金雀異黃素對三硝基苯磺酸誘導的結腸炎小鼠的干預作用及其可能機制▲

張怡華 呂曉丹 曾睿智 韓 冰 張維維 徐小芳 陳如艷 葉衛(wèi)政 陳曉戰(zhàn) 范俊華 詹靈凌 呂小平

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1 消化內科，2 檢驗科， 南寧市 530021，電子郵箱：624785938@qq.com)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)以胃腸道不受控制的慢性炎癥為特征，主要包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，其患病率逐年增加[1]。IBD的病因尚未完全明確，其與遺傳、免疫功能紊亂、腸道菌群失調、腸道屏障受損及環(huán)境等因素均有密切的關系，已成為全球性的健康問題[2-3]。目前治療IBD的藥物主要有5-氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑，這三類藥物對潰瘍性結腸炎或克羅恩病有一定的治療效果，但都有其各自的局限性及不良反應[4]。

金雀異黃素(genistein，GEN)是一種大豆中天然存在的異黃酮類物質，化學名為4′,5,7-三羥基異黃酮，不溶于水，但可溶于常用的有機溶劑。有研究表明，GEN有多種生物學作用，包括抗氧化、抗炎和抗癌[5-6]。還有研究表明GEN能顯著降低白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6的表達水平，且能顯著抑制HCT116細胞系中的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的核轉位，以及核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB,IκB)和核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor κB kinase,IKK)α/β的磷酸化[7]，而NF-κB信號通路在炎癥、適應性免疫反應中起著重要的調節(jié)作用[8]。p65是NF-κB家族成員之一，其一般以二聚體的形式存在。在未受到刺激時，這種二聚體被IκB-α隔離在胞質中；受到刺激時，IκB-α被磷酸化和降解，使游離的二聚體進入細胞核內，進而激活靶基因的轉錄，促進炎癥的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。由此可見，GEN可能可通過調節(jié)NF-κB信號通路參與炎癥反應。本研究旨在探討GEN對三硝基苯磺酸(trinitro-benzene sulfonic acid，TNBS)誘導的結腸炎小鼠模型的干預作用，并基于NF-κB 信號通路探討其作用機制，旨在為治療IBD的新藥研發(fā)提供理論依據和實驗參數。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周齡，體重為20～22 g，購于北京維通利華實驗動物中心(許可證號:SCXK 京2021-0011)。在無特定病原體級動物房里飼養(yǎng)，環(huán)境相對濕度為60%，溫度為24℃。給予所有小鼠自由進食、飲水1周后用于實驗。按隨機數字表法將小鼠分為正常對照組、模型組、柳氮磺砒啶組、GEN組，每組8只，并用耳標做好標記分別飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 GEN(批號：A2198)由APExBIO公司生產；TNBS(批號：P2297)由Sigma-Aldrich公司生產；柳氮磺砒啶由上海信宜天平藥業(yè)有限公司生產；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α；批號：EM0183)、IL-1β(批號：EM0109)、IL-10(批號：EM0100)ELISA試劑盒由武漢菲恩生物科技有限公司生產；兔單抗NF-κBp65抗體由Abcam公司生產；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體由Abcam公司生產(批號：ab181602)；兔單抗IκB抗體由Abmart公司生產；蛋白酶抑制劑(批號：A8260)、RIPA裂解液(批號：R0010)；洗膜緩沖液(TBST,批號：1085)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、聚偏氟乙烯膜(批號：ISEQ00010)均由Solarbio公司生產。

1.3 構建TNBS誘導的結腸炎小鼠模型與藥物干預 參照相關文獻[11-12]的方法進行造模：所有小鼠于造模前1 d禁食不禁水，正常對照組給予生理鹽水(4 mL/kg)灌腸，其余3組給予2.5%的TNBS溶液(4 mL/kg)灌腸。建模后第2天若小鼠出現明顯的體重下降，大便性狀改變或血便，則可以初步確定小鼠造模成功，隨后在鏡下觀察小鼠結腸病理切片進一步確定。確定造模成功后再進行干預。造模第2天，給予正常對照組、模型組生理鹽水(8 mL/kg)灌胃，對柳氮磺砒啶組小鼠用柳氮磺砒啶(450 mg/kg)(柳氮磺砒啶用生理鹽水溶解)灌胃，GEN組小鼠用 GEN(20 mg/kg)灌胃，藥物的灌胃劑量參照相關文獻[13-14]及預實驗結果,均為1次/d，連續(xù)給藥7 d。實驗期間若有小鼠建模不成功或死亡，則進行等量補充。

1.4 評估小鼠的疾病活動指數 于造模后第2天開始至給藥結束，參照相關標準[15]，評估各組小鼠的疾病活動指數(disease activity index，DAI)，最后取7 d的平均值作為小鼠的DAI,評分標準見表1。

表1 DAI評分表

1.5 獲取標本 連續(xù)給藥7 d后采用頸椎脫臼法處死小鼠。眼眶采取800～1 000 μL血液，靜置至第2天，4℃環(huán)境下3 000 r/min離心10 min后取上層血清用于檢測炎癥因子水平；分離結腸組織，觀察大體形態(tài)后，將部分結腸用4%多聚甲醛固定，其余結腸組織放于-80℃冰箱中保存。

1.6 評估結腸形態(tài) 取近肛門端直腸至盲腸的結腸段，測量長度，剖開清理后觀察并測量潰瘍的大小，評估結腸大體形態(tài)損傷指數(colon macroscopic damage index，CMDI)[16]，CMDI 評分標準見表2。

表2 CMDI評分標準

1.7 觀察結腸病理變化 取近端肛門處結腸組織進行石蠟包埋、制作切片、HE染色，然后在顯微鏡下觀察結腸組織的病理變化。

1.8 相關指標檢測

1.8.1 血清炎癥因子水平：取離心后的血清，根據試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血清IL-1β、IL-10、TNF-α 水平。使用iMark型全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)測定450 nm 波長處各孔的光密度值。以標準品的光密度值，繪制標準曲線，通過標準曲線計算標本各指標的濃度。

1.8.2 結腸組織IκB-α和p65蛋白表達水平：采用蛋白免疫印跡法檢測結腸組織中IκB-α和p65的蛋白表達水平。隨機取30 mg的結腸組織用冷PBS沖洗2～3次后置于勻漿管中。加入2個2 mm磁珠、300 μL含蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液的混合液后，置于研磨儀(武漢賽維爾科技有限公司)進行研磨。研磨結束后放置冰上靜置30 min，吸取上清，利用RF-5301PC型分光光度計(日本島津公司)上檢測蛋白樣品濃度。然后將5×蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品按照4 ∶1混勻后，再進行沸水浴10 min。蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠用 120 V，濃縮膠電壓75 V)后進行1 h的轉膜，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜(200 mA)上，用 TBST洗膜3次(10 min/次)。5%脫脂牛奶封閉 1 h，用 TBST洗膜3次(10 min/次)，4℃孵育一抗(稀釋比例為1 ∶20 000)過夜。第2天用TBST洗膜3次(10 min/次)，室溫下孵育二抗(稀釋比例為1 ∶10 000)1 h后，用TBST洗膜3次(10 min/次)。然后用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)進行掃膜，再利用ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。以GAPDH為內參，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶的灰度值/內參蛋白條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠的一般情況和DAI的比較 造模后第2天，除正常對照組外，其他組小鼠開始出現大便異常，體重下降；但柳氮磺砒啶組和GEN組小鼠經過灌胃相應的藥物后，大便性狀、便血及體重下降情況均較模型組有所改善。模型組、柳氮磺砒啶組的DAI高于正常對照組，而柳氮磺砒啶組和GEN組的DAI均低于模型組(均P<0.05)，但GEN組與柳氮磺砒啶組的DAI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.2 各組小鼠的結腸長度和CMDI的比較 與正常對照組相比，其余3組小鼠的結腸均縮短，且出現不同程度潰瘍和炎癥等結腸損傷表現，CMDI升高(均P<0.05)；而與模型組相比，GEN組與柳氮磺砒啶組小鼠的結腸長度增加，CMDI降低(均P<0.05)；但GEN組與柳氮磺砒啶組小鼠的結腸長度和CMDI比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組小鼠DAI 、結腸長度和CMDI的比較(x±s)

2.3 各組小鼠的結腸病理變化 正常對照組小鼠的結腸組織形態(tài)正常，而模型組小鼠的結腸組織中炎癥細胞浸潤明顯，程度較重，進一步證實建模成功；柳氮磺砒啶組和GEN組小鼠的結腸組織雖有炎癥細胞浸潤，但程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理改變(HE染色，×100)

2.4 各組小鼠的血清炎癥因子水平的比較 與正常對照組比較，模型組和柳氮磺砒啶組血清TNF-α水平升高，3組血清IL-1β水平均升高，模型組血清IL-10水平降低，而柳氮磺砒啶組和GEN組血清IL-10水平升高(均P<0.05)。與模型組比較，柳氮磺砒啶組和GEN組血清TNF-α與IL-1β水平降低，而血清IL-10水平升高(均P<0.05)。與柳氮磺砒啶組相比，GEN組血清IL-1β水平降低而血清IL-10水平升高(均P<0.05)，但兩組血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 4組小鼠血清炎癥因子水平的比較(x±s，ng/mL)

2.5 各組小鼠結腸組織中IκB-α蛋白與p65蛋白相對表達量的比較 模型組的IκB-α蛋白與p65蛋白相對表達量均高于其余各組(均P<0.05)；柳氮磺砒啶組和GEN組的IκB-α蛋白、p65蛋白相對表達量與正常對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；GEN組的p65蛋白相對表達量高于柳氮磺砒啶組(P<0.05)，但兩組的IκB-α蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5和圖2。

表5 4組小鼠結腸組織中IκB-α蛋白與p65蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖2 4組小鼠結腸組織中IκB-α蛋白和p65蛋白的表達情況

3 討 論

IBD是一組病因未明的慢性腸道炎癥性疾病，可能與遺傳、生物等因素有關，因患病率逐年升高，其已成為全球常見的消化系統(tǒng)疾病[17]。目前，治療IBD的常見藥物之一為生物制劑。不可否認，生物制劑具有療效好、起效快等優(yōu)點，但由于價格、免疫原性及長期應用的療效和安全性等原因使其難以成為IBD患者的最優(yōu)選擇[18-20]。另外，對于一部分患者而言，生物制劑的治療效果并不理想，需要尋找更佳的治療藥物。GEN是一類植物雌激素，為大豆的主要成分，在豆類食品中含量豐富，被人體攝取后主要以糖苷的形式存在[21]，具有酪氨酸激酶抑制劑活性，參與多種生物過程，可發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種作用[22-23]。在東方的飲食結構中，大豆是不可或缺的食物，亞洲人群的豆制品食用量高于歐美各國人群[24]，《中國居民膳食指南(2019)》[25]也建議每人每天應攝取30～50 g大豆或相當量的豆制品，而食用大豆可增加GEN的攝入量[26]。這為我們開展GEN治療IBD的作用機制研究提供了現實依據，且GEN治療IBD在國外是研究熱點之一，這說明GEN具有潛在的研究價值。

本研究結果顯示，建模后模型組結腸炎小鼠出現體重下降，排血便或無便，結腸縮短，且DAI和CMDI均升高(均P<0.05)，提示結腸炎小鼠模型建模成功；與模型組相比，GEN組小鼠的大便性狀、便血及體重下降等情況均有所改善，結腸長度增加，DAI和CMDI均降低(均P<0.05)。這提示GEN可以減輕結腸炎小鼠的疾病活動程度，緩解潰瘍和炎癥等結腸損傷情況，有效改善結腸炎小鼠的癥狀。此外，模型組小鼠腸壁炎癥細胞的浸潤程度顯著增加，血清中促炎因子IL-1β、TNF-α水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低(均P<0.05)；GEN組小鼠腸壁炎癥細胞浸潤情況較模型組減輕，且促炎因子水平降低，抗炎因子水平升高(均P<0.05)。這表明GEN對TNBS所致的結腸炎小鼠具有一定的抗炎作用。而與柳氮磺砒啶組相比，GEN組促炎因子IL-1β水平更低，抗炎因子IL-10水平更高(均P<0.05)，這提示GEN具有更優(yōu)的抗炎作用。雖然GEN組的DAI和CMDI高于柳氮磺砒啶組，但差異并無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，這可能與樣本量較小、觀察時間較短等因素有關。

NF-κB信號通路是調節(jié)炎癥的關鍵通路，位于胞質中無活性的NF-κB可經TNF-α、IL-1等多種刺激因子誘導而被激活。NF-κB通路被激活后，IκB被IKK磷酸化，磷酸化后的IκB 被26S蛋白酶小體降解，進而使NF-κB被釋放進入細胞核進行轉錄，促進與炎癥相關的組織損傷的發(fā)生[27]。有研究表明，NF-κB信號通路在促進炎癥的發(fā)展中起重要作用，其在結腸炎小鼠結腸黏膜中的表達升高[28]。還有研究表明，激活NF-κB的復合物主要成分為p65蛋白，當NF-κB活性增強時，p65蛋白的水平上調，從而促進腸道炎癥的發(fā)展[29-30]。因此，本研究通過檢測結腸組織IκB-α和p65蛋白的相對表達情況，了解GEN對結腸炎的干預作用是否與NF-κB信號通路有關。結果顯示，模型組小鼠結腸組織中 IκB-α蛋白和p65蛋白的相對表達量升高，而GEN組小鼠結腸組織中 IκB-α蛋白及p65蛋白的相對表達量均低于模型組(均P<0.05)。這表明GEN能夠下調IκB-α和p65蛋白的表達水平，從而抑制NF-κB信號通路的激活。由此推測，GEN對TNBS誘導的結腸炎小鼠的干預作用，可能與其抑制了NF-κB信號通路的活性，從而發(fā)揮抗炎作用有關[31]。

綜上所述，GEN能夠抑制TNBS誘導的結腸炎小鼠的炎癥反應從而緩解癥狀，作用機制可能與其抑制NF-κB信號通路有關，其或可成為治療IBD的潛在藥物。本研究存在以下不足：GEN對TNBS所致結腸炎小鼠的抗炎作用的具體機制還未完全了解，尤其在基因層次的研究尚有不足，也無法得知GEN是否還通過其他信號通路發(fā)揮其抗炎的作用，此外GEN用于治療結腸炎可能會產生的副作用也尚未完全清楚。因此，今后還需深入研究探討GEN治療結腸炎的療效、確切作用機制和安全性。