中成藥大黃蟄蟲丸的宏條形碼基原鑒定*

田曉軒，劉 杰，竇永杰，趙亞楠，呂朝耕，張春暉，朱 彥

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津 300193）

·中藥研究·

中成藥大黃蟄蟲丸的宏條形碼基原鑒定*

田曉軒，劉 杰，竇永杰，趙亞楠，呂朝耕，張春暉，朱 彥

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），天津 300193）

[目的]探索應(yīng)用宏條形碼方法進(jìn)行復(fù)方中成藥基原鑒定分析的可行性。[方法]磁珠法提取中藥大黃蟄蟲丸DNA，以16S、trnL及Mini-barcode為靶標(biāo)進(jìn)行熒光定量PCR。產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序拼接后，經(jīng)BLASTn比對(duì)，用MEGAN軟件進(jìn)行分類單元解析，對(duì)虻蟲來(lái)源序列應(yīng)用MEGA軟件進(jìn)行遺傳分析。[結(jié)果]從23條單克隆測(cè)序結(jié)果中解析到蠐螬、虻蟲、甘草及桃仁或苦杏仁等中藥成分，對(duì)虻蟲6條序列分析，顯示其源于3組遺傳差異較顯著的個(gè)體。[結(jié)論]宏條形碼技術(shù)可用于中成藥成分的鑒定，可作為中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的潛在工具。

中成藥；大黃蟄蟲丸；宏條形碼；分類單元匹配；遺傳分析

中藥的基原鑒定是中藥研究的基礎(chǔ)工作，其方法包括較傳統(tǒng)的原植物（原動(dòng)物）鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定等。除此以外，分子鑒定特別是DNA條形碼鑒定近年來(lái)發(fā)展迅猛，已構(gòu)建了關(guān)鍵性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，如MMDBD數(shù)據(jù)庫(kù)[1]及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所建立的中藥DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，形成了中藥DNA條形碼鑒定的規(guī)范流程[2-3]。

以上研究多以單獨(dú)的中藥飲片為對(duì)象，對(duì)于以復(fù)方中成藥為例的復(fù)雜體系，藥物基原的分子鑒定尚開展較少。較為相關(guān)的一項(xiàng)工作中，研究者以葉綠體trnL及核糖體16S為靶標(biāo)基因，從若干中成藥中提取DNA，結(jié)合DNA條形碼理論與高通量測(cè)序技術(shù)（即宏條形碼metabarcoding技術(shù)）進(jìn)行藥物基原檢測(cè)。該研究主要關(guān)注中藥中瀕危保護(hù)動(dòng)物以及潛在有毒生物成分的鑒別[4]，而從中藥生產(chǎn)實(shí)踐的角度看，宏條形碼技術(shù)既可用于藥物成分的真?zhèn)舞b定，也可通過(guò)其所揭示的參與成藥生物的遺傳多樣性，提供種質(zhì)層面的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。

本實(shí)驗(yàn)所試樣品大黃蟄蟲丸，源于漢代張仲景《金匱要略》方，主要成分為土鱉蟲（炒）、水蛭（制）、虻蟲（去翅足，炒）、蠐螬（炒）等4味動(dòng)物藥及熟大黃、干漆（煅）、桃仁、苦杏仁（炒）、黃芩、地黃、白芍、甘草等8味植物藥。在2010年版《中國(guó)藥典》中，質(zhì)量控制成分均為植物來(lái)源。本研究以該藥為材料，探索宏條形碼思路用于復(fù)方中成藥基原鑒定分析的可行性。

1 材料與方法

1.1 中成藥樣品DNA抽提 受試藥品大黃蟄蟲丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠），生產(chǎn)批號(hào)為4130023，生產(chǎn)日期2012年5月19日，2013年5月15日購(gòu)買于天津老百姓大藥房。后存儲(chǔ)于4℃冰箱內(nèi)。該藥品為大蜜丸劑，每丸3 g。

取丸藥100 mg，使用磁珠法動(dòng)物基因組試劑盒（生工生物）抽提DNA。加入400 μL Buffer MACL，200 μL Buffer MCL，以及終濃度1 mg/mL的蛋白酶K（生工生物）、1%巰基乙醇（生工生物），于55℃震蕩過(guò)夜。消化后樣品經(jīng)12 000 g離心5 min，取約500 μL上清液至新的離心管。磁珠法反復(fù)純化兩次，最終獲得60 μL DNA樣品。

經(jīng)Nanodrop 2000測(cè)試，樣品260 nm光吸收值為46.74。260 nm/230 nm為0.789，260 nm/280 nm為1.525，提示樣品污染仍較為嚴(yán)重，以260 nm光吸收值估算DNA濃度不可靠。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR及測(cè)序分析 實(shí)時(shí)定量PCR儀為Bio-Rad CFX96。實(shí)驗(yàn)所用TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒購(gòu)自全式金公司，擴(kuò)增動(dòng)物中的通用分子標(biāo)記線粒體16S核糖體RNA（rRNA）基因[5]，植物中的通用分子標(biāo)記葉綠體trnL基因[6]，以及在真核生物（側(cè)重動(dòng)物）中的通用分子標(biāo)記線粒體細(xì)胞色素氧化酶COI基因5’端約130 bp的片段（即Mini-barcode）[7]。實(shí)驗(yàn)所用引物由金唯智公司合成，引物信息見(jiàn)于表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

因樣品DNA真實(shí)含量未知且可能存在PCR反應(yīng)抑制物質(zhì)，樣品的梯度稀釋液（原液、1/10及1/100）被用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系25 μL，模板上樣量1μL。PCR條件為94℃5 min，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的94℃變性30 s，退火30 s以及72℃延伸30 s，進(jìn)行熔解曲線分析后72℃10 min補(bǔ)齊末端。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)產(chǎn)物大小。本實(shí)驗(yàn)以初步探索宏條形碼技術(shù)中藥鑒定能力為目的，不必需深度測(cè)序?？紤]到單次二代測(cè)序成本較高，故PCR產(chǎn)物經(jīng)pMD-18T（Takara）-感受態(tài)細(xì)胞常規(guī)克隆后，挑取單菌落送金唯智公司Sanger法雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BioEdit7.2.5軟件拼接整理。

1.3 BLASTn-MEGAN分類單元解析及MEGA遺傳分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)National Centre for Biotechnology Information（NCBI）在線BLASTn 2.2.29+搜索比對(duì)。搜索參數(shù)中設(shè)置Match分?jǐn)?shù)為1，Mismatch分?jǐn)?shù)為-2，Gapcosts為0，Low Complexity Filter為“Yes”，Expect value為10，Hitlist size為100。搜尋對(duì)象為NCBI GenBank nucleotide nr/nt數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布時(shí)間為Jan 3,2014 4:14 AM。

將 BLASTn結(jié)果輸入宏基因組分析軟件MEtaGenome Analyzer（MEGAN）version 5.1.5[8]，根據(jù)最低共同祖先算法 Lowest Common Ancestor（LCA）進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分類單元解析，尋找能匹配到的最低分類單元。MEGAN分析參數(shù)設(shè)置，min score為65，top percent為5，min support為1。結(jié)合藥典規(guī)定的中藥基原，判斷各條序列源于何種中藥。

針對(duì)感興趣的中藥品種，使用分子遺傳分析軟件MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis（MEGA）version 6.06[9]，應(yīng)用Kimura-2距離法模型計(jì)算序列間的遺傳距離并做系統(tǒng)發(fā)育分析，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果 在40個(gè)循環(huán)內(nèi)，以大黃蟄蟲丸DNA的原液及1/10稀釋液為模板的PCR反應(yīng)，均無(wú)起飛的擴(kuò)增信號(hào)。以1/100稀釋液為模板，16S1F/2R擴(kuò)增的Ct值為20.32，trnL c/h擴(kuò)增的Ct值為15.43以及Mini-barcode擴(kuò)增的Ct值為30.12（軟件自動(dòng)確定的單一閾值為1.71）?？疾鞌U(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線，16S1F/2R擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為72℃，trnL c/h擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值為77℃。Mini-barcode擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線為多峰，非特異PCR反應(yīng)情況較嚴(yán)重。

2.2 克隆測(cè)序及序列比對(duì) Mini-barcode產(chǎn)物常規(guī)克隆失敗。16S1F/2R經(jīng)克隆后送12個(gè)單克隆雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果去除引物后，經(jīng)Clustal W比對(duì)（缺省參數(shù)），如圖1所示。trnL c/h送11個(gè)單克隆測(cè)序，整理方法同上，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 16S1F/2R克隆測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequences of 16S1F/2R PCR products

圖2 trnL c/h克隆測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequences of trnL c/h PCR products

2.3 序列的分類單元解析及遺傳距離分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLASTn比對(duì)后，經(jīng)MEGAN分析，將匹配結(jié)果展示至屬級(jí)分類單元，如圖2所示。共有19條序列成功匹配。其中16S來(lái)源序列匹配于全變態(tài)類昆蟲Endopterygota，2條序列匹配到鞘翅目多食亞目Polyphaga（T0035）及其下的金龜子科Anomala屬（T0054），即中藥蠐螬（金龜子科幼蟲）；6條序列匹配于虻蟲亞科Tabaninae（T0033，T0037，T0053）及其下的 Cydistomyia屬（T0032）和虻屬 Tabanus（T0050，T0051），即中藥虻蟲。trnL來(lái)源序列全部匹配于豆類植物（fabids），1條序列匹配于甘草屬Glycyrrhiza（T0048），即中藥甘草；10條序列匹配于李屬Prunus，即中藥桃仁或苦杏仁（T0026-T0031，T0045-T0047，T0049）。

圖3 MEGAN分類單元匹配結(jié)果Fig.3 Taxonomy assignments by MEGAN

本研究共得到6條匹配于虻蟲的單倍體序列。因16S序列為母系遺傳線粒體基因，一般的，每一單倍體序列代表至少一個(gè)“虻蟲”個(gè)體。計(jì)算其相互間遺傳距離可知，T0033與T0053，T0050與T0051間遺傳距離（D=0.006，S.E.=0.006）遠(yuǎn)小于平均值（D=0.065，S.E.=0.014）。將T0033與T0053，T0050與T0051成組，T0032及T0037單獨(dú)成組，經(jīng)遺傳分析發(fā)現(xiàn)，T0033&T0053組與T0050&T0051組間距離（D=0.036，S.E.=0.016）仍小于其他組間距離，詳見(jiàn)

圖4 代表虻蟲六條序列（OTUs）間的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of sequences（OTUs）that representing TCM Mengchong

表2 代表虻蟲的6條序列間及組間遺傳距離（Kimura-2 model，Bootstrap=1 000）Tab.2 Genetic distances between sequences(groups)that representing TCM Mengchong（Kimura-2 model，Bootstrap=1 000）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從約 1/30顆大黃蟄蟲丸藥中提取DNA。經(jīng)PCR、Sanger測(cè)序及生物信息學(xué)分析，鑒定出蠐螬、虻蟲、甘草及桃仁或苦杏仁等中藥。因測(cè)序通量較低（相對(duì)于高通量測(cè)序的百萬(wàn)級(jí)測(cè)讀通量），且部分藥物DNA受炮制影響可能降解，未能鑒定到所有方劑成分。本實(shí)驗(yàn)所用分子標(biāo)記16S及trnL具有序列較短易于擴(kuò)增的特點(diǎn)，被優(yōu)先用于宏條形碼研究[4]。但其并非中藥DNA條形碼研究主流分子標(biāo)記，參考數(shù)據(jù)集相對(duì)不完整且解析力不足。下一步考慮開發(fā)合適的分子標(biāo)記片段，立足于已基本完善的中藥DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行復(fù)方中成藥的鑒定研究。

商品化中藥飲片常見(jiàn)偽劣品[10-11]，而以虻蟲為例的許多動(dòng)物類飲片更存在著基原混偽，來(lái)源復(fù)雜的問(wèn)題[12-15]，且生產(chǎn)使用中質(zhì)量評(píng)價(jià)手段缺乏。本鑒定方法對(duì)此類缺乏化學(xué)特征標(biāo)記的動(dòng)物基原具有優(yōu)勢(shì)。本項(xiàng)研究中，軟件MEGAN將序列T0032解析為源于虻亞科全綠虻族Diachlorini的Cydistomyia屬。但目前尚未見(jiàn)全綠虻族在中國(guó)的分布報(bào)道[16]，同時(shí)因虻亞科參考數(shù)據(jù)的限制，尚不能認(rèn)為T0032確屬全綠虻族，但確可認(rèn)為存在至少三類遺傳差異較大的虻蟲個(gè)體用于該藥丸的生產(chǎn)。2010版中國(guó)藥典規(guī)定虻科昆蟲復(fù)帶虻Tabanus bivittatus為虻蟲藥材的原動(dòng)物。但此拉丁名為雙斑黃虻舊名，且該品種在藥材市場(chǎng)占有比重較小。故有專家建議以黃虻屬雙斑黃虻A(chǔ)tylotus bivittateinus Takahasi，并增加虻屬市場(chǎng)通行品種，如土灰虻（原野虻）Tabanus amaenus Walker，杭州虻T.hongchouensis Liu，廣西虻T.kwangsinesis Wang et Liu，布虻（佛光虻）T.budda Portschinsky及漢斯虻T.haysi Philip為中藥虻蟲的原動(dòng)物。此研究所揭示的虻蟲用料混雜情況，與之前的報(bào)道相符[17-18]。

中藥基原的準(zhǔn)確鑒定對(duì)于保證中藥的安全性、有效性及質(zhì)量穩(wěn)定性均具重要意義[19]。進(jìn)一步的，對(duì)于已上市中成藥所含成分的鑒定與遺傳多樣性的描述，既是生產(chǎn)質(zhì)量評(píng)價(jià)與合理臨床運(yùn)用的潛在要求[20-21]，也是中藥研究科學(xué)性與真實(shí)性的前提條件。隨著高通量測(cè)序成本的快速下降，通過(guò)多個(gè)中成藥樣本的并行測(cè)序，可以期待宏條形碼技術(shù)在中藥領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

[1]Lou SK,Wong KL,Li M,et al.An integrated web medicinal materials DNA database:MMDBD (Medicinal Materials DNA Barcode Database)[J].BMC Genomics,2010,11:402.

[2]陳士林,姚 輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J].中國(guó)中藥雜志,2013,59(2):141-148.

[3]袁慶軍,張文婧,姜 丹,等.論中藥分子鑒定的方法和原則[J].植物分類與資源學(xué)報(bào),2012,34(6):607-613.

[4]Coghlan ML,Haile J,Houston J,et al.Deep Sequencing of Plant and Animal DNA Contained within Traditional Chinese Medicines Reveals Legality Issues and Health Safety Concerns[J].PLoS Genet, 2012,8(4):e1002657.

[5] Deagle BE,Gales NJ,Evans K,et al.Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces:A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus)[J].PLoS ONE,2007,2(9):e831.

[6] Taberlet P,Coissac E,Pompanon F,et al.Power and limitations of the chloroplast trnL(UAA)intron for plant DNA barcoding[J].Nucleic Acids Res,2007,35(3):e14.

[7] Meusnier I,Singer GA,Landry JF,et al.A universal DNA mini-barcode for biodiversity analysis[J].BMC Genomics,2008,9:214.

[8] Huson DH,Mitra S,Ruscheweyh HJ,et al.Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4[J].Genome Res,2011,21 (9):1552-1560.

[9] Tamura K,Stecher G,Peterson D,et al.MEGA6:Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J].Mol Biol Evol,2013,30 (12):2725-2729.

[10]李天祥,張春艷,李國(guó)輝，等.市場(chǎng)上常見(jiàn)偽劣飲片的鑒別技術(shù)[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(3):171-174.

[11]張春艷,李國(guó)輝,李慶和，等.市場(chǎng)上常見(jiàn)偽劣飲片品種的歸類分析[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(6):365-368.

[12]金 鑫,高元祥.冬蟲夏草及其偽劣商品的鑒別[J].天津中醫(yī)藥, 2005,22(4):337-338.

[13]申 琳,鄒愛(ài)英,孟慶安.蛤蚧的辨析 [J].天津中醫(yī)藥,2010,27 (6):518-519.

[14]王富麗.牛黃的真?zhèn)舞b定[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,19(4):46.

[15]王富麗.麝香的真?zhèn)舞b定 [J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,20(3): 47-48.

[16]何 靜.甘肅虻科（雙翅目）研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[17]李軍德,黃璐琦,陳 敏,等.中藥虻蟲研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(8):228-230.

[18]李軍德,黃璐琦,唐仕歡等.《中國(guó)藥典》2010年版一部部分動(dòng)物藥材來(lái)源探討[J].中國(guó)中藥雜志,2010,56(16):2052-2056.

[19]張鐵軍,高山林,王文燕,等.物種概念及其在中藥研究中的作用和意義[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2004,6(3):1-7.

[20]程新瑋,趙煥新,寧 康,等.DNA條形碼技術(shù)在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的研究進(jìn)展[J].食品與藥品,2013,23(4):295-299.

[21]晁 志,慈 薇,顏 剛，等.建立對(duì)生藥進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定和全面質(zhì)量評(píng)價(jià)的二元條形碼系統(tǒng)[J].世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化）, 2009,11(1):64-70.

The origin identification of Chinese traditional medicine Dahuang Zhechong pill based on metabarcoding method

TIAN Xiao-xuan,LIU Jie,DOU Yong-jie,ZHAO Ya-nan,LV Chao-geng,ZHANG Chun-hui,ZHU Yan
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the ability of metabarcoding technology as one kind of identification tool for the origin of Chinese traditional patent medicine.[Methods]The DNA of TCM Dahuang Zhechong pill was extracted by paramagnetic particle method,and the 16S,trnL and Mini-barcode fragments were amplified by real-time PCR.The products of PCR were cloned and sequenced.After BLASTn alignment,the sequences were parsed into taxonomic term by MEGAN.The sequences representing TCM Mengchong were analysed by MEGA.[Results]The TCM Qicao,Mengchong,licorice and Peach Seed&Bitter Apricot Seed were identified from 23 sequences.Three groups of individuals with significant genetic differences were identified from 6 sequences that representing TCM Mengchong.[Conclusion]Metabarcoding technology could be used for component identification of Chinese traditional patent medicine and should be an useful tool for quality evaluation of Chinese traditional patent medicine.

Chinese traditional patent medicine;Dahuang Zhechong pill;metabarcoding;taxonomy assignment;genetic analysis

R284.1

：A

：1672-1519（2014）04-0234-04

2014-01-20）

（本文編輯：高 杉，馬 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202874），高等教育博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20121210120006），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAI29B01）。

田曉軒（1982-），男，博士，助理研究員，主要從事動(dòng)物類中藥資源與鑒定研究。

朱 彥，Email:yanzhu.harvard@gmail.com