奶山羊乳房炎二聯(lián)滅活疫苗的制備及其免疫效果評估

劉程媛，賈延德，張富強，紀甜甜，王天星，姜悅才，趙慧英*，陳德坤*，馬文濤*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.西寧市湟中區(qū)畜牧獸醫(yī)站，青海西寧 810099；3.陜西千陽莎能奶山羊發(fā)展有限公司，陜西千陽 721100)

乳房炎(Mastitis)是由病原微生物感染乳腺組織引起的炎癥性疾病，常發(fā)生于泌乳動物。通常根據(jù)乳汁及乳房有無可見異常，將乳房炎分為臨床乳房炎和隱性乳房炎[1]。臨床乳房炎發(fā)病迅速，在2 d～3 d內(nèi)產(chǎn)生嚴重的炎癥反應，導致奶山羊乳房壞死甚至死亡，但其發(fā)病率較低，約為2%[2]。隱性乳房炎由于無肉眼可見的癥狀常被飼養(yǎng)者忽視，但會導致乳汁中體細胞數(shù)量升高、乳汁品質(zhì)降低和患畜產(chǎn)奶量降低[3-5]。在不同奶山羊養(yǎng)殖企業(yè)中，由于養(yǎng)殖規(guī)模、管理水平、所處地區(qū)的流行情況等不同，導致隱性乳房炎的發(fā)病率差異較大，一般在30%～80%[6-7]。調(diào)查顯示，陜西省奶山羊隱性乳房炎的發(fā)病率約為45.5%[8]。陜西是我國奶山羊的主要養(yǎng)殖省份之一，奶山羊產(chǎn)業(yè)是陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟的重要支柱。乳房炎不僅對奶山羊養(yǎng)殖企業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，乳房炎羊乳中的病原微生物及其治療產(chǎn)生的抗菌藥物殘留也對人類健康和食品安全構(gòu)成了一定的威脅。然而，目前尚無商品化的有效的奶山羊乳房炎疫苗[9-10]。因此，奶山羊乳房炎的預防和治療是亟待解決的一個棘手問題，對于陜西省打造“千億羊乳”工程具有重要意義。我們從陜西省武功縣某奶山羊養(yǎng)殖場乳房炎乳汁中分離出2種主要病原菌，制備了二聯(lián)滅活疫苗并評估了免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 陜西省武功縣某奶山羊養(yǎng)殖場的成年泌乳期關(guān)中奶山羊32只。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；可溶性單組分TMB底物溶液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GelRed核酸染料，蘭杰柯科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMaster Mix，西安擎科澤西生物科技有限責任公司產(chǎn)品；隱性乳房炎診斷液、轉(zhuǎn)移因子，西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)免疫學實驗室提供；辣根過氧化物酶標二抗(兔抗羊IgG-HRP)，Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀(T100)，上海伯樂生命醫(yī)學有限公司產(chǎn)品；高速離心機(Avanti JXN-30)，德國Eppendorf生命科技公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)，美國Thermo公司產(chǎn)品；恒溫空氣浴搖床(HNY-2102C)，天津歐諾儀器股份有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)，蘇州蘇凈集團有限公司產(chǎn)品；超聲破碎儀(IMS-30)，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；多功能酶標儀(Spark)，帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；凝膠成像系統(tǒng)(K8420)，南京世研儀器設備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集及乳房炎檢測 采集乳樣時先將奶山羊乳房擦洗干凈，對乳頭和采樣者雙手進行充分消毒后，棄去前2把～3把乳并采集約7 mL乳汁于離心管中，標記樣品編號。診斷隱性乳房炎時，將診斷液和乳樣各5 mL加于乳房炎診斷盤中，然后作水平同心圓狀搖動約5 s，使診斷液和乳樣混合均勻，觀察并記錄診斷結(jié)果。診斷后的乳樣，置于冰盒中運送至實驗室進行病原菌分離鑒定和抗體效價檢測。

1.2.2 病原菌分離純化 參照常規(guī)的細菌分離方法進行[11]。主要操作程序是用接種環(huán)取乳房炎乳汁接種于山羊血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h～36 h后，觀察并記錄菌落特征。挑取典型菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃空氣浴搖床過夜振蕩培養(yǎng)。再用接種環(huán)取菌液劃線接種于山羊血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并進行純化鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 細菌形態(tài)學觀察 純化的細菌擴大培養(yǎng)后，分別接種于普通瓊脂培養(yǎng)基、山羊血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h。觀察并記錄細菌的生長情況、菌落的大小、形態(tài)、溶血性等特征。取菌液涂片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察并記錄細菌的形態(tài)、大小、染色情況等。

1.2.3.2 分離菌16S rDNA片段擴增與序列比對 挑取單克隆菌落于50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR中充分混勻，80 ℃水浴15 min，低速離心，上清液即為細菌的基因組DNA，將其作為模板用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4℃結(jié)束反應。將電泳鑒定結(jié)果與預期相符的PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限責任公司測序。將測得的序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序與收錄的序列進行比對。

1.2.3.3 分離菌基因組特異性序列的PCR擴增 根據(jù)本實驗室設計的金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的特異性引物序列合成上、下游引物[12]。進行基因組特異性序列的PCR擴增并將PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，特異性PCR反應體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板 2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃結(jié)束反應。

1.2.4 細菌擴大培養(yǎng) 將菌株分別接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃空氣浴搖床過夜振蕩培養(yǎng)。再將擴菌后的菌液接入裝有500 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃空氣浴搖床振蕩培養(yǎng)12 h～18 h至菌液密度為1×109CFU/mL，離心，收集菌體沉淀。

1.2.5 細菌的滅活及滅活效果檢測 用適量的無菌生理鹽水以8 000 r/min室溫離心10 min后棄去上清的方法，將1.2.4中獲得的菌體沉淀洗滌3次，再用500 mL含50 mg/mL甲醛的生理鹽水將菌體沉淀重懸，置于37 ℃空氣浴搖床中振蕩滅菌處理，大腸埃希氏菌處理72 h，金黃色葡萄球菌處理96 h。

取100 μL滅活后的菌液涂布普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h。若平板上無菌落形成，證明滅活成功；否則繼續(xù)振蕩滅菌。

1.2.6 鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑的制備 先配制50 mg/mL的硫酸鋁溶液：稱取25 g硫酸鋁粉加入250 mL蒸餾水中充分混勻；再配制50 mg/mL的氫氧化鈉溶液：稱取5 g氫氧化鈉粉末加入100 mL蒸餾水中充分混勻。然后將這兩種溶液充分混勻后在室溫下靜置，待其自然沉降分層后，用生理鹽水洗滌2次。最后，用本實驗室制備的轉(zhuǎn)移因子將其定容到500 mL，即為鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑。

1.2.7 二聯(lián)滅活疫苗的制備 將500 mL滅活好的菌液用適量的無菌生理鹽水洗滌3次以除去甲醛，再用500 mL無菌生理鹽水重懸起來。將兩種菌液按照1∶1的比例混合，再將混合菌液與鋁膠鹽-轉(zhuǎn)移因子佐劑等體積充分混勻，即得奶山羊乳房炎二聯(lián)滅活疫苗，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 奶山羊免疫試驗 對養(yǎng)殖場的全部泌乳期奶山羊進行隱性乳房炎檢測，隨機選取其中的32只進行乳房炎滅活疫苗的免疫試驗。將其分為疫苗免疫組和對照組，每組16只(其中乳房炎陽性和陰性的奶山羊各8只)。對照組不做任何處理，免疫組動物頸部皮下注射疫苗2 mL/只，并在首免后第15天以相同的方式和劑量進行第2次免疫。

在免疫前、二免后第0、15、35、60天采集所有奶山羊的血液和乳汁樣本，分離血清和乳清保存于-20 ℃，用于抗體效價的測定。

1.2.9 試驗羊的抗體測定和體細胞檢測 參照本實驗室建立的方法[13]進行。測定結(jié)果用GraphPad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的形態(tài)學觀察結(jié)果

從奶山羊乳房炎乳汁中分離純化出的病原菌，按照其菌落形態(tài)特征(圖1)和革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(圖2)，可以分為2類：

A.A類細菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.B類細菌在金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

A.A類細菌；B.B類細菌

A類菌落：在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤、灰白色的圓形菌落；在山羊血瓊脂平板上部分菌株有溶血現(xiàn)象；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色的菌落。革蘭氏染色呈陰性，無莢膜、無芽孢，短小桿狀、兩端鈍圓，單個或成對排列。

B類菌落：在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤、黃色的圓形菌落；在金黃色葡萄球菌快速鑒定培養(yǎng)基上形成黑色、有光澤的圓形菌落，其周圍有不透明圈，最外有清晰帶。革蘭氏染色呈陽性，無莢膜、無芽孢，圓形，呈葡萄串狀排列。

2.2 分離菌16S rDNA的序列比對

測得分離菌16S rDNA序列的相似性比對結(jié)果見表1。比對結(jié)果顯示A類細菌為大腸埃希氏菌，B類細菌為金黃色葡萄球菌。兩者與對應的收錄序列的相似性均超過99.9%。

表1 分離菌16S rDNA的序列比對結(jié)果

2.3 分離菌基因組特異性序列的PCR擴增

以分離菌基因組DNA為模板，用對應的細菌特異性引物分別進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳的檢測結(jié)果見圖3。該結(jié)果表明，A類細菌為大腸埃希氏菌，B類細菌為金黃色葡萄球菌。

M.DNA 標準DL 2 000;1.A類細菌；2.陰性對照;3.B類細菌

2.4 乳房炎二聯(lián)滅活疫苗免疫效果的評估

在二免后的60 d內(nèi)，免疫組奶山羊血清中針對兩種病原菌的抗體水平均顯著升高(P<0.05)，而對照組變化不顯著，結(jié)果見圖4～圖7。二免后第15天，免疫組血清中的抗體效價達到峰值，約為210，為對照組的32倍。之后血清中的抗體效價略有下降，但仍顯著高于對照組。乳清中的抗體效價與血清類似，在二免后60 d內(nèi)顯著升高，在二免后第15天達到峰值，且乳清中的抗體效價總是略高于血清中的抗體效價。

圖4 血清中大腸埃希氏菌的抗體效價

圖5 血清中金黃色葡萄球菌的抗體效價

圖6 乳清中大腸埃希氏菌的抗體效價

圖7 乳清中金黃色葡萄球菌的抗體效價

在二免后60 d內(nèi)，用CMT診斷液對對照組和免疫組的奶山羊進行隱性乳房炎的檢測。結(jié)果顯示，對照組奶山羊隱性乳房炎的檢出率始終維持在40%以上；相比而言，免疫組的隱性乳房炎檢出率顯著下降：免疫前的檢出率為50%，在二免時下降到了18.75%，在二免后第35天下降到6.25%(圖8)。以上結(jié)果表明，本研究制備的乳房炎滅活二聯(lián)疫苗對奶山羊隱性乳房炎的治療效果顯著。

圖8 隱性乳房炎檢出率

3 討論

本實驗室對陜西、山東、云南省3個主要奶山羊養(yǎng)殖地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌分別占我國奶山羊乳房炎病原菌的17%和16%。這與國際上的病原學統(tǒng)計結(jié)果高度一致，即大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌是奶山羊乳房炎最主要的病原菌[7,14]。因此，本研究以武功奶山羊養(yǎng)殖場乳房炎乳中分離出的這2種病原菌為材料，制備乳房炎二聯(lián)滅活疫苗并評估其免疫效果，以期為奶山羊乳房炎的防治提供參考。

乳房炎的主要病原菌都屬于胞外寄生菌，因此體液免疫對于病原菌的清除具有重要意義。乳腺組織體液免疫產(chǎn)生的抗體不僅能通過凝集作用抑制細菌的生長及其對乳腺上皮細胞的吸附，也可以通過與補體結(jié)合發(fā)揮溶菌和調(diào)理作用[15-16]。因此，測定免疫后特異性抗體的效價是評估疫苗免疫效果的關(guān)鍵指標之一。本研究中，二免后60 d內(nèi)免疫組血清和乳清中針對2種分離菌的抗體效價均顯著高于對照組，效價最高時約為對照組的32倍，表明該疫苗能有效刺激動物機體產(chǎn)生較強的體液免疫。免疫前隱性乳房炎檢出率為50%，在二免后第35天下降到6.25%。本實驗室同時用上述的免疫方法對其他羊群免疫后發(fā)現(xiàn)，1只患有臨床乳房炎的奶山羊，其乳汁由免疫前的紫黑色在二免后第35天轉(zhuǎn)為了乳白色。隱性乳房炎檢出率的顯著降低和臨床乳房炎病情的改善，表明該疫苗對乳房炎還具有一定的治療作用，但其作用機理還有待進一步的研究闡明。