加味溫膽湯對(duì)抑郁大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB通路及小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響?

戴建業(yè)， 張 齊， 張 曼， 武 麗△， 覃 倩

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 南寧 530012；3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧，530000)

抑郁癥屬于常見心理障礙疾病，通常表現(xiàn)為持久的情緒低落，部分表現(xiàn)為焦慮和運(yùn)動(dòng)性激越，嚴(yán)重者出現(xiàn)幻覺、妄想癥等，更有甚者出現(xiàn)自殺等念頭，危害嚴(yán)重[1]。臨床上抗抑郁藥物普遍副作用大、起效慢、療效差，中醫(yī)藥具有療效好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，為治療抑郁癥提供可能[2]。本課題組前期研究表明，加味溫膽湯能改善抑郁癥患者的情緒、認(rèn)知功能及軀體癥狀且無毒副作用[3]，但其具體機(jī)制尚不清楚。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞極化在各類精神疾病中的作用越來越受到關(guān)注，抑郁癥致病原因與M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎因子有關(guān)[4]，且高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核因子κB(high mobility group box chromosomal protein 1/toll-like receptor 4/nuclear factor-κB，HMGB1/TLR4/NF-κB)通路與小膠質(zhì)細(xì)胞極化關(guān)系密切[5]。本研究通過孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見性應(yīng)激制備大鼠抑郁模型，探究加味溫膽湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的作用，為臨床加味溫膽湯治療抑郁癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理協(xié)會(huì)審核批準(zhǔn)(批號(hào)20200012)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2018-0002。采用孤養(yǎng)方式單籠喂養(yǎng)，在溫度(22±2)℃、濕度(60±10)%、12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)。造模前進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，篩選出行為學(xué)評(píng)分相近的大鼠。48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、加味溫膽湯組、氟西汀組各12只。除正常組外，其余各組采用目前國際公認(rèn)的孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)見性應(yīng)激方法制備大鼠抑郁模型。

1.2 藥物

加味溫膽湯組成：枳實(shí)、橘紅、黨參、甘草各10 g，半夏15 g，茯苓、竹茹、香附、桔梗各20 g，麥冬、柴胡各30 g，均購自張仲景大藥房且經(jīng)中藥植化室鑒定，委托廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，水煎濃縮為1.5 g/mL，將煎煮液制成浸膏，置4 ℃冰箱內(nèi)備用。鹽酸氟西汀片(國藥準(zhǔn)字H19980139)常州四藥制藥有限公司。

1.3 試劑與儀器

蘇木精-伊紅染色試劑盒(貨號(hào)G1120)，北京索萊寶科技有限公司；小膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白-離子鈣結(jié)合適配器分子1(Ionized calcium-binding adapter mo35，Iba1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶1(arginase 1，Arg1)、HMGB1、TLR4、NF-κB一抗、大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-10、IL-4、IL-13 ELISA試劑盒(abcam，貨號(hào)分別為ab5076、ab178945、ab203490、ab18256、ab22048、ab32360、ab236712、ab239425、ab197742、ab214566、ab100770、ab269547)、蛋白凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)Gel Doc EZ)，BIO-RAD公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備及給藥 參考文獻(xiàn)方法造模[6]，大鼠分組后，除正常組外其余各組接受21 d各種未預(yù)知刺激，包括禁食24 h、禁水24 h、通宵照明、4 ℃冷水游泳5 min、45 ℃烘箱熱烘5 min、夾尾2 min、高速水平振蕩3 min、100伏電擊足底1 min、懸尾1 min。每天隨機(jī)安排1種刺激方法，每種刺激在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中使用2次或3次，且同一刺激不連續(xù)出現(xiàn)，動(dòng)物不可預(yù)知給予的刺激。曠場實(shí)驗(yàn)及糖水消耗實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造模是否成功。

造模成功后開始給藥，加味溫膽湯組以12 g/(kg·d)劑量灌胃加味溫膽湯[7]；氟西汀組以10 mg/(kg·d)劑量腹腔注射氟西汀[8]；正常組、模型組灌胃等容量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)21 d。

1.4.2 曠場實(shí)驗(yàn) 分別于實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。自制邊長為80 cm底面、高為40 cm的周邊不透明敞箱，底面正方形箱底用白線分為面積相等的25塊，周圍環(huán)境安靜，將大鼠置于敞箱底部的中心方格中，記錄大鼠3 min內(nèi)活動(dòng)情況。以穿越底面塊數(shù)為水平穿越格數(shù)、前肢離開地面直立次數(shù)為豎立活動(dòng)次數(shù)。

1.4.3 糖水消耗實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前大鼠先進(jìn)行糖水適應(yīng)，給予2瓶1%蔗糖水，24 h后更換為1瓶1%蔗糖水、1瓶純凈水24 h，12 h時(shí)交換2瓶水的位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁水禁食24 h，給予1瓶1%蔗糖水、1瓶純凈水，2瓶水位置隨機(jī)，觀察1 h內(nèi)糖水和純水的消耗量。糖水偏愛率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4.4 蘇木精-伊紅染色觀察 海馬區(qū)形態(tài)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只大鼠處死，取全腦經(jīng)4%多聚甲醛和30%蔗糖脫水后，冰凍切片機(jī)上連續(xù)切片(厚度10 μm)，切出完整海馬區(qū)，切片置于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、蘇木精浸染、鹽酸酒精分化、伊紅復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照。

1.4.5 免疫熒光染色觀察海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化 冰凍切片60 ℃烤箱烤片30 min，PBS清洗3次，3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，5%胎牛血清孵育30 min，滴加Iba1、iNOS、Arg1一抗，4 ℃孵育過夜，避光滴加二抗室溫孵育2 h，DAPI核染5 min，防熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下拍照。

1.4.6 ELISA檢測血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-4、IL-13水平 各組大鼠處死前抽取股靜脈血5 mL，參考ELISA試劑盒說明書，檢測血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-4、IL-13水平。

1.4.7 Western blot檢測海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)處死每組剩余的6只大鼠，摘除全腦，取完整海馬區(qū)，提取總蛋白，每孔上樣20 μg，凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，分別添加HMGB1(1∶1000)、TLR4(1∶500)、NF-κB(1∶1500)、GAPDH(1∶5000)一抗，4 ℃孵育過夜，添加對(duì)應(yīng)二抗，DAB顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 加味溫膽湯對(duì)大鼠行為學(xué)的影響

實(shí)驗(yàn)前，各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平穿越格數(shù)、豎立活動(dòng)次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平穿越格數(shù)、豎立活動(dòng)次數(shù)、糖水偏愛率降低(P<0.05)；與模型組比較，加味溫膽湯組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)水平穿越格數(shù)、豎立活動(dòng)次數(shù)、糖水偏愛率均升高(P<0.05)，氟西汀組曠場實(shí)驗(yàn)水平穿越格數(shù)與糖水偏愛率升高(P<0.05)；與氟西汀組比較，加味溫膽湯組曠場實(shí)驗(yàn)水平穿越格數(shù)升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)、糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 加味溫膽湯對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的影響

正常組海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞核在細(xì)胞膜內(nèi)；模型組海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元形態(tài)異常，核深染甚至消失；加味溫膽湯組和氟西汀組部分神經(jīng)元排列較整齊，部分形態(tài)恢復(fù)(見圖1)。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)HE染色(400×)

2.3 加味溫膽湯對(duì)海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬區(qū)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例升高(P<0.05)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與模型組比較，加味溫膽湯組、氟西汀組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例降低(P<0.05)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例升高(P<0.05)；與氟西汀組比較，加味溫膽湯組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例降低(P<0.05)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例升高(P<0.05)(見圖2表2)。

注：小膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白-離子鈣結(jié)合適配器分子1(Ionized calcium-binding adapter mo35，Iba1)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，精氨酸酶1(arginase 1，Arg1)圖2 各組大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況比較

表2 各組大鼠海馬區(qū)M1型、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例比較

2.4 加味溫膽湯對(duì)血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-4、IL-13水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平升高(P<0.05)，IL-10、IL-4、IL-13水平降低(P<0.05)；與模型組比較，加味溫膽湯組、氟西汀組血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平降低(P<0.05)，IL-10、IL-4、IL-13水平升高(P<0.05)；與氟西汀組比較，加味溫膽湯組大鼠血清中IL-1β水平降低(P<0.05)，IL-13水平升高(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-10、IL-4、IL-13水平比較

2.5 加味溫膽湯對(duì)大鼠海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，加味溫膽湯組、氟西汀組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；加味溫膽湯組較氟西汀組TLR4蛋白表達(dá)更低(P<0.05)(見圖3表4)。

注：高遷移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)，核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)圖3 各組大鼠海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平比較

3 討論

抑郁癥屬于西醫(yī)病名，相關(guān)最早記載見《左傳》：“君子魏子重于是役也，所獲不如所亡，楚人以是咎子重，子重病之，遂遇心病而卒”，此處“心病”與抑郁癥癥狀類似[9]，抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”“臟躁”“百合病”等范疇。中醫(yī)病因有氣機(jī)郁滯、痰濁郁阻、氣血虧虛等[10]，多認(rèn)為病位在心脾、肝脾相兼為病，治療常采用健脾、補(bǔ)脾配合清心解郁之法。加味溫膽湯中橘紅、茯苓健脾化瘀、順氣開竅，竹茹、柴胡、香附解郁清熱、疏肝理氣，麥冬清心除煩，枳實(shí)行氣除痞，黨參補(bǔ)中益氣，半夏化痰燥濕、散結(jié)除痞，桔梗祛痰止咳、消腫排膿，甘草調(diào)和諸藥。本研究中通過一系列不可預(yù)知的刺激，并采用孤養(yǎng)方式制備抑郁癥大鼠模型，模擬臨床郁悶、寂寞、悲傷等情感狀態(tài)。加味溫膽湯治療可改善大鼠由于抑郁癥造成的活動(dòng)能力下降、對(duì)食物欲望不強(qiáng)烈等表現(xiàn)，與前期實(shí)驗(yàn)中加味溫膽湯可對(duì)抑郁癥行為有調(diào)節(jié)作用[11]結(jié)果類似，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

小膠質(zhì)細(xì)胞可介導(dǎo)多種免疫效應(yīng)因子和炎癥因子，正常情況下對(duì)感染、應(yīng)激等病理狀態(tài)做出免疫應(yīng)答；小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)能夠分泌具有細(xì)胞毒性的炎癥因子和保護(hù)神經(jīng)的抑炎因子，從而發(fā)揮作用，且小膠質(zhì)細(xì)胞活化與小膠質(zhì)細(xì)胞極化關(guān)系密切[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞極化分M1型和M2型，M1型分泌TNF-α、IFN-γ、IL-1β等促炎因子，M2型分泌IL-10、IL-4、IL-13等抑炎因子和血管生成因子[13-15]。病理狀態(tài)下，IFN-γ或脂多糖可使靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，通過Toll樣受體等釋放大量炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[16]；而抑炎因子IL-4、IL-13等可促使小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，釋放大量抑炎因子、血管生成因子等，抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、參與神經(jīng)元修復(fù)等過程[17]。HMGB1/TLR4/NF-κB通路是小膠質(zhì)細(xì)胞極化及神經(jīng)炎癥的重要通路，正常情況下，HMGB1位于真核細(xì)胞核中，與細(xì)胞核中DNA緊密連接，從而穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)功能；但受致炎因子、小膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥刺激時(shí)，HMGB1與核內(nèi)DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致結(jié)合力下降，HMGB1由核進(jìn)入細(xì)胞漿中，此時(shí)的HMGB1具有致炎性，可與Toll樣受體結(jié)合，直接或間接參與NF-κB通路調(diào)控的炎癥反應(yīng)過程[18，19]。抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)功能[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例及血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β水平升高；此時(shí)海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平亦升高，提示抑郁狀態(tài)時(shí)HMGB1由核進(jìn)入細(xì)胞漿中，與Toll樣受體結(jié)合，參與NF-κB通路過程，激活I(lǐng)FN-γ等水平，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，通過級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)促進(jìn)炎癥反應(yīng)；而經(jīng)過加味溫膽湯治療后，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例及血清中IL-4、IL-10、IL-13水平升高，海馬區(qū)HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白水平降低，提示加味溫膽湯可抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路，促進(jìn)抑炎因子的分泌，使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制炎癥，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)。

綜上所述，加味溫膽湯可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路和促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而改善神經(jīng)功能和抑郁。加味溫膽湯成分復(fù)雜，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。