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    乙酰唑胺對低氧應(yīng)激下SD 大鼠肺泡膜通透性的影響

    2022-06-09 05:30:54杜忠蕾MuhammadShoaibTahir馬倩倩朱沁芳劉美恒
    關(guān)鍵詞:肺水腫通透性右肺

    杜忠蕾,Muhammad Shoaib Tahir,高 源,馬倩倩,朱沁芳,劉 杰,劉美恒,張 歡,張 偉

    1 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,青海西寧 810001;2 高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,青海西寧 810001;3 黑龍江省牡丹江市第二人民醫(yī)院,黑龍江牡丹江 157000;4 江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院,江蘇淮安 223300

    急進高原后,面對突然的低壓低氧環(huán)境,機體可產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),反應(yīng)的失衡易發(fā)生急性高原病(acute mountain sickness,AMS)[1-2]。高原肺水腫(high altitude pulmonary edema,HAPE)是一種威脅急進高原人群生命健康的重癥AMS。HAPE主要是由于肺動脈血管不均勻收縮導(dǎo)致肺循環(huán)壓力增加而引起的一種非心源性水腫[3-4],至今HAPE 發(fā)生機制不明確。水通道蛋白(aquaporin,AQP)中AQP1、AQP5 作為肺泡毛細血管膜上的主要水通道蛋白,為肺泡與毛細血管之間的水份運輸提供了主要途徑,在肺內(nèi)液體清除中起到了關(guān)鍵作用[5-7]。二者表達的變化會影響肺泡膜的通透性,在HAPE 的發(fā)病中起著一定的促進作用。國外學(xué)者一直認為乙酰唑胺(acetazolamide,AZ)是預(yù)防AMS 的首選藥[8]。但到目前為止,AZ 預(yù)防HAPE 的具體機制尚不清楚,本課題擬通過構(gòu)建HAPE 動物模型,探討AZ 在低氧應(yīng)激下對大鼠肺泡膜通透性的影響。

    材料與方法

    1 主要材料及儀器 乙酰唑胺粉劑(RS-Sigma,A6011-25G);HE 染色試劑盒(Solarbio,G1120);Anti-Aquaporin 1(Abcam,ab65837);Anti-Aquaporin 5 (Abcam,ab78486);Rat IL-6 ELISA Set (Bdbiosciences,Cat.No.550319);2-step plus Poly-HRP Anti Rabbit IgG Detection System (Elabscience E-IR-R215),實驗動物低壓模擬艙(西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司,型號:HCPⅢD800),手持式血液分析儀(Flextronics 公司,300-G),血氣生化多項測試卡片(美國雅培床旁監(jiān)護有限公司,N20319),酶聯(lián)免疫檢測儀(帝肯上海貿(mào)易有限公司,Infinite M200 PRO)、石蠟切片機(德國萊卡儀器有限公司,LEICA RM2235)、光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司),實時熒光定量PCR 儀(Bio-rad,CFX96)。

    2 實驗動物及造模 由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購入健康雄性SD 大鼠(6~8 周齡,體質(zhì)量199.60±8.27 g),許可證號:SCXK(京)2019-0004。所有大鼠置于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房通風(fēng)櫥中飼養(yǎng)(室溫20℃~23℃,相對濕度40%~45%,晝夜交替;自由攝取標(biāo)準(zhǔn)維持顆粒飼料和水)。本課題組的前期研究及相關(guān)文獻表明,在模擬海拔7 000 m 缺氧暴露2 d 肺水腫持續(xù)發(fā)展[9-10]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后按照不同處理方式分為4 組,每組12 只:對照組(CN 組,海拔2 260 m)、低氧組(H7K 組,海拔7 000 m)、乙酰唑胺組(NAZ 組,海拔2 260 m)、低 氧+乙酰唑胺組(HAZ 組,海拔7 000 m)。NAZ 組與CN 組置于西寧海拔2 260 m(大 氣 壓574 mmHg,PO2120.1 mmHg;1 mmHg=0.133 kPa);NAZ 組、CN 組分別給予1%AZ (50 mg/kg)、0.9%氯化 鈉注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid,5 d)。HAZ 組與H7K 組置于模擬海拔7 000 m 的低壓氧艙中2 d(大氣壓305 mmHg,PO263.7 mmHg);HAZ、H7K 組分別給予1% AZ(50 mg/kg)、0.9%氯化鈉注射液(45 mg/kg)灌胃(Bid,入艙前3 d 和艙內(nèi)2 d)。4 組大鼠均灌胃5 d后取材。

    3 動脈血氣測定 每組大鼠12 只造模結(jié)束后,予20%烏拉坦注射液0.7 mL/100 g,腹腔注射,麻醉成功后將動物仰臥固定,打開腹腔,腹主動脈取血0.2 mL 立即測動脈血氣。

    4 測定血清中白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)濃度 每組大鼠12 只,抽取腹主動脈血液約8 mL,靜置2 h 后離心(3 000 r/min,10 min),留取血清,采用ELISA 法檢測血清中IL-6、TNF-α 濃度。

    5 測定大鼠的肺組織含水量 采血結(jié)束后,每組取6 只大鼠,打開胸腔,暴露并分離取出肺組織。取少量左肺下葉4%多聚甲醛固定,剩余左肺組織-80℃冰箱凍存后用于其他指標(biāo)檢測。右側(cè)肺葉吸干表面水分后用精密電子天平快速稱量,計為濕重(W),將右肺組織置80℃恒溫烤箱,干燥72 h 直至恒干重(平均稱重誤差<0.002 g)后再稱量,計為干重(D),計算右肺組織濕重與干重質(zhì)量比值(W/D),表示肺組織水腫情況。

    6 測定支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中IL-6、TNF-α 含量 每組剩余6 只大鼠,結(jié)扎左側(cè)支氣管并留存左肺組織(處理同上)。在氣管分叉處插入氣管插管,用預(yù)冷滅菌的0.9%氯化鈉注射液緩慢灌洗右肺,每次2 mL,重復(fù)3 次,回收后混勻,回收率>60%,離心(1 500 r/min,15 min)取上清,ELISA 法測定BALF中IL-6、TNF-α 濃度。

    7 qRT-PCR方法檢測肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 的相對含量 從-80℃冰箱中提前取出已凍存的大鼠左肺組織(每組12 只),并稱量約0.1 g,按Trizol 試劑說明提取肺組織的總RNA 并測得OD 值,根據(jù)PCR 反應(yīng)試劑盒的操作流程逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),采用CFX96 實時熒光定量PCR 儀進行三步法擴增檢測各組AQP1、AQP5 mRNA 表達量。實驗所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法進行相對定量分析。qRTPCR 引物(恒碩生物工程股份有限公司合成)序列5'-3',AQP1-F:AAGCCATGTTTGGCCACTTCA;AQP1-R:GGCCCTTAGCCATTGTCCAG;AQP5-F:CCATGGTGGTGGAGTTAATCTTGA;AQP5-R:CATGGAACAGCCGGTGAAGTAG;Actin-F:CCTAAGGCCAACCGTGAAAA;Actin-R:CAGA GGCATACAGGGACAACAC。

    8 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化 各組肺組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定2 d 后石蠟包埋并切片(厚度為5 μm),HE 染色、固定,于Olympus 光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

    9 免疫組化觀察肺組織中AQP1、AQP5 的表達左肺組織標(biāo)本經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后,脫蠟、水化組織切片并進行抗原熱修復(fù),用0.lmol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)稀 釋AQP1(1∶400)和AQP5(1∶200)一抗并孵育后,再按照二步法免疫組化試劑盒的使用步驟進行操作,封片后使用Olympus 光學(xué)顯微鏡觀察,攝片,細胞膜上出現(xiàn)黃、棕色為陽性細胞。

    10 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS27.0進行分析,計量資料以±s表示,各組間的數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD 法。以雙側(cè)α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)。

    結(jié)果

    1 大鼠動脈血氣分析 各組大鼠造模結(jié)束后通過腹主動脈采集動脈血進行血氣分析對比,結(jié)果顯示,與CN 組比較,NAZ 組、H7K 組和HAZ 組的大鼠動脈血pH 值下降(P<0.05);H7K 組的大鼠動脈血PaO2明顯降低(P<0.05),而HAZ 組PaO2得到改善(P<0.05)。見表1。

    表1 大鼠動脈血氣分析結(jié)果Tab.1 The arterial blood gas testing results of rats

    2 肺組織含水量:W/D 比值的結(jié)果分析 H7K 組右肺W/D 比值高于CN 組(P<0.05)。與H7K 組比較,HAZ 組的W/D 比值降低(P<0.05)。見圖1。

    圖1 采用濕/干重比測定各實驗組大鼠的肺組織含水量(aP<0.05,vs CN 組;bP<0.05,vs NAZ 組;cP<0.05,vs H7K 組)Fig.1 The lung water content of rats in different experimental groups was measured using the wet/dry weight ratio(aP<0.05,vs CN group;bP<0.05,vs NAZ group;cP<0.05,vs H7K group)

    3 ELISA 檢測BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量變化 與CN 組相比較,H7K 組的大鼠血清及BALF 中IL-6、TNF-α 的 含 量均升高(P<0.05)。HAZ 組IL-6 的含量較H7K 組降低(P<0.05)。H7K 組與HAZ 組BALF 中TNF-α含量無統(tǒng)計學(xué)差異。見圖2、圖3。

    圖2 ELISA 法檢測BALF 中IL-6 和TNF-α 濃度(aP<0.05,vs CN 組;bP<0.05,vs NAZ 組;cP<0.05,vs H7K 組)Fig.2 The concentration of IL-6 and TNF-α in BALF were determined by ELISA (aP<0.05,vs CN group;bP<0.05,vs NAZ group;cP<0.05,vs H7K group)

    圖3 ELISA 法檢測血清中IL-6 和TNF-α 的濃度(aP<0.05,vs CN 組;bP<0.05,vs NAZ 組;cP<0.05,vs H7K 組)Fig.3 The concentration of IL-6 and TNF-α in the serum were determined by ELISA (aP<0.05,vs CN group;bP<0.05,vs NAZ group;cP<0.05,vs H7K group)

    4 qRT-PCR 檢測肺組織中AQP1、AQP5 mRNA的相對含量 與CN 組相比,H7K 組的肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 表達量明顯增加(P<0.05);與H7K 相比,給予乙酰唑胺預(yù)處理的HAZ 組,肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 表達量降低(P<0.05)。見圖4。

    圖4 各組大鼠左肺組織AQP1、AQP5 mRNA 表達水平(aP<0.05,vs CN 組;bP<0.05,vs NAZ 組;cP<0.05,vs H7K 組)Fig.4 mRNA expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues(aP<0.05,vs CN group;bP<0.05,vs NAZ group;cP<0.05,vs H7K group)

    5 各組肺組織HE 染色的形態(tài)學(xué)觀察 CN 組及NAZ 組肺泡腔清晰,肺泡間隔未增寬、肺泡腔內(nèi)無出血;與CN 組比較,暴露在低氧2 d 的H7K組肺泡上皮細胞明顯腫脹,肺泡間隔增寬伴有炎細胞浸潤,肺間質(zhì)水腫;與H7K 組比,HAZ 組肺間質(zhì)水腫和炎細胞浸潤均有所減輕。如圖5。

    圖5 SD 大鼠的肺組織HE 染色圖(40×;紅色箭頭指示肺間隔增寬、內(nèi)皮細胞腫脹等情況)Fig.5 HE staining of lung tissue sections of SD rats (40×;red arrows indicate widening of lung septa,swelling of endothelial cells,and so on)

    6 肺組織中AQP1、AQP5 蛋白表達免疫組化 檢測出細胞膜上出現(xiàn)黃、棕色染色為陽性細胞。光鏡觀察:CN 組的肺組織切片可見部分血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞染色呈黃棕色。H7K 組肺泡膜上的上皮細胞棕黃色顆粒較CN 組增加。HAZ 組AQP1 和AQP5 陽性表達低于H7K 組(P<0.05)(圖6A)。在每組切片中隨機取6 個視野,使用ImageJ 軟件測得IOD 值進行數(shù)據(jù)分析。H7K 組IOD 值高于CN 組、NAZ 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);應(yīng)用乙酰唑胺的HAZ 組IOD 值較H7K 組降低且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖6B)。

    圖6 肺組織中AQP1 和AQP5 的表達(免疫組化法。aP<0.05,vs CN 組;bP<0.05,vs NAZ 組;cP<0.05,vs H7K 組) A:顯微鏡下觀察(40×);B:各組AQP1 和AQP5 IOD 數(shù)值Fig.6 Expression levels of AQP1 and AQP5 in lung tissues of rats (immunohistochemical methods.aP<0.05,vs CN group;bP<0.05,vs NAZ group;cP<0.05 vs H7K group) A:microscopic observation (40×);B:AQP1 and AQP5 IOD values in each group

    討論

    本研究探討了乙酰唑胺對低氧應(yīng)激下SD 大鼠肺泡膜通透性的影響,結(jié)果顯示在模擬海拔7 000 m(305 mmHg,PO263.7 mmHg)的低壓氧艙中持續(xù)2 d 低氧暴露后,SD 大鼠動脈血PaO2下降,肺組織病理切片可見肺間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤,肺組織W/D 升高。通過以上指標(biāo)與組織學(xué)分析,可以判斷H7K 組的肺組織出現(xiàn)了典型的間質(zhì)性肺水腫,肺水含量顯著增加,提示大鼠HAPE模型成功建立。

    HAPE 是與高原低氧有關(guān)的致死性高原病,HAPE 的發(fā)生取決于海拔高度的易感性[11]。其主要的病理生理改變是非心源性肺水腫,高原低氧引起肺動脈高壓過度灌注以及局部肺血管不均勻收縮導(dǎo)致血管滲漏[12]。低氧應(yīng)激引起肺泡膜通透性發(fā)生改變,降低了肺泡液體清除率,導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體聚積,已經(jīng)被認為是HAPE 發(fā)病的病理生理學(xué)機制[13]。大量液體進入肺間質(zhì),致肺泡上皮細胞出現(xiàn)主動重吸收功能障礙,使肺泡內(nèi)液體過度積聚,最終發(fā)生HAPE[14]。減輕肺水腫是改善高原肺水腫預(yù)后的重要治療靶點,應(yīng)用藥物防治仍是首選[15]。

    pH、PaCO2、PaO2和HCO3-是判斷血氧和酸堿平衡的常用指標(biāo)。本實驗通過低壓氧艙模擬急性低氧的大鼠模型,各組大鼠進行動脈血氣對比顯示H7K 組的大鼠動脈血pH、PaO2及HCO3-水平較CN 組降低,缺氧引起肺通氣量增加以維持肺泡PaO2水平,而過度通氣會進一步導(dǎo)致PaCO2急劇下降[16],與國內(nèi)一些學(xué)者研究結(jié)果一致[17]。有研究認為,AZ 作為強效碳酸酐酶抑制劑,通過減少腎小管回收HCO3-,增加腎排泄碳酸氫鹽,引起代謝性酸中毒,進而使肺泡通氣量增加,提高動脈血氧含量[18-19],并能抑制缺氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及肺血管收縮,降低肺動脈壓[20]。本實驗結(jié)果表明AZ 對模擬海拔7000m 低氧2d 的大鼠PaO2有所改善。

    肺含水量是肺水腫嚴(yán)重程度的指標(biāo)。濕干重法與肺水腫輕重程度呈正相關(guān)[21]。本實驗中H7K組的大鼠與CN 組相比,其右肺W/D 比值增高(P<0.05)。實驗結(jié)果與Lee 等[22]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,預(yù)防應(yīng)用AZ 的HAZ 組右肺W/D較H7K 組降低。這說明AZ 可明顯改善肺水腫。

    炎癥反應(yīng)在高海拔疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[18,23]。低氧應(yīng)激過程中可誘發(fā)肺組織發(fā)生非細菌性炎性反應(yīng)、激活肺泡巨噬細胞等炎癥細胞,促進IL-6、TNF-α 等炎癥介質(zhì)釋放,造成肺泡膜的損傷并使之通透性增高[24]。本實驗中H7K 組的大鼠BALF 及血清中IL-6、TNF-α水平較CN 組升高,HAZ 組的大鼠BALF 及血清中TNF-α、IL-6 水平較H7K 組降低,說明AZ 在抑制炎癥連鎖反應(yīng)方面有一定效果。

    AQP 是位于細胞膜上的一組選擇性水通道蛋白。相關(guān)研究表明,AQP1 和AQP5 作為肺組織中主要的水通道蛋白,是通過肺毛細血管內(nèi)皮和肺泡上皮進行水份運輸?shù)闹饕緩絒25]。AQP1 主要表達在肺毛細血管內(nèi)皮上,AQP5 主要分布于Ⅰ型肺泡上皮細胞,二者的表達量變化與肺內(nèi)液體清除能力密切相關(guān)。AQP1、AQP5 的過度表達可使水快速通過肺毛細血管內(nèi)皮及肺泡上皮引起肺間質(zhì)水份增多。B?rtsch 等[26]報道炎癥因子可能在細胞模型中促進AQP 的表達。水通道蛋白的調(diào)控可能使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的活化增加并在低氧的環(huán)境下表達上調(diào)。在本實驗中模擬海拔7 000 m 環(huán)境下2 d 大鼠的肺組織中AQP1、AQP5 mRNA 及蛋白表達水平顯著增加,這與Wang 等[5]的研究一致。AZ 作為一個經(jīng)典藥物,常用于青光眼的治療,通過減少房水的產(chǎn)生而降低眼壓,也有抗炎作用。AZ 與AQP 有著密切的關(guān)系,已經(jīng)證明其通過與AQP1 相互作用,抑制AQP1 的表達從而減少水滲透[27-28]。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)HAZ 組的肺組織中AQP1 和AQP5 均較H7K 組有所下降。AZ 通過減少肺泡膜AQP1、AQP5 的表達,影響肺泡上皮細胞的液體轉(zhuǎn)運和肺水平衡,從而發(fā)揮防治HAPE 的作用。

    綜上所述,動物低壓氧艙模擬海拔7 000 m 環(huán)境下2 d 可使SD 大鼠肺泡膜通透性增加,引起肺水腫,同時伴有BALF 及血清中IL-6、TNF-α 含量增加,肺組織中AQP1、AQP5 表達水平增加。乙酰唑胺預(yù)處理可有效緩解大鼠肺水腫,減輕低氧應(yīng)激下炎癥因子IL-6、TNF-α 的釋放及肺組織中AQP1、AQP5 的表達,降低低氧應(yīng)激下大鼠肺泡膜通透性。然而,本實驗的樣本量少且存在一定的局限性,未來可能通過靶向調(diào)節(jié)AQP1、AQP5的表達來深入研究HAPE 的具體分子機制,發(fā)現(xiàn)更有效的防治藥物。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

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