補陽還五湯入腦成分治療缺血性中風(fēng)潛在機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與驗證?

代雅潔， 劉振權(quán)， 江 洋， 于 雪， 王淑艷， 湯軼波

(北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029)

近年來，缺血性中風(fēng)(ischemic stroke，IS)的發(fā)病率呈逐年上升，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢[1]，給患者帶來巨大的痛苦，也給社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)亟待解決的一大難題[2，3]。IS是一種由于局部腦組織血流供應(yīng)不足或中斷而引起相應(yīng)腦組織大量神經(jīng)細(xì)胞死亡的疾病[4，5]。IS可引起一系列的病理生理變化，包括能量代謝障礙、炎癥反應(yīng)、興奮性氨基毒性作用、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[6]，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙[7，8]。目前臨床主要的治療方法是溶栓治療、取栓治療和抗血小板凝集治療，目的是及時有效地清除血栓或栓塞引起的血流阻斷[9]，但這些措施很難有效改善IS病灶形成后的病理損傷。中藥復(fù)方對IS的治療有其獨到的作用，如血府逐瘀湯、星蔞承氣湯和補陽還五湯(buyang huanwu decoction，BYHWD)等方劑在動物實驗和臨床治療中都發(fā)揮了良好的療效[10]。通過科學(xué)配伍，中藥中的有效成分可以共同發(fā)揮作用，有效干預(yù)IS的進展和預(yù)后。不同的中藥可以含有相同的成分，不同的成分也可以有相同或不同的作用靶點，因此中藥復(fù)方在治療疾病的過程中會形成一個獨特而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。通過這個網(wǎng)絡(luò)，能夠分析中藥復(fù)方的作用機制，探究中藥復(fù)方與疾病的關(guān)系，這種研究方法稱為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]。

BYHWD出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯》，原方具有補氣活血、活血通絡(luò)的功效，是治療氣虛血瘀型中風(fēng)的經(jīng)典名方[12]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對于BYHWD干預(yù)IS的機制探索也已達(dá)到分子水平[13，14]，但對于BYHWD治療IS所涉及的作用靶點和信號通路的研究還值得進一步深入。本文立足于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，以BYHWD治療IS的有效入腦成分-作用靶點-信號通路為研究對象，探討B(tài)YHWD治療IS的作用機制，針對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測到的凋亡通路進行動物實驗驗證。

1 方法

1.1 BYHWD入腦成分的獲取篩選及靶點預(yù)測

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/index.php)[15]，檢索BYHWD中各味中藥的成分，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、血腦屏障通透率(BBB)>-0.30[16，17]為限定條件對其進行篩選，獲取入腦成分及其作用的蛋白靶點。通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/main/ tcm_introduce.asp)[18]獲取“地龍”的成分信息，借助Swiss數(shù)據(jù)庫(http：//www.swissadme.ch/、http：//www.swisstargetprediction.ch/)[19，20]對地龍的成分進行篩選。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)[21]對獲取的蛋白靶點進行規(guī)范命名。

1.2 IS相關(guān)靶點的篩選

以“ischemic stroke”“ischemic brain damage”為關(guān)鍵詞，運用DiGSeE數(shù)據(jù)庫(https：//210.107.182.61/geneSearch/)[22]、OMIM數(shù)據(jù)庫(http：//www.omim.org)[23]、TTD數(shù)據(jù)庫(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[24]、DRUGBANK 數(shù) 據(jù) 庫(https：//www. drugbank.ca)[25]挖掘IS的相關(guān)靶點。利用Venny平臺(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，對檢索出的BYHWD成分靶點和IS相關(guān)靶點取交集并繪制韋恩圖，交集靶點被視為BYHWD治療IS的潛在靶點。

1.3 藥物-成分-靶點-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將BYHWD的藥物組成、入腦成分以及潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.2[26]軟件，構(gòu)建BYHWD治療IS “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。

1.4 潛在靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與KEGG通路的富集分析

將潛在靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)[27]構(gòu)建蛋白互作(protein protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，刪除無關(guān)聯(lián)的靶點，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。借助Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/gp/index.html)[28]對潛在靶點進行KEGG通路分析，將分析結(jié)果導(dǎo)入微生信在線平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制KEGG富集分析高級氣泡圖。

1.5 動物實驗驗證

成年雄性SD大鼠購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SYXK(京)2016-0038。BYHWD購自北京同仁堂藥店；依達(dá)拉奉(陽性藥)購自南京先聲東元制藥有限公司(批號80-181203)。將實驗動物分為假手術(shù)組、模型組、BYHWD組和依達(dá)拉奉組，通過大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型模擬IS，假手術(shù)組大鼠僅分離頸總動脈和頸外動脈，不插入線栓。用BYHWD(12.8 g/kg/qd)和依達(dá)拉奉(0.6 mg/kg/qd)分別對MCAO大鼠進行干預(yù)。術(shù)后7 d大鼠麻醉后取腦，將缺血側(cè)腦皮質(zhì)總蛋白提取后使用BCA法測定蛋白濃度，使用10% SDS-PAGE進行電泳，80 V/30 min濃縮膠電泳，120 V/60 min分離膠電泳。電泳結(jié)束后80 V恒壓濕轉(zhuǎn)90 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光法進行曝光，以磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylation extracellular regulated protein kinases，pErk)條帶與總Erk條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量[29，30]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BYHWD化學(xué)成分的獲取與篩選及靶點預(yù)測結(jié)果

通過檢索TCMSP和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫，獲得BYHWD中7味中藥各自對應(yīng)的有效活性成分共802種，經(jīng)篩選去重后得到BYHWD共38個入腦成分，其中包括芒柄花素(Formononetin)、黃芩素(Baicalein)、亞麻酸(Linolenic acid)、棕櫚酸(Palmitic acid)等(見表1)。檢索到黃芪(Radix Astragali)成分作用靶點73個，赤芍(Radix Paeoniae Rubra)72個，川芎(Chuanxiong Rhizoma)30個，當(dāng)歸(Angelicae sinensis Radix)51個，桃仁(Persicae Semen)44個，紅花(Carthami flos)91個，地龍(Pheretima)139個共500個，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點242個。

表1 BYHWD入腦成分基本信息

2.2 IS相關(guān)靶點的篩選結(jié)果

從DiGSeE數(shù)據(jù)庫獲取IS相關(guān)靶點227個，通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到634個相關(guān)靶點，TTD數(shù)據(jù)庫14個，Drugbank數(shù)據(jù)庫61個。合并后刪除重復(fù)值，最終得到816個IS相關(guān)靶點。將其與BYHWD的作用靶點取交集后共獲得60個(見圖1)。

圖1 BYHWD與IS韋恩圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果

通過Cytoscape3.7.2，構(gòu)建BYHWD治療IS潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。圖中紅色節(jié)點代表IS；粉色節(jié)點代表BYHWD治療IS的潛在靶點；紫色節(jié)點代表BYHWD的藥物組成；黃色節(jié)點代表各種入腦的成分。其中常春藤素(Hederagenin)、豆甾醇(Stigmasterol)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)是2味及以上藥物的共有成分。

注：HQ代表黃芪，CX代表川芎，TR代表桃仁，HH代表紅花，CS代表赤芍，DL代表地龍，GY代表共有成分圖2 BYHWD治療IS潛在靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果與KEGG通路的富集分析

將潛在靶點導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到BYHWD治療IS的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。對潛在靶點進行KEGG通路富集分析，初次富集到122條信號通路，其中P值排名前20的通路基本信息(見表2)。因KEGG富集分析結(jié)果排名前20的信號通路大多與癌癥相關(guān)，不能充分體現(xiàn)BYHWD治療IS的作用機制，故查閱文獻(xiàn)[31]，在122條具有統(tǒng)計學(xué)意義的信號通路中，選取與BYHWD治療IS相關(guān)性更高的20條信號通路，作為KEGG富集分析結(jié)果并進行展示(見圖4)。根據(jù)KEGG富集結(jié)果，繪制系統(tǒng)的BYHWD治療IS的主要信號通路圖(見圖5)。KEGG富集通路主要包括白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-17信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products,AGE-RAGE)信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路等。圖5示，MAPK信號通路是主要的差異通路之一，同時還與其他信號通路串?dāng)_，共同參與IS的進展。

圖3 BYHWD治療IS的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 Western blot法檢測BYHWD對IS后MAPK/Erk信號通路的影響結(jié)果

研究表明[32]，IS發(fā)生后中心缺血區(qū)域發(fā)生細(xì)胞壞死、半暗帶區(qū)域則出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。通過調(diào)控半暗帶缺血區(qū)相關(guān)細(xì)胞凋亡信號通路，可以減輕腦缺血損傷[33]。綜合BYHWD治療IS相關(guān)的KEGG富集通路結(jié)果來看，MAPK信號通路與細(xì)胞的生長繁殖和分裂死亡密切相關(guān)，值得進一步去探究。

MAPK信號通路主要由P38 MAPK、氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，Jnk)以及Erk3條信號通路組成[34]。其中有研究表明，Erk信號傳導(dǎo)通路可在顱腦外傷、腦缺血/再灌注損傷、滲透壓變化和生理應(yīng)激等情況下激活，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦損傷的過程中都發(fā)揮著重要作用[35-38]。

為探索BYHWD在治療IS過程中對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，故采用Western blot技術(shù)對MAPK/Erk信號通路進行實驗驗證。

表2 KEGG信號通路基本信息(P值排名前20)

圖4 BYHWD治療IS相關(guān)的KEGG富集通路氣泡圖

注：紫色節(jié)點代表與BYHWD治療IS相關(guān)的靶點，白色節(jié)點代表與IS相關(guān)的靶點圖5 BYHWD治療IS的主要信號通路圖

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠pErk表達(dá)顯著升高(P<0.001)，說明IS后激活了MAPK/Erk信號通路；與模型組比較，BYHWD組和依達(dá)拉奉組大鼠腦組織中pErk表達(dá)明顯降低(P<0.01)，但各組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中總Erk沒有明顯差異(如圖6)。

注：與假手術(shù)組比較：***P<0.001；與模型組比較：##P <0.01圖6 BYHWD對IS大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)MAPK/Erk通路的影響(n=3)

3 討論

血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是一種選擇性滲透屏障。一方面BBB允許血液中腦組織所需要的營養(yǎng)物質(zhì)等通過；另一方面能阻擋有害物質(zhì)的侵入，從而維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但也由于BBB的存在，許多藥物無法或難以穿過BBB，因此在腦內(nèi)濃度較低，不能充分發(fā)揮治療作用。

BYHWD由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸尾、桃仁、紅花、地龍等7味中藥組成。方中黃芪為補氣要品，大補脾胃之元氣，令氣旺血行，瘀去血通；當(dāng)歸尾善于活血，且有化瘀而不傷血的特點。川芎、赤芍、桃仁、紅花4味中藥佐助當(dāng)歸尾活血祛瘀，配以地龍通經(jīng)活絡(luò)，全方合伍共奏補氣活血通絡(luò)之功。前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[39]，BYHWD有效成分可以從多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮治療IS的作用，但其中部分成分相對分子量較大，脂溶性較低，難以透過BBB，這些成分是否能真正在病變組織處發(fā)揮藥理作用還有待商榷。因此，以BYHWD可入腦成分為介入點闡述其治療IS的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有更好的科學(xué)性。

通過TCMSP和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫共收集到BYHWD入腦成分38種，涉及黃酮類化合物黃芩素、異黃酮類化合物芒柄花素以及不飽和氨基酸亞麻酸、棕櫚酸等生物活性物質(zhì)。黃芩素具有很好的抗炎和抗氧化抗凋亡的藥理作用，不僅能夠通過抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-17、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)9等炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)核因子(nuclear factor-kappa B, NF-κB)信號通路等方式發(fā)揮抗炎作用[40]，還可改善神經(jīng)功能缺損，減少腦含水量和梗死面積[41]，具有神經(jīng)保護作用。芒柄花素廣泛存在于黃芪中，具有降血脂、抗炎以及清除自由基的藥理作用，能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，改善動脈粥樣硬化病變[42]，對心腦血管具有一定的保護作用[43]。這為BYHWD治療IS提供了新的藥理學(xué)基礎(chǔ)。另外，臨床研究[44]發(fā)現(xiàn)，膳食多不飽和脂肪酸能夠降低急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者血清C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein, CRP)及高半胱氨酸(homocysteine, HCY)水平，其藥理學(xué)作用還有待進一步研究。

KEGG信號通路富集分析結(jié)果涉及IL-17信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycosylation end products-receptor of advanced glycosylation end products, AGE-RAGE)信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路和MAPK信號通路等。KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，BYHWD能夠介導(dǎo)多條信號通路，從而發(fā)揮治療IS的作用。腦缺血發(fā)生后，固有淋巴細(xì)胞首先被激活，繼而通過遞呈抗原激活適應(yīng)性免疫，IL-17信號通路是中風(fēng)后固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，發(fā)揮著關(guān)鍵作用[45]。已有實驗證實，IL-17在MCAO大鼠大腦和外周血循環(huán)中表達(dá)明顯升高[46]，下調(diào)IL-17的表達(dá)，能夠促進中風(fēng)小鼠海馬神經(jīng)的生發(fā)[47]，因此抑制IL-17信號通路可能是防治IS的重要途徑。在IS的急性階段，炎癥反應(yīng)是繼發(fā)性神經(jīng)元損傷的重要因素[48]，PI3K/Akt信號通路是經(jīng)典的炎癥通路，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程中都發(fā)生著重要作用[49]。有研究發(fā)現(xiàn)，BYHWD可能通過調(diào)控PI3K/Akt通路，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用[50]。HIF-1在缺氧環(huán)境下廣泛存在于人體中，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧平衡，調(diào)節(jié)機體對缺氧的反應(yīng)，并誘導(dǎo)缺氧基因的表達(dá)[51]。糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路的激活，將導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物的過量產(chǎn)生進而加重IS[52]；神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路是質(zhì)膜上與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號通路相關(guān)的受體配體的集合，在生理上與神經(jīng)功能密切相關(guān)[53]。上述結(jié)果表明，BYHWD可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等過程，從而達(dá)到治療IS的作用。

MAPK超家族廣泛分布于細(xì)胞的胞漿內(nèi)，是引起細(xì)胞各種生物學(xué)反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，Erk是其亞家族之一。Erk信號通路在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和學(xué)習(xí)記憶功能等方面具有潛在作用[54]。在本實驗中，大鼠IS發(fā)生后，缺血側(cè)腦皮質(zhì)中pErk表達(dá)顯著升高，說明Erk通路在IS后開始活化。經(jīng)BYHWD治療后，大鼠缺血側(cè)腦中pErk表達(dá)明顯降低，Erk通路受到抑制。

綜上所述，BYHWD中各種成分協(xié)同配伍，其有效化合物成分在通過肝臟代謝后透過BBB作用于不同的靶點和通路，發(fā)揮治療IS的藥理作用。基于本研究網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)分析，可以推測BYHWD通過抗炎、抗氧化應(yīng)激等生物學(xué)途徑減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死，減輕腦水腫，改善神經(jīng)功能損傷；通過參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗凋亡干預(yù)IL-17信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路和MAPK信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為BYHWD臨床干預(yù)IS提供一定的理論依據(jù)。