UPLC法同時測定不同產(chǎn)地大黃中游離蒽醌的含量*

劉炳旺，徐文貴，王 健

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院分子影像及核醫(yī)學(xué)診療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

UPLC法同時測定不同產(chǎn)地大黃中游離蒽醌的含量*

劉炳旺，徐文貴，王 健

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院分子影像及核醫(yī)學(xué)診療科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300060）

[目的]建立超高效液相色譜法同時測定13批不同產(chǎn)地大黃中大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等5種游離蒽醌的含量。[方法]采用Waters BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。[結(jié)果]大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素分別在1.61～80.30，4.98～249.20，3.27～163.30，9.65～482.50，1.67～83.30 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。[結(jié)論]該方法簡便可行，重復(fù)性良好，可用于大黃藥材的質(zhì)量控制。

大黃；含量測定；超高效液相色譜法

《中國藥典》2010年版（一部）收載的大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L）、唐古特大黃（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（R.officinale Baill）的干燥根及根莖，具有瀉下攻擊，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)，利濕退黃之功效[1]，為治療熱結(jié)便秘之要藥。大黃化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯苷類以及鞣質(zhì)類化合物，現(xiàn)代藥理研究表明大黃具有抗感染[2]、利膽[3]、止血[3]、抗腫瘤[4]、治療慢性腎功能不全[5-7]等功效，在預(yù)防和治療多器官功能不全綜合征和多器官功能紊亂綜合征方面亦有顯著療效[8]。

1 儀器和試藥

安捷倫1290超高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括：二元高壓泵、在線真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）等，AX205十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司），BP121S萬分之一天平（德國塞多利斯公司），超純水機(jī):Mili-QⅡ型（美國Millipore公司），KQ-300B型超聲波清洗器（江蘇昆山分析儀器廠）。對照品大黃酸（110757-200206）、大黃酚（110796-201017）、大黃素（110756-200110）、大黃素甲醚（110758-200912）、蘆薈大黃素（110795-200806）購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈（Fisher）、甲酸（TEDIA）均為色譜醇，其他試劑為分析純。大黃藥材購于天津市中藥飲片廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的制備 精密稱取大黃酸對照品2.41 mg，蘆薈大黃素對照品2.50 mg分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，搖勻，即得大黃酸和蘆薈大黃素儲備液。精密稱取大黃酚對照品2.99 mg，大黃素1.96 mg，大黃素甲醚5.79 mg分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，搖勻，即得大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的儲備液。精密量取各儲備液及甲醇1 mL等體積混合，搖勻即得含大黃酸80.3 μg/mL，大黃酚249.2 μg/mL，大黃素163.3 μg/mL，大黃素甲醚482.5 μg/mL，蘆薈大黃素83.3 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備 將大黃藥材粉碎，過40目篩，精密稱取約0.5 g藥材置50 mL具塞三角瓶中，精密量取25 mL 100%甲醇，稱質(zhì)量，超聲60 min，放冷后加甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱為WatersBEHC18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流動相：乙睛（A）：0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速：0.3 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：1 μL。理論塔板數(shù)以大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素計(jì)算均不低于5 000，5個成分與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05之間。對照品及樣品圖譜見圖1，2。

圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

圖2 樣品S1的UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of sample S1 solution

2.4 線性關(guān)系的考察 精密移取混合對照品儲備液，采用逐級稀釋方法，以甲醇配制一系列混合對照品溶液：大黃酸濃度為1.61，4.02，8.03，16.06, 40.15,80.3 μg/mL；大黃酚濃度為4.98，12.46，24.92, 49.83,124.6,249.2 μg/mL；大黃素濃度為3.27，8.17, 16.33,32.67，81.67，163.3 μg/mL；大黃素甲醚濃度為：9.65,24.13,48.25,96.50,241.30,482.50 μg/mL；蘆薈大黃素濃度為1.67,4.17,8.33,16.67,41.67, 83.33 μg/mL。吸取上述系列溶液1 μL注入超高效液相色譜儀，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。分別以對照品濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍（見表1），表明各化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取樣品S1（產(chǎn)地：四川），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算，大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.81%、0.32%、0.62%、1.56%、0.54%。

表1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 The results of the linear relationship test（n=6）

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品S1，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每2 h進(jìn)樣1次，以峰面積計(jì)算，大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的RSD（n=7）分別為0.59%、1.34%、1.09%、2.33%、0.37%。結(jié)果表明：室溫條件下供試品溶液中各化合物在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樣品S1，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行測定，結(jié)果表明大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的含量平均值分別為 0.22%，0.50%，0.09%，0.92%，0.12%。RSD分別為0.63%，0.45%，0.55%，0.52%，1.32%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取“2.7”項(xiàng)下重復(fù)性實(shí)驗(yàn)已測知含量的藥材粉末0.25 g，置50 mL具塞三角瓶中，分別加入大黃酸對照品0.55 mg、大黃酚對照品1.25 mg、大黃素對照品0.23 mg、大黃素甲醚對照品2.3 mg、蘆薈大黃素對照品0.30 mg，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，重復(fù)5次，結(jié)果上述5種化合物平均回收率分別99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。RSD分別為1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。

2.9 含量測定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定13批不同產(chǎn)地大黃中大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的峰面積，分別根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算含量，每批藥材平行操作2份。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 《中國藥典》2010版規(guī)定檢測波長為254 nm，通過文獻(xiàn)及實(shí)際操作過程發(fā)現(xiàn)254 nm各色譜峰分離較好，280 nm基線也較好，但響應(yīng)值不如254 nm。

3.2 色譜條件的選擇 實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)、乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)。結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)色譜峰分離度較好且柱壓較低，因而選擇乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)中還對柱溫進(jìn)行了考察（25、30、35、40℃），結(jié)果表明30℃分離達(dá)基線且出峰時間較短。

表2 不同產(chǎn)地大黃含量測定結(jié)果Tab.2 The determination results of the different samples %

3.3 提取方法、提取溶劑及提取時間的考察 實(shí)驗(yàn)中比較了超聲和回流提取差別，結(jié)果表明超聲30min與回流30 min基本無差異，考慮到超聲方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，最終選擇超聲提取法。實(shí)驗(yàn)中分別采用50%、75%和100%甲醇對大黃藥材進(jìn)行提取溶媒濃度考察，結(jié)果表明100%甲醇對于5種游離蒽醌的提取效率最高。實(shí)驗(yàn)中還考察了提取時間（30、45、60、120 min），結(jié)果表明60 min目標(biāo)化合物峰面積明顯優(yōu)于30 min和45 min，但120 min與60 min差異不大，表明60 min基本提取完全。

本研究建立了大黃中5種游離蒽醌的UPLC含量測定方法，并應(yīng)用此方法對不同產(chǎn)地的13個批次藥材進(jìn)行了評價。結(jié)果表明，該方法可行，分離度較高，可用于大黃藥材的快速含量測定。

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Simultaneous determination of free anthraquinones in Rhubarb from different habitats by UPLC

LIU Bing-wang，XU Wen-gui，Wang Jian
（Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of“Cancer Prevention and Therapy”，Tianjin 300060，China）

[Objective]To develop a UPLC method for simultaneous determination of five anthraquinones(Rhein，Chrysophanol，Emodin，Physcion and Aloe-emodin)in Radix et Rhizom a Rhei from different habitats.[Methods]The analysis was performed on Waters BEH C18column(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)with a gradient mobile phase of acetonitrile(A)-0.1%Formic acid solution(B)(0～3 min，19%→25% A，3～10 min，25%→100%A)at flow rate of 0.3 mL/min.The column was maintain at 30℃and the detection wavelength was set at 254 nm.[Results]The linear ranges were 1.61～80.30 μg/mL for Rhein，4.98～249.20 μg/mL for Chrysophanol，3.27～163.30 μg/mL for Emodin，9.65～482.50 μg/mL for Physcion and 1.67～83.30 μg/mL for Aloe-emodin.The average recoveries of the five compounds were 99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%and RSD were 1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%respectively.[Conclusion]The rapid and accurate UPLC method was established.This method can be used to assess the quality of Rhubarb.

Rhubarb；determination；UPLC

R284

：A

：1672-1519（2014）04-0238-03

2013-12-13）

（本文編輯：高 杉，馬 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30872954），天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目（2012KZ064）。

劉炳旺（1981-），男，藥師，主要從事正電子藥物的生產(chǎn)及藥物分析。

徐文貴，E-mail：wenguixy@tom.com。