1株優(yōu)良釀酒酵母的分離鑒定及特性分析

陳秀秀，孫洪浩，孫小涵，呂福軍

（遼寧波爾萊特農(nóng)牧實業(yè)有限公司，遼寧沈陽 110000）

酵母飼料是利用活性酵母菌的新陳代謝和繁殖菌體，經(jīng)過發(fā)酵和干燥等特殊工藝制成的含有活菌和酵母細胞代謝產(chǎn)物的安全、無污染、無抗藥性的優(yōu)質(zhì)飼料。目前可用作飼料微生態(tài)制劑的酵母菌主要為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和 產(chǎn) 朊 假 絲 酵 母（Candida utilis）。其中，釀酒酵母在飼料生產(chǎn)中獲得了廣泛的研究和應用。李秀麗等[1]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加釀酒酵母復合物可提高肉牛日增重和飼料表觀消化率。王斌星等[2]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加釀酒酵母發(fā)酵液可顯著提高斷奶仔豬生長性能，能夠促進小腸發(fā)育，提高小腸黏膜免疫功能，可達到與抗生素相當?shù)男ЧO喆等[3]研究表明，飼料中添加釀酒酵母培養(yǎng)物可改善肉仔雞的生長性能，提高肉仔雞的免疫功能。

釀酒酵母為單細胞微生物，屬于真菌類，是兼性厭氧菌[4]。酵母細胞富含營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、礦物質(zhì)、維生素以及硒、鉻、鐵、鋅等微量元素。酵母細胞壁的主要成分為β-葡聚糖和甘露寡糖，酵母細胞中還富含多種消化酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和植酸酶等[5-7]。此外，酵母細胞代謝產(chǎn)物包含多種化合物，如酯類、高級醇類、有機酸類、酚類和脂肪酸衍生物等[8-9]。釀酒酵母類產(chǎn)品能夠有效改善動物消化道微生態(tài)平衡，提高機體免疫力，增強抗氧化能力，提高飼料消化率，增強飼料適口性，提高動物生產(chǎn)性能[10-13]。本研究以釀酒酵母PL-J的產(chǎn)氣能力、耐高糖、耐低pH值、抑菌性、熱穩(wěn)定性和耐膽鹽能力為指標，對釀酒酵母PL-J的特性進行評價，旨在為其在飼料生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蜂蜜來自沈陽自養(yǎng)蜂場。麥芽汁培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 菌株分離鑒定

1.2.1 分離純化

（1）富集培養(yǎng)：精確稱量1 mL樣品，置于50 mL麥芽汁培養(yǎng)基中，30℃200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，劃線于麥芽汁瓊脂平板，30℃倒置培養(yǎng)48 h。

（2）純化培養(yǎng)：挑取疑似單菌落劃線于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板，30℃倒置培養(yǎng)24 h，重復3次以上平板劃線，分離純化的菌株-80℃保存。

1.2.2 形態(tài)觀察與序列鑒定

（1）形態(tài)學觀察：挑取疑似單菌落進行美藍染色，觀察真菌形態(tài)及出芽形成狀態(tài)。

（2）序列鑒定：細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA，引 物NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'和NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAG-ACGG-3'進行PCR擴增。

26S rDNA的PCR擴增體系（30μL）：Super Mix 15μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板DNA 1μL、ddH2O 12μL。

PCR反應程序：96℃5 min；96℃20 s，56℃20 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min，16℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

將所得序列與Genbank中序列進行Blast分析比較，以26S rDNA基因序列同源性A＞99%為鑒定標準，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 釀酒酵母PL-J的培養(yǎng)

釀酒酵母PL-J活化后接種于麥芽汁種子培養(yǎng)基，30℃200 r/min培養(yǎng)18 h，按3%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃200 r/min培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間每隔2 h取一次樣，測定660 nm處吸光度值及pH值，繪制24 h生長曲線及pH值曲線。

1.4 產(chǎn)氣能力鑒定

采用杜氏管發(fā)酵法，取1 mL酵母菌發(fā)酵液加入有杜氏小管的9 mL麥芽汁培養(yǎng)液，30℃恒溫靜置培養(yǎng)，定時觀察酵母菌株產(chǎn)氣情況。結(jié)果記為“+”“++”“+++”“++++”，分別表示產(chǎn)氣達到杜氏小管的1/4、1/2、3/4、全部。

1.5 高糖耐受性試驗

菌種活化后按3%接種量分別加入含有葡萄糖濃度在100、200、300、400、500、600和700 g/L的麥芽汁培養(yǎng)基中，對照組（NC）為正常培養(yǎng)基，30℃200 r/min培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液按10倍逐級稀釋至所需稀釋度，選取2個適當稀釋度，每個稀釋度3個重復，吸取不同稀釋度菌懸液100μL，涂布于麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.6 耐低pH值試驗

菌種活化后按3%接種量分別加入pH值為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0和5.0的麥芽汁培養(yǎng)基中，NC組為培養(yǎng)基自然pH值，30℃200 r/min培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液按10倍逐級稀釋至所需稀釋度，選取2個適當稀釋度，每個稀釋度3個重復，吸取不同稀釋度菌懸液100μL，涂布于麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.7 抑菌活性

取發(fā)酵液10 000 r/min下離心5 min，取上清液，過濾。調(diào)整指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌濃度吸光值約為0.05，試驗組為4 mL指示菌液加1 mL試驗菌液；對照組（NC）為4 mL指示菌液加1 mL生理鹽水，測定初始吸光度。兩組37℃200 r/min充分振蕩共培養(yǎng)3 h，分別測定各試管液體在600 nm處吸光度值，計算抑菌率。

式中：A空為對照組振蕩培養(yǎng)3 h后的吸光度；A空0為對照組初始的吸光度；A樣為試驗組振蕩培養(yǎng)3 h后的吸光度；A樣0為試驗組初始的吸光度。

1.8 高溫耐受性試驗

菌種活化后按3%接種量接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，分別于37、45、50和55℃過夜培養(yǎng)，NC組30℃培養(yǎng)。按10倍逐級稀釋至所需稀釋度，選取2個適當稀釋度，每個稀釋度3個重復，吸取不同稀釋度菌懸液100μL，涂布于麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.9 耐膽鹽試驗

菌種活化后按3%接種量加入含有0.03%、0.10%、0.30%、0.50%和1.00%膽鹽濃度的麥芽汁培養(yǎng)液中，NC組為正常培養(yǎng)基。30℃200 r/min培養(yǎng)24 h后，取發(fā)酵液按10倍逐級稀釋至所需稀釋度，選取2個適當稀釋度，每個稀釋度3個重復，吸取不同稀釋度菌懸液100μL，涂布于麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。

1.10 20 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

釀酒酵母PL-J接種于麥芽汁種子培養(yǎng)基中，30℃200 r/min下培養(yǎng)18 h，獲得種子液；按3%接種量轉(zhuǎn)接至10 L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件為30℃、轉(zhuǎn)速150～400 r/min、通氣量為0.12～0.50 m3/h條件下，于20 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)16 h制得發(fā)酵液，采用平板計數(shù)法記錄菌數(shù)。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，參數(shù)組間比較采用t檢驗。結(jié)果以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株PL-J的菌落形態(tài)（見圖1）

由圖1可知，釀酒酵母PL-J菌落呈圓形凸起且邊緣整齊，乳白色，出芽生殖。

2.2 釀酒酵母PL-J的26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）

將所得序列與Genbank中序列進行Blast分析比較，以26S rDNA基因序列同源性A＞99%為鑒定標準，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

由圖2可知，該菌PL-J與NCBI公布的釀酒酵母的同源性達到100%，將該分離菌鑒定為釀酒酵母。將釀酒酵母PL-J保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號：CGMCC No.24059。

2.3 酵母菌株PL-J的生長曲線及pH值曲線（見圖3）

由圖3可知，PL-J菌株在6 h進入對數(shù)生長期，18 h進入平臺期；pH值在24 h時由最初的6.02降至3.88，表明釀酒酵母PL-J在發(fā)酵過程中產(chǎn)有機酸。

2.4 釀酒酵母PL-J的產(chǎn)氣能力試驗結(jié)果（見表1）

由表1可知，PL-J發(fā)酵17 h后產(chǎn)氣達到滿管，菌株發(fā)酵周期較短。

表1 釀酒酵母PL-J的產(chǎn)氣能力試驗結(jié)果Tab.1 Results of gas production capacity of Saccharomycescerevisiae PL-J

2.5 釀酒酵母PL-J的高糖耐受性試驗結(jié)果（見表2）

表2 釀酒酵母PL-J的高糖耐受性試驗結(jié)果Tab.2 Result of glucose tolerance of Saccharomycescerevisiae PL-J單位：CFU/mL

由表2可知，與NC組相比，葡萄糖濃度100～300 g/L的3組活菌數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）；400 g/L組活菌數(shù)顯著降低（P＜0.05），500 g/L組、600 g/L組和700 g/L組活菌數(shù)均極顯著降低（P＜0.01）。其中葡萄糖濃度700 g/L組活菌數(shù)最低，為1.79×104CFU/mL。

2.6 釀酒酵母PL-J的耐低pH值試驗結(jié)果（見表3）

由表3可知，與NC組相比，pH值3.0～5.0各組的活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05），pH值1.0、1.5、2.0、2.5時活菌數(shù)極均顯著降低（P＜0.01）。其中pH值為1.0時活菌數(shù)最低，為1.40×104CFU/mL。

表3 釀酒酵母PL-J的耐低pH值試驗結(jié)果Tab.3 Result of low pH tolerance of Saccharomycescerevisiae PL-J單位：CFU/mL

2.7 釀酒酵母PL-J的抑菌活性（見表4）

由表4可知，PL-J菌株對共培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是57.3%和68.4%，均超過50%。

表4 釀酒酵母PL-J的抑菌活性Tab.4 Inhibitory activity of Saccharomycescerevisiae PL-J單位：%

2.8 釀酒酵母PL-J的高溫耐受性試驗結(jié)果（見表5）

由表5可知，釀酒酵母PL-J在37～50℃范圍內(nèi)均可生長，55℃時活菌數(shù)為0。

表5 釀酒酵母PL-J的高溫耐受性試驗結(jié)果Tab.5 Result of thermal stability of Saccharomycescerevisiae PL-J單位：CFU/mL

與NC組相比，溫度為37℃時活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05），45、50℃時活菌數(shù)均極顯著降低（P＜0.01），其中以50℃時最低，為2.67×106CFU/mL。

2.9 釀酒酵母PL-J的耐膽鹽試驗結(jié)果（見表6）

由表6可知，與NC組相比，膽鹽濃度為1.00%時，活菌數(shù)顯著下降（P＜0.05）；膽鹽濃度在0.03%～0.50%范圍內(nèi)時，釀酒酵母PL-J活菌數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），表明在此膽鹽濃度范圍內(nèi)時，釀酒酵母PL-J完全耐受。

表6 釀酒酵母PL-J的耐膽鹽試驗結(jié)果Tab.6 Result of bile tolerance of Saccharomycescerevisiae PL-J單位：CFU/mL

2.10 釀酒酵母PL-J 20 L罐放大培養(yǎng)最優(yōu)參數(shù)（見表7）

釀酒酵母PL-J 20 L罐放大培養(yǎng)的最優(yōu)參數(shù)見表7；發(fā)酵結(jié)束后，采用平板計數(shù)法計菌數(shù)，結(jié)果顯示，菌量可達到2.0×109CFU/mL。

表7 釀酒酵母PL-J 20 L罐放大培養(yǎng)最優(yōu)參數(shù)Tab.7 Optimum parameters of amplification culture in 20 L fermentor of Saccharomycescerevisiae PL-J

3 討論

酵母菌除具有優(yōu)良的天然特性外，還具有耐酸和耐高糖等高抗逆性。酵母菌耐酸以及可生長pH值范圍較寬的特性是在動物消化道內(nèi)起作用的前提。因此，耐酸酵母菌在飼用酵母的應用方面具有一定優(yōu)勢。本研究中，耐低pH值試驗結(jié)果表明，釀酒酵母PL-J適應pH值范圍廣，在pH值1～5的條件下均可生長。Vilela等[14]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在pH值2.0～5.0之間的條件下均可生長，與本研究結(jié)果基本相似。

高濃度糖導致的高滲壓力是釀酒酵母生產(chǎn)中常遇到的問題，篩選耐高糖的酵母對生產(chǎn)具有重要價值。本研究結(jié)果顯示，釀酒酵母PL-J可以在葡萄糖含量100～700 g/L條件下生長。薛軍俠等[15]研究表明，14株野生釀酒酵母菌可耐受50%葡萄糖濃度不耐受60%葡萄糖濃度。薛梅等[16]研究表明，甜高粱釀酒酵母菌可在葡萄糖濃度為700 g/L的條件下生長，800 g/L條件下不生長，與本試驗結(jié)果基本一致。

因飼料加工過程中需要高溫制粒，選育耐高溫酵母菌對于在飼料工業(yè)中應用酵母類產(chǎn)品具有一定意義。大量研究結(jié)果表明，多數(shù)酵母菌種最高耐受溫度為45℃，在50℃條件下基本不生長[17-19]。本研究中的高溫耐受性試驗結(jié)果表明，釀酒酵母PL-J經(jīng)過50℃處理后，仍有106CFU/mL活菌。酵母菌的抑菌活性是通過代謝產(chǎn)物如乙醇、乳酸、亞硫酸鹽等具有殺菌作用的小分子物質(zhì)以及肽類、吡嗪衍生物類和未知抗生素、殺菌素糖蛋白而產(chǎn)生的[20-22]。本研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，結(jié)果顯示，PL-J菌株對共培養(yǎng)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是57.3%和68.4%，說明釀酒酵母PL-J具有一定的抑菌作用。

益生菌是先通過胃酸環(huán)境后進入小腸，在腸內(nèi)發(fā)揮益生作用，小腸中膽鹽對菌體產(chǎn)生抑制作用。小腸內(nèi)膽鹽濃度范圍是0.03%～0.30%，是影響菌株存活率的重要因素。在本研究中膽鹽濃度在0.03%～0.50%范圍內(nèi)，釀酒酵母PL-J活菌數(shù)與NC組相比差異不顯著，表明在此膽鹽范圍內(nèi)釀酒酵母PL-J完全耐受。

4 結(jié)論

釀酒酵母PL-J具有良好的熱穩(wěn)定性和產(chǎn)氣能力，耐高糖、耐低pH值、耐膽鹽，可為后續(xù)的應用如發(fā)酵飼料提供優(yōu)良的菌種來源。