金芪降糖片對糖尿病大鼠腎臟保護作用的實驗研究*

鄭 凝，魏世津

（天津市泰達醫(yī)院血液凈化科，天津 300457）

·實驗研究·

金芪降糖片對糖尿病大鼠腎臟保護作用的實驗研究*

鄭 凝，魏世津

（天津市泰達醫(yī)院血液凈化科，天津 300457）

[目的]觀察金芪降糖片對糖尿病大鼠腎組織晚期糖化終末產(chǎn)物受體（RAGE）、轉化生長因子－β1（TGF-β1）、血管內皮生長因子（VEGF）、結締組織生長因子（CTGF）表達的影響。[方法]測定造模后20周糖尿病組（DM組）、糖尿病給藥組（DD組）和對照組（N組）大鼠24 h尿微量白蛋白定量（UMA）、平均血糖（APG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、內生肌酐清除率（Ccr）、RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平及腎臟形態(tài)學改變，評價金芪降糖片的腎保護作用。[結果]與DM組相比，DD組平均血糖、TC差異無統(tǒng)計學意義，Ccr高于DM組，而UMA、TG、RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平降低，差異有統(tǒng)計學意義；光鏡和電鏡下，DD組腎組織損傷程度均輕于DM組。[結論]金芪降糖片可以減輕糖尿病慢性腎損傷的程度，其腎保護作用可能與其降脂及降低RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF水平有關。

金芪降糖片；糖尿病腎??；RAGE；TGF-β1；VEGF；CTGF

金芪降糖片組方源于《備急千金方》中的“千金黃連丸”，由黃連、黃芪、金銀花組方，主要用于降糖治療。筆者發(fā)現(xiàn)部分Ⅲ期糖尿病腎病患者應用金芪降糖片后24 h尿微量白蛋白（UMA）可以降低，并且金芪降糖片可能具有拮抗晚期糖化終末產(chǎn)物（AGEs）的作用[1]，故推測其可能具有腎臟保護作用。本實驗觀察金芪降糖片對鏈脲菌素（STZ）誘導糖尿病大鼠腎臟的保護作用，并探討相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型的建立、分組 12周齡的成年SD雄性大鼠，體質量為（200±20）g，為同批繁殖的封閉群，購于天津藥物研究院。適應性喂養(yǎng)2周后隨機留取10只作為正常對照組（N組）。其余禁食12 h后稱體質量、測血糖，以60 mg/kg STZ（溶于枸櫞酸緩沖液）尾靜脈注射，對照組尾靜脈注射枸櫞酸緩沖液，于給藥后第3天和第14天測定空腹血糖，兩次血糖均≥16.7 mmol/L者為造模成功，共46只。將造模成功的大鼠以血糖為標準按分層隨機分組方法分為糖尿病對照組 [DM組，23只，血糖：（23.31± 4.13）mmol/L]和糖尿病給藥組[DD組，23只，血糖：（23.47±4.12）mmol/L]。DD組按4.2g/（kg·d）給與金芪降糖片生粉（由中新藥業(yè)隆順榕制藥公司提供）灌胃，DM組和N組給與等量生理鹽水灌胃，每周測體質量1次，根據(jù)體質量調整給藥量，不給與其他藥物，每兩周經(jīng)鼠尾靜脈取血測血糖1次，共喂養(yǎng)20周，計算平均血糖值（APG）。

1.2 主要試劑與儀器 STZ（美國Sigma），β-actin（β-肌動蛋白）、小鼠單克隆RAGE抗體（美國B&D），兔抗鼠多克隆TGF－β1抗體、兔抗鼠多克隆VEGF抗體、羊抗鼠多克隆CTGF抗體（美國Santa Cruz），辣根酶標記羊抗兔及兔抗羊二抗、電化學發(fā)光顯色劑（美國Pierce）；荷蘭MICROLAB300自動生化分析儀，JAMMA-C12DPCγ計數(shù)器，熒光分光光度計（日本BROMM），樂康全血糖儀（香港羅氏）；Pharmacia垂直板蛋白電泳儀；Digital ScienceTM 1D Image Analysis Software圖像分析系統(tǒng)（美國Kodak）。

1.3 標本采集 在實驗的第20周末，各組大鼠入代謝籠，留取24 h尿，記錄尿量，檢測尿肌酐、24 h微量白蛋白（UMA）。股動脈放血處死大鼠，留取血標本，測血清肌酐、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC），計算內生肌酐清除率（Ccr）。迅速摘取兩側腎臟，右腎經(jīng)生理鹽水和0.1%二乙基焦磷酰胺（DEPC）水沖洗后，液氮中保存，用于Western Blotting檢測；左腎去包膜縱向切開，左腎上極取4～5塊1 mm3組織置于2.5%戊二醛固定液中固定，用于透射電鏡檢查；其余左腎組織于4%多聚甲醛中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋，切片（4 μm）用于形態(tài)學檢查。

1.4 Western Blotting檢測RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF蛋白表達 用蛋白裂解液提取組織蛋白，5% SDS-PAGE濃縮膠+10%SDS-PAGE分離膠電泳，轉移蛋白至硝酸纖維膜上，以5%脫脂奶封閉，分別加入RAGE單克隆抗體（1∶500，37℃孵育2 h），兔抗鼠多克隆TGF-β1抗體（1∶1 000，37℃孵育2 h），兔抗鼠多克隆VEGF抗體（1∶1 000，37℃孵育2 h）,羊抗鼠多克隆CTGF抗體（1∶1 000，37℃孵育2 h）。PBST洗膜，加入相應二抗（1∶5 000）孵育1 h，PBST洗膜，化學發(fā)光法顯影，以β-actin作為內參，進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計方法 使用SPSS 18.5統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較時，若方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Tamhane T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠生化指標 DD組和DM組大鼠體質量輕于N組，平均血糖高于N組，差異有統(tǒng)計學意義，DD組和DM組之間體質量和APG差異無統(tǒng)計學意義；DD組和N組24 h UMA低于DM組，差異有統(tǒng)計學意義；DM組Ccr較N組和DD組降低，差異有統(tǒng)計學意義；DD組TG水平高于N組但低于DM組，差異有統(tǒng)計學意義。DD組和DM組TC水平較DM組升高，差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 金芪降糖片對糖尿病大鼠腎皮質 RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGF表達的影響 見表2、圖1。DM組RAGE、TGF-β1、VEGF和CTGF蛋白表達水平顯著性高于N組（P＜0.05）和DD組（P＜0.05），而DD組與N組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腎臟形態(tài)學改變 與N組和DD組相比，光鏡下DM組腎小球體積輕度增大，毛細血管腔擴張，近曲和遠曲小管管腔擴張，集合管周圍間質細胞疏松、水腫（見圖2）。電鏡下DM組近系膜側基膜增寬，以內皮下側基質增加明顯，且電子密度不均勻。足細胞數(shù)量增多，細胞體積增大，足細胞突起階段性融合。DD組上述病理改變明顯輕于DM組（見圖3）。

表1 各組大鼠體質量、APG、UMA、GFR比較（±s）Tab.1 Comparison of the levels of body weight,APG, UMA,GFR in rats in each group（±s）

表1 各組大鼠體質量、APG、UMA、GFR比較（±s）Tab.1 Comparison of the levels of body weight,APG, UMA,GFR in rats in each group（±s）

注：與N組相比，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05。

APG（mmol/L）DD組 264.38±46.86*25.41±3.89* DM組 286.25±62.78*27.80±2.80* N組 434.50±40.58#5.42±0.21#項目 體質量（g）TC（mmol/L）2.67±0.36#2.87±0.56*#5.05±1.27* 2.31±0.23*4.35±0.92*5.33±1.09* 2.70±0.29#1.59±0.41#3.83±0.77#UMA（mg/d）6.95±2.65*#14.52±5.90* 4.36±1.03#Ccr（ml/min）TG（mmol/L）

表2 各組大鼠腎皮質TGF-β1、VEGF、CTGF水平比較（±s）Tab.2 Comparison of the levels of TGF-β1,VEGF and CTGF in cortex of kidney of rats（±s）

表2 各組大鼠腎皮質TGF-β1、VEGF、CTGF水平比較（±s）Tab.2 Comparison of the levels of TGF-β1,VEGF and CTGF in cortex of kidney of rats（±s）

注：與N組相比，*P＜0.05；和DM組間比較，#P＜0.05。

組別 RAGE VEGF TGF-β1 CTGF DD組 8.26±4.47#0.42±0.18#2.70±1.60#2.37±1.38#DM組 17.44±7.91* 1.35±0.88* 4.91±1.50* 4.34±2.44* N組 7.00±3.54#0.40±0.21#2.57±1.20#2.31±1.44#

圖1 Western blotting測定大鼠腎皮質RAGE、TGF-β1、VEGF、CTGFFig.1 Detection of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in rats by Western blotting

圖2 大鼠光鏡下腎組織形態(tài)Fig.2 Histology nephropathy under light microscope in rats

圖3 大鼠電鏡下腎組織形態(tài)Fig.3 Ultrasructural pathology in nephropathy of rats

3 討論

DD組大鼠24 h UMA低于DM組，Ccr高于DM組，形態(tài)學的病理變化也輕于DM組，提示金芪降糖片具有腎保護作用。而本次實驗動物造模為1型DM，DD組和DM組平均血糖差異無統(tǒng)計學意義，表明金芪降糖片的腎保護作用是獨立于血糖因素之外的。

目前學術界在DN領域研究的熱點之一是轉化生長因子－β(TGF-β)和血管內皮生長因子(VEGF)與DN發(fā)病的關系。近年的研究又發(fā)現(xiàn)TGF-β的下游因子CTGF有很強的致纖維化作用，與多種腎病的纖維化改變密切相關。VEGF是1989年被證實存在于體內的一類糖蛋白，與血管內皮細胞上的受體結合，可促使內皮細胞產(chǎn)生有絲分裂，誘導內皮細胞增殖和遷徒，誘導新血管生成，增加血管通透性，促進血漿蛋白滲出到血管間隙，誘發(fā)局部炎癥反應[2]。TGF-β為調節(jié)細胞生長和分化的一組超家族分子，有5種同分異構體：TGF-β1－TGF-β5，以TGF-β1最為重要。TGF-β1主要由腎間質的成纖維細胞和肌纖維母細胞產(chǎn)生，腎小管和浸潤于腎間質的單核細胞也是TGF-β1的重要來源。目前已經(jīng)證實，TGF-β1是一種強效的致纖維因子，被認為是腎纖維化病變中最重要的作用因子。糖尿病腎病的主要病理改變是炎癥和纖維化，TGF-β1在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色，被有的學者稱為糖尿病腎病病變中“最壞的壞蛋”[3-4]。1991年Bradham等首次發(fā)現(xiàn)了CTGF。在成人組織中CTGF mRNA在諸多器官有表達，特別在腎臟有較高的表達。目前已知CTGF是TGF-β1的下游因子,其生物學效應有：加速DNA合成、促進細胞增殖，促進新生血管形成，介導細胞黏附，刺激細胞遷移等。在病理情況下，其過度表達與某些增生性或纖維化性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，如硬皮病、腎纖維化、肝硬化、肺纖維化、動脈粥樣硬化等，因此CTGF在組織器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[5]。

本次實驗中，VEGF、TGF-β1、CTGF結果相近，DM組這3種因子水平在20周顯著性升高，提示這些腎損傷因子在DN的發(fā)病機制中也占重要地位。3者很可能存在著協(xié)同作用，CTGF是TGF-β1的下游因子，而VEGF和TGF-β1也有密切的聯(lián)系。有學者發(fā)現(xiàn)，在尿蛋白水平正常的1型糖尿病患者體內就存在VEGF、TGF-β1、CTGF表達上調的現(xiàn)象，伴有巨噬細胞趨化蛋白1（MCP-1）、γ干擾素（IFN-γ）等炎性因子表達增多[6]。有學者報道高糖環(huán)境下足細胞表達VEGF增多，隨后可誘發(fā)單核吞噬細胞(MPs)的募集和活化，以及TGF-β1的生成增多，導致足細胞凋亡，加快腎小球纖維化[7]。已有多個實驗發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者和糖尿病動物模型的腎小球膜和腎小管袢發(fā)現(xiàn)TGF-β1及CTGF的mRNA和蛋白水平明顯增高[8]，CTGF促進TGF-β1與其受體的結合[8]，而TGF-β1則通過活化MAPK通路促進CTGF表達[9]。用抗纖維化藥佛非尼酮（Fluorofenidone）抑制ERK1/2,P38和JNK磷酸化，從而阻斷MAPK通路，可抑制CTGF表達[9]。采用抗－TGF-β1抗體短期治療可以抑制糖尿病小鼠腎小球系膜細胞外基質分子的表達和腎小球肥大的進展,長期治療則可以抑制腎小球系膜基質擴展和腎功能的減退,但對蛋白尿無影響[10]。可見,VEGF、TGF-β1和CTGF的活化與DN的發(fā)生和發(fā)展有密切關系。

DD組VEGF、TGF-β1、CTGF的表達都可被金芪降糖片抑制，提示三者在發(fā)揮生物學效應時可能存在共同的節(jié)點或交叉步驟，而這個節(jié)點又可被金芪降糖片抑制，據(jù)此推論這個節(jié)點很可能是RAGE。AGEs是糖、蛋白質、脂質間非酶促反應的終末產(chǎn)物，可以修飾蛋白，引起脂蛋白積累和氧化。其受體RAGE是免疫球蛋白超家族的一員,可作為跨細胞膜信息傳遞的通道，AGEs與RAGE結合可誘發(fā)氧化應激，活化補體，激活p21ras、絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、NF-кB等細胞信號傳導途徑的關鍵節(jié)點，引發(fā)炎性反應,從而刺激腎系膜細胞增殖，增加腎小球毛細血管內皮細胞通透性，促進凝血物質活化，從而引起一系列病理生理學變化，導致腎組織損傷和纖維化[11]。有報道AGEs-胎牛血清蛋白活化RAGE，通過MAPK、NF-κB等途徑導致近曲小管間質表達VEGF、TGF-β1、CTGF增多[12]。Thoralf M等人用胰島素抵抗的糖尿病鼠和RAGE缺乏的純合子鼠為實驗對象，在小鼠13周活化RAGE后，足細胞表達高水平的VEGF和VCAM-1，引起MPs的募集和活化，出現(xiàn)明顯的腎小球系膜基質擴張和腎小球基底膜增厚，RAGE拮抗劑可以抑制這種情況，拮抗劑干預組小鼠的蛋白尿和腎小球硬化的程度明顯輕于未治療組，腎功能明顯改善。RAGE缺乏的純合子鼠則未出現(xiàn)明顯的腎小球系膜基質擴張和腎小球基底膜增厚。結合這些情況，Thoralf M等人提出：RAGE的活化促進了VEGF的表達和炎癥細胞在腎小球的募集和活化，從而促進了腎小球系膜細胞的活化和TGF-β表達，進一步促進了CTGF的表達,導致了蛋白尿和腎小球硬化[13]。本組實驗的結果為上述說法提供了佐證，DD組RAGE受到抑制后VEGF、TGF-β1、CTGF的表達也明顯降低，24 h UMA降低，Ccr升高。

金芪降糖片對RAGE抑制的機制尚不清楚，其所含的黃芪、黃連等成分，也是中醫(yī)在糖尿病腎病治療中最常用的藥物[14-15]筆者推測可能與其抗氧化和降脂作用有關。蛋白質不僅可被糖類修飾，也可被脂類修飾，RAGE的配體AGEs有相當部分是來源于脂肪酸的，故高甘油三酯血癥與AGEs的蓄積和RAGE的活化密切相關。而氧化應激也可以促進RAGE表達及活化，RAGE活化后又可以引起局部組織活性氧（ROS）大量生成，加重氧化應激，促進炎性因子釋放[16]。申竹芳報道，金芪降糖片能使花生油灌胃的高血糖小鼠血甘油三酯水平下降75.6%，使高糖高脂喂養(yǎng)大鼠的血甘油三酯水平下降39%，并使患脂肪肝動物的甘油三酯含量降低40%[17]。本次實驗中，筆者也發(fā)現(xiàn)DD組TG水平低于DM組。另外，糖尿病動物機體抗氧化能力下降，血或尿中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性升高，而金芪能使糖尿病小鼠肝臟丙二醛（MDA）含量降低18.5%，血NAG酶活性下降48.8%[17]。還有報道，金芪降糖片可以改善胰島素抵抗，降低血漿纖溶酶原抑制物（PAI-1）水平，升高組織纖溶酶原激活物（t-PA）活性[18]。抑制了氧化應激，降低了甘油三脂水平，金芪降糖片就可以有效地拮抗AGEs物質的產(chǎn)生和RAGE的持續(xù)高表達，并拮抗VEGF、TGF-β1、CTGF的表達，改善纖溶活性，減輕腎組織損傷。

綜上所述，金芪降糖片具有獨立于血糖因素以外的腎保護作用，其機制可能與其降脂、抗氧化作用抑制RAGE表達，降低腎組織VEGF、TGF-β1、CTGF水平有關，從而為糖尿病腎病的防治提供了新的思路。

[1]鄭 凝，陳莉明，曾淑范，金芪降糖片配伍胰激態(tài)原酶對Ⅲ期糖尿病腎病的治療作用[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2006，7（5）：291-292.

[2] Mironidou-Tzouveleki M,Tsartsalis S,Tomos C.Vascular endothelial growth factor(VEGF)in the pathogenesis of diabetic nephropathy of type 1 diabetes mellitus[J].Curr Drug Targets,2011,12(1): 107-114.

[3] Ziyadeh FN,Wolf G.Pathogenesis of the podocytopathy and proteinuria in diabetic glomerulopathy[J].Curr Diabetes Rev,2008,4(1): 39-45.

[4] Lee HS.Pathogenic role of TGF-β in the progression of podocyte diseases[J].Histol Histopathol,2011,26(1):107-116.

[5]Jiang WL,Xu Y,Zhang SP,et al.Effect of rosmarinic acid on experimental diabetic nephropathy[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2012,110(4):390-395.

[6]Ellina O,Chatzigeorgiou A,Kouyanou S,et al.Extracellular matrixassociated(GAGs,CTGF),angiogenic(VEGF)and inflammatory factors(MCP-1,CD40,IFN-γ)in type 1 diabetes mellitus nephropathy [J].Clin Chem Lab Med,2012,50(1):167-174.

[7]Ziyadeh FN,Wolf G.Pathogenesis of the podocytopathy and proteinuria in diabetic glomerulopathy[J].Curr Diabetes Rev,2008,4(1): 39-45.

[8] Ito Y,Goldschmeding R,Kasuga H,et al.Expression patterns of connective tissue growth factor and of TGF-beta isoforms during glomerular injury recapitulate glomerulogenesis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,299(3):F545-558.

[9] Wang L,Hu GY,Shen H,et al.Fluorofenidone inhibits TGF-beta1 induced CTGF via MAPK pathways in mouse mesangial cells[J].Pharmazie,2009,64(10):680-684.

[10]Ziyadeh FN,Hoffman BB.l Long-term prevention of renal in sufficiency,excess matrix gene expression,and glomerular mesangial matrix expansion by treatment with monoclonal antitransforming growth factor-antibody in db/db cliabetic mice[J].Pro Nael Acad Sci USA,2000,97:8015-8020.

[11]Yan SF,Ramasamy R,Schmidt AM.Receptor for AGE(RAGE)and its ligands-cast into leading roles in diabetes and the inflammatory response[J].J Mol Med,2009,87(3):235-247.

[12]Tang SC,Leung JC,Lai KN.Diabetic tubulopathy:an emerging entity[J].Contrib Nephrol,2011,170:124-134.

[13]Thoralf M.RAGE Drives the Development of Glomenosclerosts and Implicates.Podocyle Activation in the Dathogenesis of Diabetic Wephropathy[J].American Journal of pathology,2003,162:1123-1137.

[14]王盛發(fā)，唐 劭，曹克光，糖尿病腎病中醫(yī)治療用藥規(guī)律分析[J]，天津中醫(yī)藥，2009,4,26(2):167-168.

[15]梁正宇，蘇文弟，閆 威，等，張柏林治療糖尿病腎病常用對藥介紹[J].天津中醫(yī)藥，2011,10,28(5):361-363.

[16]Coughlan MT,Thorburn DR,Penfold SA,et al.RAGE-induced cytosolic ROS promote mitochondrial superoxide generation in diabetes[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(4):742-52.

[17]申竹芳，金芪降糖片抗糖尿病的藥理作用基礎[J].國外醫(yī)學·內分泌學分冊，2004，24（3）：215-216.

[18]張 琦，馮 憑，金芪降糖片對高脂胰島素抵抗鼠PAI-1和t-PA活性的影響[J].天津中醫(yī)藥，2004,21(4):328-330.

Experimental study of protective effect of Jinqi sugar-lowering tablet on kidney in rats with diabetes

ZHENG Ning,WEI Shi-jin
（Department of Blood Purification Center,TianJin TEDA Hospital,Tianjin 300457,China）

[Objective]To observe the effect of Jinqi sugar-lowering tablet on the expression of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in kidney of rats with diabetes.[Methods]The level of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in kidney in group of rats with diabetes（group DM）,group in diabetes with Jinqi tablet（group DD）and control group（group N）was determined at 20 weeks after inducing of diabetes.Their average plasma glucose （APG），triglyceride （TG），total cholesterol（TC），endogenous creatinine clearance （Ccr）and urine microalbumin were recorded.[Results]Compared to the group DM,the level of UMA,TG,RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF in group DD was lower（P＜0.05）,but the Ccr was higher.The level of APG and TC between group DD and group DM was not different.Renal pathological changes in group DD was better than that in DM group.[Conclusion]Taking Jinqi Sugar-lowering tablet may decrease the renal damage of diabetes.The renal protection of Jinqi Sugar-lowering tablet is related with controlling blood sugar and it may be related with the inhibition of RAGE,TGF-β1,VEGF and CTGF.

Jinqi sugar-lowering tablet;diabetic nephropathy;RAGE;TGF-β1;VEGF;CTGF

R587.1

：A

：1672-1519（2014）04-0226-05

2013-12-10）

（本文編輯：馬 英，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.12

天津市中醫(yī)藥管理局中西醫(yī)結合科研課題（11112），天津市濱海新區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2011BHKY015）。

鄭 凝（1972-），男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病腎病，腎功能衰竭，血液凈化的研究工作。