)(T)的特定毒品偶聯(lián)劑和結合墊(聚酯膜)上的熒光標記抗體。當將樣品滴加在加樣區(qū)時，樣品中的待測物與結合墊中的熒光微球標記抗體結合并通過毛細作用向前層析，當達到檢測區(qū)后，剩余的熒光微球標記抗體與檢測線上的抗原結合。因此，檢測線(T線)上結合的熒光微球標記抗體與樣品中待測物的量成反比，質控線(C線)結合的熒光標記物與樣品中待測物的量無關，其他熒光標記物繼續(xù)層析達到吸收區(qū)。層析結束后，采用熒光讀數(shù)儀的讀取T線和C線的熒光強度并計算T/C值，通過ID卡(用于識別和存儲標準曲線)內置標準曲線即可計算出樣品中待測物的基本含量，再通過儀器內置的陰陽性判定標準來判斷待測樣品的陰陽性。

圖1 試劑盒反應體系示意圖

1.3.2 試劑主要成分 主要組成包括包被用嗎啡抗原、標記用嗎啡抗體、羊抗兔多克隆抗體、兔IgG、硝酸纖維素膜、聚酯纖維膜等。

2 配套的檢測儀器

2.1 毛發(fā)毒品痕量快速分析儀

根據(jù)時間分辨熒光免疫層析技術原理，如浙江東方基因生物制品股份有限公司與重慶警察學院聯(lián)合研制生產(chǎn)了配套儀器——毛發(fā)毒品痕量快速分析儀，型號規(guī)格為OG-G200。

2.2 配套檢測儀器工作原理

以熒光標記特異性抗體作為熒光指示劑的新型熒光免疫層析技術。分析儀內置激發(fā)波長為365 nm的LED光源，熒光微球受激發(fā)后發(fā)射610 nm的熒光，通過光電轉換器將檢測線和質控線上的熒光信號轉化為電信號，然后通過每批次ID卡上的標準曲線信息自動計算濃度，判斷陰、陽性，并呈現(xiàn)在儀器的顯示屏上。

3 毛發(fā)樣本的采集及檢測

依據(jù)公安部《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》提取毛發(fā)樣本時，工作人員應當佩戴一次性手套，使用醫(yī)用剪刀或者鋸齒剪刀緊貼被提取人員頭皮表面剪取頭頂后部(如頭頂后部無法提取到足夠頭發(fā)的，可選擇離該部位最近的頭部部位)長度為3 cm以內的頭發(fā)；長于3 cm的頭發(fā)，需從發(fā)根端截取3 cm，提取的毛發(fā)樣本應當分為A、B兩份，每份樣本重量不少于50 mg，用鋁箔紙包裹，分別裝入紙質信封后將信封封裝。

3.1 毛發(fā)樣本的處理

3.1.1 稱量 稱取10 mg樣本毛發(fā)(約3 cm的毛發(fā)20根)。

3.1.2 研磨 用鑷子將毛發(fā)放入研磨管中，使用專用研磨儀研磨2 min。

3.2 配套儀器檢測

3.2.1 準備 打開配套熒光免疫分析儀。

3.2.2 讀取ID卡 確認ID卡與試劑的批號是否匹配，無誤后插入ID卡，在進入測試界面點擊讀ID卡，讀取完成，即可檢測毛發(fā)樣本試劑。

3.2.3 選擇 在儀器界面上的樣本類型中選擇“毛發(fā)”。

3.2.4 裂解 將毛發(fā)裂解液加入已研磨好毛發(fā)的研磨管中，蓋緊瓶蓋，振蕩混勻裂解1 min。

3.2.5 加樣 用滴管吸取毛發(fā)裂解液的上清液，滴加3滴在試劑板的加樣孔中。

3.2.6 讀數(shù) 試劑卡(嗎啡毛發(fā)檢測試劑盒)加樣后機外反應3 min，反應結束后立即將試劑卡插入儀器中，點擊“測試”按鈕，系統(tǒng)將自動讀卡并給出測試結果，超過5 min后讀取的結果為無效。

3.3 檢測結果的解釋

3.3.1 陽性(+) 界面出現(xiàn)結果顯示為陽性，陽性結果表明毛發(fā)中藥物濃度在0.2 ng/mg以上。

3.3.2 陰性(-) 界面出現(xiàn)結果顯示為陰性，陰性結果表明毛發(fā)中藥物濃度在0.2 ng/mg以下。

3.3.3 無效 當檢測時出現(xiàn)“C線異?！?，表明不正確的操作過程、試劑已變質損壞或者線位不匹配。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并用新的試劑重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號產(chǎn)品，并與當?shù)毓搪?lián)系。

3.4 檢測注意事項

3.4.1 毛發(fā)樣品采集 貼緊頭皮剪取，將采集的頭發(fā)平放于清潔紙袋或自封袋中。

3.4.2 器械消毒 用鑷子夾取頭發(fā)前，需用酒精棉片擦拭干凈，避免交叉污染，影響實驗結果。

3.4.3 勿重復使用 本試劑盒(測試卡)為一次性使用體外診斷試劑，請勿重復使用。

3.4.4 注意自身防護 在收集、處置、儲存、混勻樣本和檢測過程中應采取適當?shù)谋Ｗo措施。

3.4.5 試劑盒要完整 試劑盒(測試卡)在使用前請不要開封，不要使用有明顯損壞的試劑盒、包裝有破損的測試卡。

3.4.6 試劑和ID卡使用要匹配 不同批號的試劑不能混用，ID卡與試劑盒(測試卡)不得混批號使用。

3.4.7 使用配套儀器 試劑盒(測試卡)及其組件僅適用于配套的毒品痕量快速分析儀。

3.4.8 注意損壞儀器或污染 切勿把表面被其他液體沾濕的試劑盒(測試卡)插入檢測儀，否則會污染或損壞儀器；用過的試劑盒(測試卡)請妥善處理，不要隨意丟棄。

3.4.9 溫度要求 應避免實驗環(huán)境溫度過高，低溫保存的試劑盒(測試卡)需要恢復至室溫后再打開，以免吸潮。

3.4.10 規(guī)范儀器操作 試劑盒(測試卡)和配套毒品痕量快速分析儀在使用時應避開顫動和電磁環(huán)境：在正常使用中儀器本身顫動屬正?，F(xiàn)象；檢測進行時請勿拔出ID卡。

3.4.11 檢測時間要求 為保證準確的檢測結果，試劑盒(測試卡)的機外反應時間應控制在3 min，超過5 min后讀取的結果無效。

3.5 樣本檢測

根據(jù)“國家安全防范報警系統(tǒng)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗中心(上海)”和“公安部安全防范報警系統(tǒng)產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗測試中心”共同認定并發(fā)布的檢驗檢測報告(報告編號：公滬檢202143306)：通過嗎啡檢測限實驗，嗎啡毛發(fā)檢測試劑盒(熒光免疫層析法，生產(chǎn)許可證編號：浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20120108號)配合專用的毛發(fā)毒品痕量快速分析儀(型號規(guī)格為OG-G200)，在檢出率不小于90%的前提下，在進樣量為80 μL時，對濃度為2 ng/mL(2 ng/mL相當于0.2 ng/mg)的嗎啡毛發(fā)樣品進行采樣分析，檢測限應≤0.16 ng/mg。

4 免疫熒光技術優(yōu)勢與局限性

4.1 目前常用嗎啡檢測技術

嗎啡(morphine)為阿片受體激動劑，分子式為C17H19NO3，分子質量為285.3 u，它具有強大的鎮(zhèn)痛作用，對一切疼痛均有效，同時具有較強的藥物成癮性，一般連續(xù)使用1至2周即可出現(xiàn)耐受性，濫用劑量是普通治療量的20至200倍[2]。其分子結構式見圖2所示。

圖2 嗎啡分子結構式示意圖

目前，檢測嗎啡的技術主要有：①實驗室理化檢測法，如化學反應、物理識別等。此類方法優(yōu)點是反應速度快；缺點是與免疫法比較靈敏度差、精確度差、步驟較復雜等②免疫法，如ELISA、膠體金、熒光、化學發(fā)光等。此類方法具有反應速度快、靈敏度高、成本低、方便攜帶等優(yōu)點，是目前國際通用的篩查方法。③色譜法，如氣相層析法、氣相色譜/質譜分析法(GC/MS)、液相色譜/質譜分析法(LC/MS)等。此類方法優(yōu)點是檢測靈敏度高；缺點是成本高、操作復雜、需要專門儀器等。④光譜法，如原子光譜、分子光譜(拉曼光譜)等。

4.2 熒光免疫技術的優(yōu)勢

免疫層析技術(immunochromatographic assay，ICA)是20世紀末發(fā)展起來的結合免疫技術和色譜層析技術的一種分析方法，該方法具有特異性強、操作簡單、檢測速度快等特點，廣泛應用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等重要領域[3]。這種傳統(tǒng)免疫層析技術是以膠體金為標記物，通過條帶顯色對目標物定性檢測或半定量分析，方法雖然簡單快速，但靈敏度較差，難以準確定量。而熒光免疫層析技術作為一種新型免疫檢測技術，既保留了傳統(tǒng)膠體金試紙條的現(xiàn)場快速檢測優(yōu)點，又加入了熒光檢測技術的高靈敏度特點，成為提高免疫層析方法檢測性能的主要途徑之一[4]。熒光免疫層析法的建立，是基于時間分辨熒光免疫層析技術，而時間分辨熒光免疫層析技術是基于熒光標記技術和免疫層析技術相結合發(fā)展創(chuàng)新的一種抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度[5]。其原理是：對于只具有單一抗原表位的待測小分子抗原(如違禁藥物、農(nóng)藥、獸藥等)與熒光標記抗體結合后，由于空間位阻作用難以再與檢測線上的包被抗原結合，是一種競爭抑制免疫層析法。此種方法大多用來檢測具有單一抗原表位的小分子待測物，見表1所示。

表1 主要查毒方法優(yōu)缺點比較

熒光與抗體標記技術的應用優(yōu)勢使用的標記方法是化學偶聯(lián)，即抗體上的氨基(-NH3)和熒光上的羧基(-COOH)脫水縮合[6]。這種標記方法具有以下優(yōu)點：①標記過程反應溫和，標記后的抗體高活性、高結合率；②無需復雜的設備進行純化；③重復性可控，批間差??；④標記后抗體穩(wěn)定，可大批量標記生產(chǎn)、保存。

4.3 熒光免疫技術的局限性

熒光與抗體標記技術只能用于初篩檢測，檢測結果目前不作為確認藥物濫用的依據(jù)，下一步將與氣相色譜-質譜法(GC-MS)、液相色譜-質譜法(LC-MS)等確證分析方法做對比研究試驗，以確認其使用靈敏度和特異性的水平。

另外，易造成假陰性或假陽性。造成假陰性結果的原因主要有：服用嗎啡藥物時間尚短，藥物還未代謝至毛發(fā)中，導致結果未檢出[7-8]；毛發(fā)研磨不充分或者反應時間過長或過短等操作不正確因素；運輸及儲存不當使試劑或裂解液失效等。造成假陽性結果的原因主要有：服用某些常用藥物或食用某些食物所致等(例如服用可待因類藥物時會導致嗎啡檢測假陽性結果)。另外，配套儀器參數(shù)的設置問題，也是影響試劑檢測結果的主要因素。

5 方法的創(chuàng)新及應用

5.1 時間分辨熒光標記技術

鑭系元素熒光標記技術時，當鑭系元素熒光被激發(fā)后，在固定時間段檢測特異性熒光，而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0。理論上1 ms為1個周期，1 s可重復測量1 000次，后取平均值，使值更準確。

5.2 高效毛發(fā)裂解液

使用獨創(chuàng)的裂解毛發(fā)生物品的復合配方試劑，將毛發(fā)剪成1 cm～2 mm小段(或者采用研磨形式)，直接加入裂解液，反應1 min，以提高毒品毛發(fā)樣本的裂解效率。

5.3 穩(wěn)定的緩沖體系

為了消除、降低個體樣本之間的基質、pH差異，需對緩沖液的pH、離子強度和功能性物質(表面活性劑、大分子物質、惰性蛋白和小分子保護物質)的添加進行系統(tǒng)研究，最終確定產(chǎn)品的緩沖體系。

嗎啡毛發(fā)檢測試劑盒(熒光免疫層析法)配合專用的檢測分析儀器用于阿片類藥物的初篩檢測，具有操作簡便快捷、檢測要求條件低、結果穩(wěn)定準確、樣本不易摻假以及便于保存等優(yōu)點，可有效解決毒品查緝、毒駕管控、社區(qū)戒毒人員管控、交管系統(tǒng)各類駕駛員吸毒篩查、專業(yè)機構吸毒篩查，以及征兵、特種行業(yè)招工吸毒篩查等過程中遇到的關鍵性技術難題，具有廣泛的應用場景。