豬鏈球菌血清9型菌株分離鑒定及強毒株篩選

李倩倩，梁 鞏，劉錦錦，金 清，龍云志，楊 柳，黃 英，余道兵，宋文博，黃 超，湯細彪

(武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430000)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是一種人獸共患病原體，在臨床上，可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥或急性死亡等，而且易與其他細菌和病毒性病原混合感染，造成養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失[1]。該菌也可感染人，引起腦膜炎、感染性休克和死亡等，威脅著人類生命安全[2]。自20世紀50年代初，荷蘭、英國、美國、加拿大、巴西、丹麥、日本、中國等國家先后報道了豬鏈球菌病[3-4]。2003年-2013年間，34個國家或地區(qū)報告了1 500多例人類感染病例[1]。2005年7月，中國四川資陽暴發(fā)了最大規(guī)模的豬鏈球菌感染人事件，造成204人感染，38人死亡[5-6]中國已有13個省市報道了豬鏈球菌病，并在華南、西南和華東地區(qū)出現(xiàn)大流行，嚴重威脅著我國的養(yǎng)豬業(yè)[7]。總之，豬鏈球菌給公共衛(wèi)生帶來威脅，需要相關(guān)科研人員的關(guān)注。

根據(jù)豬鏈球菌菌體莢膜多糖抗原性的區(qū)別，豬鏈球菌可分為33種血清型，分別為1型～31型、32型和1/2型，而血清33型和34型歸類于Streptococcusorisratti，不屬于豬鏈球菌[8]。本研究中主要采用Liu Z等[9]開發(fā)的4種多重PCR檢測分型方法，是根據(jù)豬鏈球菌的不同血清型參考菌株CPS基因差異區(qū)域，設(shè)計特異性引物進行分型。該方法快速且具有成本低的優(yōu)點，可用于分離株的分型。

近年來，隨著集約化和規(guī)模化養(yǎng)豬的不斷發(fā)展，給豬鏈球菌的發(fā)生和傳播提供了良好的條件，促進了疾病的發(fā)生和流行。豬鏈球菌的防控原則主要是以預防為主，不僅要加強消毒、減少應(yīng)激、加強飼養(yǎng)管理，而且要制定合理的免疫程序[10]。對于細菌引起的疾病通常采取抗菌藥物治療，但是抗菌藥物的使用效果不佳，容易產(chǎn)生耐藥性從而影響后續(xù)的治療。因此，對于該病的防控最有利的措施就是疫苗[11]。迄今為止，人們對于豬鏈球菌2型的研究從未停止。雖然2型在豬鏈球菌所有血清型中分布最廣，毒力最強，但是近年來調(diào)查研究顯示豬鏈球菌9型的致病率和分離率有明顯上升的趨勢[12]。Zhang B等[13]對2013年-2017年我國豬場豬鏈球菌流行率的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，我國豬鏈球菌主要為血清2型、9型、7型、3型、1型、5型，2型的分離率依然是最高。但值得關(guān)注的是，2型流行率從2013年的52.4%下降至2017年的33.6%。然而，隨著時間推移，豬鏈球菌9型逐年持續(xù)增高，從12.1%升高至25.8%。然而市場上沒有針對豬鏈球菌9型的商品化疫苗，所以本研究對分離鑒定的豬鏈球菌9型進行強毒株篩選及相關(guān)生物學特性研究，為后續(xù)疫苗的開發(fā)及疫病防控策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 玉米大蠟螟幼蟲1 650只，體重0.2 g～0.3 g，購自武漢維物起源生物科技有限公司；SPF級4周齡、雌性Balb/c小鼠326只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 菌株及臨床病料 試驗用菌種SS2 ZYS為2005年四川資陽分離的豬鏈球菌血清2型菌株；SS7 YZ為2005年8月從湖南永州某豬場送檢的病料中分離的豬鏈球菌血清7型；該2株菌種均由武漢科前生物股份有限公司保存。試驗用臨床分離株由武漢科前生物股份有限公司診斷中心從送檢的病料中分離、鑒定、保存。

1.1.3 主要試劑 Tryptic Soy Agar(TSA,CNL17-B0033)、Tryptic Soy Broth(TSB,CNL17-B0022)培養(yǎng)基，美國BD公司產(chǎn)品；Gibco新生胎牛血清(1999577)，武漢維物起源生物科技有限公司產(chǎn)品；革蘭氏染液(20180314)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×M5 HiPer pulsTaqHiFi PCR mix(MF002-puls-10)、M5 HiPure Next Ⅲ Gelred 第三代膠紅核酸染料(MF380-01)，北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品；引物，武漢擎科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 東勝龍PCR儀(ETC811)，蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-8C型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；高速臺式離心機(H1850)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DL-CJ-2ND Ⅰ潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器(SHZ-8-2)，國華(常州)儀器制造有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(BG-GDSAUT0520)，北京杰瑞恒達科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 SS2 ZYS和SS7 YZ復蘇 將凍干保存的菌種取少量固體小塊置于TSA平板(含100 mL/L新生牛血清)上，待其溶解后，用經(jīng)酒精燈火焰灼燒后冷卻的接種環(huán)蘸取菌液進行劃線，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h～24 h。挑取單菌落進行劃線、傳代、純化。純化后的單菌落進行PCR鑒定。

1.2.2 豬鏈球菌分離 在超凈工作臺中無菌采集病料(心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液等)接種于TSA平板(含100 mL/L新生牛血清)上，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h～24 h。選取疑似鏈球菌形態(tài)的單菌落進行PCR鑒定、革蘭氏染色、鏡檢，選取革蘭氏染色陽性的、鏈狀的單菌落繼續(xù)在TSA平板上劃線、傳代。純化2代～3代后菌株，用500 mL/L甘油保存菌液，置于-20℃保存，備用。

1.2.3 菌體PCR鑒定 按照參考文獻[9]，根據(jù)莢膜多糖合成基因設(shè)計豬鏈球菌血清型9分型引物(表1)。以豬鏈球菌DNA為模板進PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃10 min；16 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳120 V電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無條帶及條帶大小。

表1 豬鏈球菌鑒定及血清型9型PCR引物序列

1.2.4 玉米大蠟螟模型篩選 選取825只體重0.2 g～0.3 g的玉米大蠟螟幼蟲隨機分為33組，29組分別注射豬鏈球菌血清9型臨床分離株，2組分別攻SS2 ZYS和SS7 YZ，設(shè)置PBS和空白對照組，每組各25只；采用玉米大蠟螟最后尾足腹腔注射，注射劑量為25 μL，攻菌劑量為5.0×107CFU/mL。攻菌后置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，持續(xù)觀察5 d，每24 h記錄玉米大蠟螟的死亡情況，玉米大蠟螟通體變黑，晃動平皿大蠟螟不動即認為其死亡。該篩選試驗重復2次，選取死亡率較高的菌株進行Balb/c小鼠的篩選。

1.2.5 Balb/c小鼠篩選 選取286只4周齡、雌性Balb/c小鼠進行3輪豬鏈球菌血清型9型強毒株篩選，隨機分為3組，分別豬鏈球菌血清9型臨床分離株組、SS2 ZYS和SS7 YZ對照組、PBS對照組，每組10只～11只小鼠；第1、2輪篩選，采用腹腔注射，各菌株的攻菌量為5.0×109CFU/mL，注射劑量為200 μL。第3輪篩選，降低菌量，采用腹腔注射，各菌株的攻菌量為1.0×109CFU/mL左右，注射劑量為200 μL。攻菌后連續(xù)[14]觀察5 d，記錄小鼠的死亡情況。

1.2.6 毒力基因檢測 根據(jù)參考文獻[15]，選擇豬鏈球菌的主要毒力因子胞外蛋白因子(epf)、溶血素(sly)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、纖連蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)、毒力相關(guān)因子(orf2)、89k毒力島、谷氨酸脫氫酶(gdh)作為鑒定基因，合成8對引物(表2)。以篩選后得到的1株強毒株的DNA作為模板進行PCR擴增，從而確定SS9-22的基因型。

表2 豬鏈球菌主要毒力基因PCR擴增引物

1.2.7 生長曲線測定 在無菌操作臺中挑取TSA平板(含100 mL/L新生牛血清)上經(jīng)過傳代、純化的單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)基(含 100 mL/L新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h～8 h，作為種子液。將種子液按10 mL/L的比例接入30 mL TSB培養(yǎng)基(含100 mL/L新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取出200 μL菌液于96孔板中，測量OD600 nm值，每管重復3個孔，取平均值，繪制生長曲線。

1.2.8 Balb/c小鼠致病性試驗 將SS9-22菌株種子菌液按10 mL/L的比例轉(zhuǎn)接于60 mL TSB培養(yǎng)基(含100 mL/L新生牛血清)中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，吸取100 μL菌液進行10倍倍比稀釋，涂平板，從而計算細菌濃度。收集菌液，5 000 r/min離心10 min，棄上清，用原培養(yǎng)基的1/10倍體積的PBS重懸菌體。將40只Balb/c小鼠分為5組，每組8只SS9-22菌株設(shè)置4個濃度梯度，分別為1.8×109、1.8×108、1.8×107、1.8×106CFU/只進行腹腔注射攻毒，每只小鼠注射劑量為200 μL，同時設(shè)置PBS對照組。連續(xù)觀察7 d，記錄每組小鼠的死亡況。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

從發(fā)病豬的病料中分離出的豬鏈球菌在TSA平板(含100 mL/L新生牛血清)上生長良好，菌落呈現(xiàn)灰白半透明，針尖大小，光滑整齊，在強光下觀察可見淺藍色熒光。通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，菌體在顯微鏡下呈現(xiàn)短桿狀或短棒狀，且多數(shù)由3個以上的菌體形成鏈狀(圖1)，表明分離出的細菌為豬鏈球菌。

圖1 部分臨床分離菌株革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)

2.2 PCR鑒定

將SS9型特異性引物擴增出的目的條帶的菌株進行保存，用于后續(xù)試驗。經(jīng)PCR鑒定后獲得了29株豬鏈球菌血清型9型菌株，分別命名為SS9-1～SS9-29(圖2)。

A.cps9J;B.thrA;M1.DNA 標準DL 1 000；1～12.臨床分離菌株;13.ddH2O對照;M2.DNA 標準DL 2 000

2.3 玉米大蠟螟篩選

玉米大蠟螟的兩次試驗結(jié)果見表3。豬鏈球菌SS2 ZYS和SS7 YZ對照組的死亡率高達85%以上，PBS對照組死亡率在4%～10%左右，空白對照組死亡率為0，表明該玉米大蠟螟篩選具有一定的參考意義。通過分析2次篩選的死亡率，選取2次結(jié)果死亡率較高的13株進行后續(xù)Balb/c小鼠篩選，編號分別為SS9-1、SS9-4、SS9-6、SS9-7、SS9-9、SS9-15、SS9-18、SS9-20、SS9-22、SS9-23、SS9-24、SS9-26、SS9-27。

表3 豬鏈球菌血清型9型29株菌株在玉米大蠟螟上的2輪篩選結(jié)果

2.4 Balb/c小鼠篩選

小鼠攻毒篩選試驗結(jié)果見表4，根據(jù)第1次篩選死亡時間及死亡率，發(fā)現(xiàn)13株中有8株的死亡率均為100%，5株的死亡率在63%～91%之間。而死亡率100%的8株中，6株在第1天小鼠全部死亡，其他2株在2 d后全部死亡。隨即對這6株菌株進行第2輪篩選，根據(jù)攻菌量、死亡時間及死亡率發(fā)現(xiàn)，SS9-20、SS9-22、SS9-26的致病性較強。隨后，進一步降低攻菌量，發(fā)現(xiàn)SS9-20、SS9-22相對強于SS9-26，死亡率為100%。

表4 豬鏈球菌血清型9型菌株在Balb/c小鼠的3輪篩選結(jié)果

2.5 毒力基因鑒定

對菌株SS9-22進行毒力基因擴增，結(jié)果表明該菌株的基因型為gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp﹣/89K﹣/gdh+/epf+(圖3)。

M.DNA 標準DL 1 000;1.gapdh；2.sly；3.fbps；4.orf2；5.mrp；

2.6 生長曲線測定

根據(jù)不同時間液體培養(yǎng)物中豬鏈球菌的密度變化繪制生長曲線，1 h～4 h為遲緩期，4 h～6 h為對數(shù)生長期；6 h～14 h為穩(wěn)定期(圖4)。表明菌株SS9-22培養(yǎng)6 h～8 h液體培養(yǎng)基中細菌的濃度最大，可獲得大量的細菌抗原。

圖4 SS9-22 菌株的生長曲線

2.7 Balb/c小鼠致病性試驗

SS9-22菌株分別以1.8×109、1.8×108、1.8×107、1.8×106CFU/只的菌量對Balb/c小鼠進行攻毒試驗。攻毒5 d后，每組小鼠的死亡情況見表5。根據(jù)改良寇氏法計算，SS9-22菌株對Balb/c小鼠的LD50為3.2×107CFU。

表5 豬鏈球菌SS9-22菌株的攻毒劑量及存活情況

3 討論

本研究主要基于武漢科前生物股份有限公司的診斷中心平臺，獲得全國各地的發(fā)病豬的病料，對這些病料進行細菌分菌，分離了大量的豬鏈球菌。通過形態(tài)學觀察、革蘭氏染色、PCR鑒定的方式確定了29株豬鏈球菌血清9型，分別命名為SS9-1～SS9-29。

豬鏈球菌是一種常見病原菌，在環(huán)境中，豬鏈球菌無毒和強毒株均可豬群中分離，因此需要一種方便、可靠及標準化的動物模型來快速評估其毒力。眾所周知，豬和小鼠已成功用于豬鏈球菌毒力的研究[16-17]。然而，與非哺乳動物感染模型相比，豬和小鼠在經(jīng)濟、物流和倫理方面存在劣勢。玉米大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲已成功用于人類和動物傳染病的研究，Velikova N等[18]開發(fā)了該動物模型用于豬鏈球菌毒力的評估。該模型不受倫理立法的約束，且購買便宜、方便，在 37 ℃(自然宿主的體溫)下可用大量樣品進行試驗。因此，為了從多株血清9型中篩選出強毒株，采用了玉米大蠟螟模型對29株豬鏈球菌血清9型菌株進行2輪初步篩選，確定了13株毒力較強的菌株。隨后通過Balb/c小鼠模型進行了3次復篩，確定了2株毒力血清9型強菌株SS9-20、SS9-22。

目前，人們對豬鏈球菌的毒力基因的致病機制尚不清晰，但普遍認為其致病性強弱大多數(shù)與該菌株的毒力基因分布存在相關(guān)性[19]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國分離的豬鏈球菌血清2型菌株中大多數(shù)菌株的主要毒力基因表型為mrp+/epf+/sly+/fbps+，而9型豬鏈球菌的毒力基因分布尚不清楚[20]。本試驗通過PCR的方法對SS9-22菌株進行了毒力基因的檢測，發(fā)現(xiàn)該菌株的基因型為gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp﹣/89K﹣/gdh+/epf+，檢測到了豬鏈球菌2型的epf致病性特征毒力基因。通過致病性試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株的LD50為3.2×107CFU，對小鼠具有很強的致病性。

為了進一步探究強毒株SS9-22的生長趨勢，發(fā)現(xiàn)SS9-22在TSB(含100 mL/L新生牛血清)中培養(yǎng)時，2 h即可進入對數(shù)期，5 h～6 h到達平臺期，與文獻中SS2生長曲線相比，SS9進入對數(shù)生長期的時間比SS2要快。滅活疫苗制備需要獲得大量的活菌，而該菌株的生長特性不僅提高了工作效率而且降低生產(chǎn)成本，可選用6 h菌液來進行生產(chǎn)，獲得大量的抗原。

目前，已經(jīng)商品化的豬鏈球菌疫苗主要有6種，分別為豬鏈球菌病蜂膠滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2型+馬鏈球菌獸疫亞種)、豬敗血性鏈球菌病活疫苗、豬鏈球菌病-副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗、豬鏈球菌病滅活疫苗(豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型+馬鏈球菌獸疫亞種)及豬鏈球菌滅活疫苗(2型，HA9801株)等[21]。近年流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，血清2型仍然具有較高的流行率，但血清9型的致病率和分離率有明顯上升的趨勢。由于豬鏈球菌不同血清型菌株之間的交叉保護性差，且市面上尚無針對血清9型的商品化疫苗，因此本研究中篩選血清9型強毒株及對強毒株進行相關(guān)生物學特性研究起著重要作用，為后續(xù)血清9型疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)支持。