毛竹硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白家族PeNPFs基因鑒定及其表達特性分析

袁婷婷，朱成磊，楊克彬，宋新章，高志民＊

(1. 國際竹藤中心竹藤資源基因科學(xué)與基因產(chǎn)業(yè)化研究所，國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，北京 100102；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300)

氮是影響植物生長發(fā)育的重要礦質(zhì)營養(yǎng)元素，也是葉綠體、核酸、蛋白質(zhì)以及很多次生代謝產(chǎn)物的重要組成成分[1]。大多數(shù)陸生植物以硝態(tài)氮作為主要氮源，并以主動運輸?shù)姆绞綇耐獠凯h(huán)境吸收硝態(tài)氮，運輸?shù)狡渌M織器官中，供植物生長發(fā)育[2]。植物體內(nèi)的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運體( NRTs)負責(zé)從土壤中吸收硝態(tài)氮、植物體內(nèi)硝態(tài)氮的運輸和細胞內(nèi)硝態(tài)氮再分配，如NRT1、NRT2和NRT3等[3-4]。植物在進化過程中形成2類不同的轉(zhuǎn)運蛋白，即高親和力轉(zhuǎn)運蛋白/系統(tǒng)( HATS)和低親和力轉(zhuǎn)運蛋白/系統(tǒng)(LATS)，它們又分別分為組成型(cHATS和cLATS)和誘導(dǎo)型(iHATS和iLATS)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtNRT1.1(CHL1)是高等植物中第1個被克隆的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因，它的突變導(dǎo)致硝態(tài)氮的吸收減少[5]，之后又在水稻(Oryza sativaL.)、玉米(Zea maysL.)和小麥(Triticum aestivumL.)中獲得了多種同源基因[6-8]。由于NRT1和PTR (Peptide transporter)成員序列同源性高，且能轉(zhuǎn)運種類廣泛的底物，它們被統(tǒng)一命名為NRT1/PTR FAMILY，即NPF家族[9]。

植物NPF蛋白可運輸硝態(tài)氮、多肽和脫落酸(ABA)等多種底物，是一個功能廣泛的家族，可分為8個亞家族[9-10]。研究表明，在擬南芥中AtNPF4.6負責(zé)硝態(tài)氮的吸收，它是一個組成型表達的低親和轉(zhuǎn)運蛋白，也可轉(zhuǎn)運ABA；AtNPF7.3介導(dǎo)硝態(tài)氮的木質(zhì)部裝載[11]；AtNPF1.2的作用是負責(zé)木質(zhì)部到韌皮部的轉(zhuǎn)移，將硝酸鹽重新分配到正在發(fā)育的葉片中[12]。水稻NPF8.9負責(zé)硝酸鹽的吸收，有2個不同剪接形式的轉(zhuǎn)錄本(NPF8.9a和NPF8.9b)，它們過表達可增加植株地上干質(zhì)量；OsNPF6.5作用于硝態(tài)氮的吸收和地上地下硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)運[13]。玉米中ZmNPF6.6是一個高親和硝酸鹽特異轉(zhuǎn)運蛋白，而ZmNPF6.4是一個低親和轉(zhuǎn)運蛋白，同時具有轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出硝酸鹽的雙向轉(zhuǎn)運活性[14]。NPF廣泛存在于多種植物中，且成員眾多，如擬南芥NPF家族有53個成員，水稻NPF家族有93個成員[13]，之后在黃瓜(Cucumis sativusL.)、毛果楊(Populus trichocarpaTorr. & Gray)、蘋果(Malus domesticaBorkh.)、甘蔗(Saccharum officinarumL.)中相繼鑒定了多個NPF成員[15-18]，而竹子中NPFs的相關(guān)研究尚屬空白。

竹子是禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，其中，毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière) J.Houz.)是最具特色的竹種之一，具有生長快、材性好、筍材兩用、固碳能力強等特點[19-20]。速生的特點，使得毛竹必須從外界吸收大量的氮素供其快速生長所需[21]，因此，生產(chǎn)中毛竹林施用氮肥非常普遍。在一定范圍內(nèi)(250 kg·hm-2)，隨著氮肥施用量增加，毛竹冬筍、春筍和竹材的產(chǎn)量均呈增加的趨勢[22]；然而，毛竹如何吸收利用氮素仍不清楚，其分子調(diào)節(jié)機制及對外界脅迫的響應(yīng)機制等均有待深入研究。NPF家族成員為氮素的重要運輸者，因此，開展毛竹NPF基因的鑒定與表達模式研究對于揭示其功能具有重要意義。本研究以毛竹為研究對象，利用已有基因組數(shù)據(jù)[23]對其中NPF家族基因成員進行全面分析，包括基因啟動子、基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化等，并利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析NPF基因的組織表達特異性，以及非生物脅迫冷和干旱處理、激素GA3和NAA處理后的表達模式，以期為深入研究毛竹中NPF基因的功能奠定基礎(chǔ)，為探索毛竹快速生長發(fā)育期的氮素吸收利用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毛竹NPF基因序列獲取

分別從 Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)和Tair (https://www.arabidopsis.org/index.jsp)數(shù)據(jù)庫下載水稻和擬南芥NPF基因的CDS和氨基酸序列，作為誘餌序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫BambooGDB (http://bamboo.bamboogdb.org/)中進行BlastP、BlastN (e-value=1e-10)比對，查找并獲取其中NPF同源基因的候選序列。對獲得的候選序列基于SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de)和PFAM數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org)逐條進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的鑒定和分析，僅保留具有編碼完整保守結(jié)構(gòu)域的序列，并進行基因命名(PeNPFs)。

1.2 基于NPF同源序列的系統(tǒng)進化分析

為分析毛竹NPF成員的進化關(guān)系，預(yù)測其潛在的功能，使用MEGA 7.0軟件的Clustal W功能對毛竹、水稻和擬南芥的NPF蛋白序列進行同源比對分析，使用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，bootstrap試驗重復(fù)1 000次[24]，其它參數(shù)設(shè)置為默認值。

1.3 毛竹NPF基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白序列分析

使用Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線工具繪制PeNPFs的基因結(jié)構(gòu)圖，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線平臺分析其啟動子序列所含作用元件，用ProtParam (http://web.expasy.org/prot-param/)對毛竹NPF基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化特性進行分析，使用MEME Version 5.1.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)分析毛竹NPF蛋白的保守基序，使用Plant-mPLoc算法(http://www.csbio.sjtu.edu.cn)預(yù)測PeNPFs的亞細胞位置。

1.4 組織表達特異性分析

依據(jù)本實驗室前期毛竹7個不同組織(葉、早花期花序、盛花期花序、根、鞭、20 cm筍和50 cm筍)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[23]，用不同組織中NPF基因的RPKM (Reads Per Kilo-bases Per Million Reads)值表示基因的表達豐度，為有效地可視化展示基因表達量，對RPKM的值取以2為底的對數(shù)即Log2(RPKM)作為基因的表達量[25]。采用TBtools的熱圖工具[26]制作熱圖展示基因的表達情況，顏色由藍色到紅色逐步變化表示基因的表達豐度數(shù)值遞增。

1.5 獲得不同脅迫與激素處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

根據(jù)文獻查找，從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載獲取毛竹非生物脅迫和激素處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。冷和干旱處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)源自2年生毛竹，5株的離體枝條分別進行冷(0℃和無光條件)和干旱(20℃和相對濕度50%條件)處理2 h后，每個處理分別選取10片未展葉進行轉(zhuǎn)錄組測序，其RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號為SRS-1759772[27]；GA3處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均源自毛竹實生苗，1個月的毛竹實生苗分別用水和100 μmol·L-1的GA3噴灑處理后4 h取整株進行轉(zhuǎn)錄組測序，其對照和處理的RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號分別為SRS256-6465～SRS2566467、SRS2566468～SRS2566470[28]；NAA處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)均源自1個月的毛竹實生苗，用5 μmol·L-1的NAA噴灑處理，間隔1 h處理1次，4 h后取根系進行轉(zhuǎn)錄組測序，其對照和處理的RNA-seq數(shù)據(jù)登錄號分別為SRS2294012～SRS2294014、SRS2294015～SRS2294017[29]；上述處理取樣時均采用3次生物學(xué)重復(fù)。從這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因注釋中比對查找，篩選出對應(yīng)毛竹NPF基因的FPKM值，用于表達分析。

1.6 不同處理后基因的表達模式分析

利用獲取的冷、干旱、GA3和NAA處理毛竹及其對照中NPF基因的FPKM值，比較分析處理前后的基因表達變化情況。為有效地可視化展示基因表達量，用FPKM+1的值取以2為底的對數(shù)即Log2(FPKM+1)作為基因的表達量[30]。對所有表達量數(shù)據(jù)用TBtools軟件繪制表達譜熱圖，分析不同基因的表達情況，同時基于基因FPKM值對具有顯著差異(p＜ 0.05)表達的基因繪制點線圖。

2 結(jié)果分析

2.1 毛竹NPF家族基因成員鑒定與系統(tǒng)進化分析

植物NPF蛋白通常含有PTR2保守結(jié)構(gòu)域，通過比對分析，在毛竹基因組中共鑒定到具有編碼完整PTR2的候選基因27個，其編碼蛋白均含有保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，符合MFS (Major Facilitator Superfamily)超家族的NPF家族的特征[31]。根據(jù)候選基因在毛竹Scaffold中的位置以及同源基因的名稱，依次命名為：PeNPF1.1～PeNPF8.8。

為確定PeNPFs與其它物種中已鑒定的NPF蛋白之間的進化關(guān)系，預(yù)測其潛在功能，對毛竹、水稻和擬南芥NPF的氨基酸序列進行了多重序列比對，并利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明：所有毛竹、水稻和擬南芥的NPFs被聚類到8個亞家族(S1～S8)，PeNPFs成員分布在除S3之外的其它7個亞家族中，每個亞家族中成員數(shù)量不等，其中，亞家族S1、S4、S6分別只有1個成員，S8中的成員最多為8個，其余亞家族分別有3～7個成員不等(圖1)。

圖1 基于毛竹、水稻和擬南芥NPF氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on amino acid sequence of NPFs from moso bamboo, rice and Arabidopsis

進一步分析發(fā)現(xiàn)，PeNPFs半數(shù)成員被聚類在S7 (7個)和S8 (8個)亞家族，而雙子葉植物擬南芥在這2個亞家族的成員分別只有3個和5個，在S5亞家族中，水稻和擬南芥NPF成員分別達到17個和16個，但僅包含6個毛竹成員。雖然NPF家族成員在功能上具有相似性，但不同亞家族成員在功能上也存在一定的差異，如AtNPF1.1和AtNPF1.2負責(zé)硝酸鹽向嫩葉的分配[32]，而OsNPF 2.4主要在表皮、木質(zhì)部薄壁細胞和韌皮部的伴胞中表達[33]。另外，所有PeNPFs均優(yōu)先與水稻NPF聚類在一起，說明在功能上PeNPFs或許與水稻等單子葉植物的同源基因相似。

2.2 PeNPFs基因結(jié)構(gòu)及啟動子分析

基因結(jié)構(gòu)分析表明，PeNPFs均有內(nèi)含子，數(shù)量為2～5個，單個內(nèi)含子在基因組上的跨度為33 bp(PeNPF7.6的第5個內(nèi)含子)～3 489 bp (PeNPF2.2的第2個內(nèi)含子)，而單個外顯子在基因組上的跨度為36 bp (PeNPF7.3的第1個外顯子)～1 601 bp(PeNPF7.3第3個外顯子) (圖2)。PeNPFs各個成員之間的內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量以及所在的位置存在一定的差異，這可能是影響其轉(zhuǎn)錄表達的主要原因之一。

圖2 PeNPFs基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of PeNPFs

為更好地了解PeNPFs對外界環(huán)境的響應(yīng)和受內(nèi)在調(diào)控因子調(diào)節(jié)的情況，對PeNPFs的起始密碼子ATG上游2 000 bp的序列所含順式作用元件和應(yīng)答元件進行分析。結(jié)果表明：所有序列中均含有啟動子必需的核心元件TATA-box和CAAT-box。27個PeNPFs的啟動子序列中均包含多種參與基因表達調(diào)控的順式作用元件和外界刺激的應(yīng)答元件，如低溫響應(yīng)元件LTR，干旱響應(yīng)元件MBS和TCrich repeats，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box、P-box和GARE-motif，生長素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core和AuxRE，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，脫落酸響應(yīng)元件ABRE等(圖3)。由此表明，PeNPFs的轉(zhuǎn)錄表達可能會受到非生物脅迫和激素的影響。

圖3 毛竹PeNPFs基因啟動子響應(yīng)元件種類統(tǒng)計Fig.3 Statistics of response elements in the promoter of PeNPFs

2.3 PeNPFs的保守基序分析

保守基序分析表明：在毛竹PeNPFs序列中共獲得10個保守基序，分別命名為motif 1～motif 10，其中，motif 1、motif 2和motif 4是27個PeNPFs共有的高度保守基序，而其它基序則在部分序列中缺失。27個PeNPFs中有15個成員含有10個motif，其它12個成員缺失1～3個motif，如PeNPF2.1、PeNPF4.1和PeNPF8.8缺少motif 3，PeNPF8.2缺少motif 5，PeNPF2.1缺少motif 6，PeNPF2.1、PeNPF7.5、PeNPF7.7、PeNPF8.2、PeNPF8.3和PeNPF8.8缺 少motif 7，PeNPF5.2、PeNPF5.5缺少motif 8，PeNPF7.6缺少motif 9，PeNPF5.1、PeNPF5.2、PeNPF5.3、PeNPF5.5缺 少motif 10(圖4A)。

另外，各motif在氨基酸組成的偏好性方面有一定相似性，如motif 1、motif 2和motif 4高度保守，均富含疏水性氨基酸，但各motif在氨基酸組成的偏好性方面也存在一定的差異，如motif 1富含亮氨酸，motif 2富含絲氨酸，motif 4富含甘氨酸(圖4B)。

2.4 編碼蛋白理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

PeNPFs編碼氨基酸序列最長的為761 aa(PeNPF7.4)，最短的為452 aa (PeNPF8.8)，蛋白分子量介于49.56～82.08 kDa之間，理論等電點介于5.17～9.85之間，大部分是中性或堿性蛋白。親疏水性分析顯示，PeNPFs的親水性值(GRAVY)為0.063～0.607，推測它們屬于親水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測顯示，所有PeNPFs均定位于細胞膜或液泡中，其中，有8個成員在細胞膜和液泡中均有定位(表1)。

表1 PeNPFs編碼蛋白的基本特征Table 1 Basic characteristics of the proteins encoded by PeNPFs

2.5 PeNPFs的組織表達模式分析

利用毛竹7個不同組織的轉(zhuǎn)錄組測序(RNASeq)表達譜數(shù)據(jù)，對PeNPFs的組織表達特異性進行分析。結(jié)果(圖5)表明：在不同組織中，PeNPFs表達模式存在一定差異，其中，PeNPF5.3和PeNPF7.6在7個組織中均檢測到表達，且在7個組織中的表達量變化不大，呈組成型表達模式，它們可能與毛竹整個生長發(fā)育過程密切相關(guān)；而其它PeNPFs成員至少在1個組織中檢測到表達，但各成員的表達豐度差異較大，如在葉片中PeNPF2.3、PeNPF7.5、PeNPF7.7和PeNPF8.7的表達豐度較高；PeNPF-2.1、PeNPF5.6、PeNPF6.1、PeNPF7.1、PeNPF7.2和PeNPF8.2在早花期花序中表達豐度較高；PeNPF-1.1、PeNPF5.2、PeNPF5.6、PeNPF6.1和PeNPF8.1在盛花期花序中表達豐度較高。一些PeNPFs成員表現(xiàn)出組織特異性，如PeNPF4.1主要在竹鞭中表達；PeNPF5.1和PeNPF7.4主要在根中表達；PeNPF8.8主要在20 cm和50 cm高度筍中表達。PeNPFs在葉、花序、鞭和根等不同組織中的表達差異，表明它們在這些組織的生長發(fā)育中發(fā)揮著不同的功能。

圖5 PeNPFs在毛竹7個組織中的表達分析Fig.5 Expression analysis of PeNPFs in seven tissues of moso bamboo

2.6 毛竹PeNPFs響應(yīng)非生物脅迫和激素脅迫的表達分析

啟動子調(diào)控元件分析表明：PeNPFs的表達可能會受到逆境脅迫的影響，因此，本文利用已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對冷和干旱處理下毛竹葉片中PeNPFs的表達進行分析。結(jié)果表明：在冷和干旱處理的毛竹葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了18個PeNPFs的FPKM值，進一步分析發(fā)現(xiàn)它們的表達存在著一定的差異。與處理前(CK)相比，冷處理2 h后共有9個PeNPFs呈下調(diào)表達趨勢，9個PeNPFs呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢(圖6A)；其中，下調(diào)表達的基因中有6個(PeNPF2.3、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.2、PeNPF7.3和PeNPF8.7)呈顯著下調(diào)(p＜ 0.05)，而在上調(diào)表達的基因中僅有3個基因(PeNPF5.2、PeNPF7.1和PeNPF8.1)表現(xiàn)為顯著上調(diào)(p＜ 0.05) (圖6B)。在干旱處理2 h后共有15個基因呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢，僅有3個基因呈現(xiàn)上調(diào)表達趨勢(圖6C)；其中下調(diào)表達的基因中有6個(PeNPF5.3、PeNPF7.2、PeNPF7.3、PeNPF8.1、PeNPF8.7和PeNPF8.8)呈現(xiàn)顯著下調(diào)(p＜ 0.05)，而上調(diào)基因的表達差異均不顯著(圖6D)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，4個基因(PeNPF5.3、PeNPF7.2、PeNPF7.3和PeNPF8.7)在冷和干旱處理后均表現(xiàn)出顯著下調(diào)，這與其啟動子序列中存在與低溫和干旱響應(yīng)調(diào)控元件(圖2)相一致，推測它們可能在低溫和干旱響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

圖6 冷和干旱處理下PeNPFs的表達分析Fig.6 Expression analysis of PeNPFs in moso bamboo under cold and drought treatments

另外，NPF基因的表達還受到激素的影響[34]，本文對GA3和NAA處理毛竹幼苗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中PeNPFs基因的表達模式進行分析。結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了18個PeNPFs的FPKM值，分析發(fā)現(xiàn)它們的表達在處理前后存在一定的差異。與處理前(CK)相比，18個PeNPFs在100 μmol·L-1GA3處理4 h后，各有9個基因呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達趨勢(圖7A)，其中，上調(diào)表達的5個基因(PeNPF4.1、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.1和PeNPF7.6)，下調(diào)表達的3個基因(PeNPF2.1、PeNPF5.1和PeNPF7.3)的表達差異顯著(p＜ 0.05)(圖7B)；在5 μmol·L-1NAA處理4 h后，7個基因呈上調(diào)表達趨勢，11個基因呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢(圖7C)，其中，PeNPF7.1和PeNPF7.3表現(xiàn)為顯著上調(diào)，而PeNPF2.2、PeNPF5.2和PeNPF7.6等基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)(p＜ 0.05) (圖7D)。對比分析發(fā)現(xiàn)，PeNPF7.3和PeNPF7.6在2種激素處理后呈相反的表達變化，而PeNPF7.1的表達趨勢相同，推測這些基因在響應(yīng)激素方面可能發(fā)揮著不同的功能。

圖7 GA3和NAA處理下PeNPFs的表達分析Fig.7 Expression analysis of PeNPFs in moso bamboo treated with GA3 and NAA

3 討論

NPF蛋白是MFS超家族中成員數(shù)量最多的家族之一，這些蛋白質(zhì)廣泛分布于真核生物和原核生物中，它對于植物、動物、酵母和細菌的氮代謝具有重要作用。本研究從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中，鑒定到27個NPF成員，這些成員均含有PTR2保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域，這可能是NPF家族成員具有吸收和轉(zhuǎn)運硝態(tài)氮的基礎(chǔ)。同一個亞家族內(nèi)的部分NPF成員間的基因結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)和亞細胞定位高度相似，如PeNPF8.6和PeNPF8.7的序列的相似性為86.83%，氨基酸長度相差3個，相對分子量、亞細胞位置、基因結(jié)構(gòu)、所含保守基序以及在7個組織中的表達模式相似。另外，部分NPF成員的基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細胞定位存在較大差異，如毛竹PeNPF5.1和PeNPF5.4序列的同源性為31.19%，氨基酸長度相差136個，二者的分子量分別為56.96 kDa和71.33 kDa，且二者在7個組織中的表達模式相反，這可能是由于非保守區(qū)的差異造成的，同時各成員序列非保守區(qū)的差異可能導(dǎo)致各個成員的功能具有多樣性[35]。

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中，鑒定了27個PeNPFs成員，分別屬于7個亞家族，但沒有鑒定到S3亞家族成員。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，在其它物種(如水稻)中存在S3亞家族成員，推測本研究中沒有鑒定到S3亞家族成員的原因可能是所用的是毛竹基因組草圖，毛竹可能存在S3亞家族成員，作者將進一步用最新的毛竹基因組進行分析。同時，通過物種進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，聚類在同一個亞家族的成員可能具有相似的功能。在水稻和擬南芥中，S1、S2、S5、S6和S7亞家族成員的主要功能為轉(zhuǎn)運硝態(tài)氮，如OsNPF2.2負責(zé)根到地上部分硝態(tài)氮的運輸[36]，小麥TaNPF6.3負責(zé)硝態(tài)氮的吸收并調(diào)控非根系組織的硝態(tài)氮的分配[37]，AtNPF7.2和AtNPF 7.3分別負責(zé)硝態(tài)氮在木質(zhì)部的卸載和裝載[38]，推測毛竹在這5個分枝的成員可能也具有硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)運功能。另外，研究表明，AtNPF2.4和AtNPF2.5負責(zé)根中Cl-的轉(zhuǎn)運[39]，AtNPF5.2在脅迫條件下可以轉(zhuǎn)運二肽和三肽，AtNPF7.3還具有轉(zhuǎn)運K+的功能[40]，所以，也不排除相同亞家族中毛竹PeNPFs也具有一些其它功能?；蛟诓煌M織的表達模式是基因功能的重要體現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組表達譜表明，PeNPFs在毛竹各組織的功能存在差異，多數(shù)基因在葉片和花序中的表達量較高，在根和筍中的表達量相對較低。3個毛竹NPF基因具有組織特異性，PeNPF1.1只在盛花期花序中表達，PeNPF5.1只在根中表達，PeNPF8.8只在筍中表達，表明它們可能分別在盛花期花序、根以及筍中發(fā)揮著重要作用；而它們分別屬于不同的亞家族，說明各亞家族之間功能有一定的差異。擬南芥S8是小肽轉(zhuǎn)運體，AtNPF8.1和AtNPF8.2能夠轉(zhuǎn)運多肽，同時AtNPF8.3在開花和種子發(fā)育過程中將小肽轉(zhuǎn)出液泡，而毛竹S8成員中多個成員在花序發(fā)育時期的表達量較高，說明它們也可能參與毛竹開花發(fā)育時期小肽的轉(zhuǎn)運。

真核生物基因的表達受到多層次調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子能夠通過與基因的啟動子特定區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達，因此，對基因的啟動子所含的調(diào)控元件進行分析對于基因功能的預(yù)測具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，在PeNPFs中發(fā)現(xiàn)大量與逆境脅迫及激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，這些元件已經(jīng)被證實在植物逆境脅迫[41]及植物生長與果實成熟等方面均發(fā)揮著重要作用。當(dāng)植物受到生物或非生物脅迫時，NPF基因通過上調(diào)或下調(diào)表達發(fā)揮其功能。冷處理后，18個PeNPFs中有9個PeNPFs的表達量發(fā)生了顯著變化(上調(diào)或下調(diào))，說明毛竹在一定程度通過PeNPFs表達量變化來響應(yīng)冷處理；干旱處理后，18個PeNPFs中有15個基因的表達量下調(diào)，其中，6個與處理前差異顯著，這與干旱處理能顯著誘導(dǎo)小麥NPF基因表達量下調(diào)的結(jié)果一致[34]。在GA3處理4 h后18個PeNPFs均發(fā)生變化，其中，PeNPF4.1、PeNPF5.3、PeNPF5.4、PeNPF7.1和PeNPF7.6的表達量顯著上升，推測它們可能受GA3的誘導(dǎo)并通過表達量變化進行響應(yīng)，這與施用GA3能夠增加ZmNRT2.1/2.2的表達水平相似[42]；NAA處理后，毛竹有5個基因發(fā)生顯著上調(diào)或下調(diào)，推測毛竹S7亞家族可能參與毛竹響應(yīng)NAA過程。毛竹中PeNPFs不同成員對GA3和NAA處理呈現(xiàn)不同程度、甚至相反的表達變化，表明各成員功能的差異，這與水稻中OsPTRs在GA3和NAA處理后的表達類似[4]。PeNPFs在毛竹中的具體功能和作用機制需要進一步實驗驗證。

4 結(jié)論

本研究從毛竹基因組中共鑒定出27個PeNPFs基因，所有成員編碼的蛋白均包含完整的PTR2保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其蛋白序列差異分為7個亞家族，各亞家族成員之間的分子特征和組織表達特異性均存在著一定的差異，部分成員的表達表現(xiàn)為組織特異性或組成型表達。在PeNPFs啟動子序列中鑒定出多種與非生物脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件，冷、干旱以及GA3和NAA處理后毛竹的轉(zhuǎn)錄組表達譜證明PeNPFs參與了不同程度的非生物脅迫和激素的應(yīng)答，研究結(jié)果為揭示PeNPFs的生物學(xué)功能提供了重要依據(jù)。但對于PeNPFs的研究尚在起步階段，其在毛竹中的具體功能尚需展開大量的實驗進行驗證。