7個指標(biāo)的微波酒制白屈菜炮制工藝研究

黃 爽，李瑞海，賈天柱

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

白屈菜ChelidoniummajusL.是一種屬全草類的罌粟科植物[1]，俗稱山黃連、斷腸草等。白屈菜藥性涼、苦，有小毒，歸肺經(jīng)、胃經(jīng)[2]，常用于解痙止痛、鎮(zhèn)咳平喘[3]。白屈菜中富含的原阿片堿、別隱品堿等生物堿類活性成分是其發(fā)揮治療作用的主要因素[4]。目前，對白屈菜飲片炮制方法的研究報道較少，除凈制外，還有研究者對其進(jìn)行了醋制以達(dá)到減毒增效的效果[5]。本研究對白屈菜進(jìn)行酒制炮制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酒制，白屈菜生品中難容于水、難煎出的游離型生物堿煎出量均有提升。傳統(tǒng)中藥材酒制法對操作者在炮制過程中的火力及時間掌控能力要求較高，在炮制過程中易出現(xiàn)火力過猛，時間過長，造成藥材煎糊，或火力過小，炮制時間不足導(dǎo)致含水量過高等問題[6]。因此，本研究將工藝可控的微波技術(shù)引入白屈菜酒制炮制中，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)酒制不足。本研究采用正交設(shè)計法，以白屈菜中別隱品堿等7種生物堿總量為評價指標(biāo)，優(yōu)選白屈菜微波酒制炮制最佳工藝，為白屈菜飲片的進(jìn)一步炮制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P230Ⅱ依利特高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；P70F23P-G5(SO)微波爐(廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司)；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FDV 超細(xì)粉碎機(jī)(北京興時利和科技發(fā)展有限公司)；FA1004 精密電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)與購自金壇市白塔新寶儀器廠的HH-W600 數(shù)顯三用恒溫水箱。

1.2 試藥

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王榮祥教授鑒定本研究所用白屈菜為產(chǎn)自廣西的罌粟科全草類植物白屈菜；古越龍山15%vol黃酒(中國紹興黃酒集團(tuán)有限公司)；白屈菜堿 Alk3 (Chelidonine，YZ180424，>99.9%，南京源植物生物科技有限公司)；大連美侖生物技術(shù)有限公司供應(yīng)以下標(biāo)準(zhǔn)品：原阿片堿 Alk1 (Protoopine，20170612，99.5%)、別隱品堿 Alk2 (Allocryptopine，20160918，99.1%)、鹽酸黃連堿Alk4 (Coptisine hydrochloride，20170719，98.2%)、血根堿Alk5 (Sanguinarine，20140717，99.6%)、小檗堿 Alk6 (Berberine，20160907，99.5%)和白屈菜紅堿Alk7 (Chelerythrine，20170103，98.1%)；乙腈(國藥集團(tuán))；超純水及鹽酸等試劑。7個生物堿堿極性大?。涸⑵瑝A>別隱品堿>白屈菜堿>鹽酸黃連堿>血根堿>小檗堿>白屈菜紅堿。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 配制對照品溶液 取Alk1、Alk2、Alk3、Alk4、Alk5、Alk6和Alk7對照品，以甲醇為溶劑制成0.037 1、0.053 6、0.025 9、0.061 8、0.027 4、0.044 6、0.026 0 mg/mL的混合對照品溶液備用。

2.1.2 配制供試品溶液[7-9]精密稱取白屈菜粉末2 g(粉碎并過60目篩)，置150 mL錐形瓶中，55 ℃下乙醇超聲提取 60 min (50 mL，200 W，40 kHz)。濾過得提取液，蒸干，加 100 mL 0.4%鹽酸浸泡，靜置過夜。隔夜后將浸泡液及殘?jiān)浦?25 mL量瓶中，50 ℃下超聲30 min。抽濾并取續(xù)濾液50 mL，用2.71 mol/L 的NaOH溶液調(diào)pH值至11，靜置30 min(室溫)，加40 mL氯仿萃取3次，合并氯仿層，合并蒸干氯仿層，以甲醇為溶劑，定容至10 mL 容量瓶中，過濾備用(0.45 μm微孔濾膜)。

2.2 色譜條件[8-10]

選用規(guī)格為(4.6 mm×250 mm，5 μm)的Kromasil ODS-C18中匯達(dá)分析柱；選擇的流動相為(A)0.1%三乙胺溶液(pH=3)-(B)乙腈；選用0～18 min，24%B；18～32 min：24%B→35%B條件進(jìn)行梯度洗脫；設(shè)置檢測波長為274 nm；流速調(diào)節(jié)為2 mL/min；柱溫調(diào)至30 ℃；每次進(jìn)樣20 μL。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液及供試品溶液各20 μL，并在上述色譜條件下進(jìn)行檢測，如圖1所示，對照品分離度良好，無干擾峰。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取含0.218 mg/mL Alk1、0.0536mg/mL Alk2、0.063 mg/mL Alk3、0.187 mg/mL Alk4、0.017 mg/mL Alk5、0.019 mg/mL Alk6和0.020 4 mg/mL Alk7的混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL，以甲醇為溶劑，分別將各對照品溶液定容至25 mL容量瓶中，測定各個混合對照品的色譜峰面積(同“2.2”項(xiàng)條件)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[X(進(jìn)樣量/μg)，Y(峰面積)]，回歸方程及線性范圍見表1。結(jié)果表明，7種對照品溶液線性關(guān)系良好。

表1 回歸方程及線性范圍

注：1：Alk1；2：Alk2；3：Alk3；4：Alk4；5：Alk5；6：Alk6；7：Alk7。對照品(A)；白屈菜藥材(B)。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取7種對照品溶液，分別測其峰面積RSD(n=6)為2.09%、2.39%、0.58%、1.46%、1.56%、1.97%、1.11%，說明方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取白屈菜1號(20201222)樣品，分別精密稱取2 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法配制供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)條件進(jìn)樣測定，結(jié)果原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿的含量分別為0.394 4、0.062 0、0.723 1、0.859 4、0.082 5、0.044 1、0.037 6 mg/g，RSD(n=6)分別為1.17%、1.93%、0.58%、0.17%、2.06%、1.28%、0.81%，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(20201222)供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定(“2.2”項(xiàng)條件)，原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿的峰面積RSD(n=6)分別為1.20%、2.12%、0.70%、1.86%、2.35%、1.43%、0.86%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定白屈菜粉末2 g，共6份，置于量瓶中，分別加入10 mL混合對照品溶液(含1.225 mg/mL Alk1、2.265 mg/mL Alk2、1.875 mg/mL Alk3、3.03 mg/mL Alk4、0.105 mg/mL Alk5、0.16 mg/mL Alk6和0.05 mg/mL Alk7)，配制成供試品溶液(“2.1.2”項(xiàng)方法)，進(jìn)行HPLC測定(“2.2”項(xiàng)條件)，計算得各樣品平均回收率分別為99.71%、99.76%、101.43%、100.29%、100.66%、98.39%和100.05%，RSD分別為0.37%、1.98%、1.87%、0.60%、1.12%、2.53%和1.89%，符合相關(guān)規(guī)定。

2.9 正交設(shè)計及含量測定結(jié)果[5-7]

本研究參考文獻(xiàn)[5]采用燜法進(jìn)行正交試驗(yàn)，以酒用量、燜潤時間、火力大小和炮制時間為因素，各取3個水平(見表2、圖2)，按照表3進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 因素水平

以總堿量進(jìn)行方差分析，黃酒用量和炮制時間因素具有顯著性差異(見表4)。以Alk1、Alk2、Alk3和Alk4的總量進(jìn)行方差分析時，其結(jié)果與總堿為指標(biāo)時結(jié)果相似。據(jù)白屈菜總堿直觀分析，各因素影響順序?yàn)锳>D>C>B，最佳組合為酒用量40%，燜潤1 h，60%火力下炮制3 min。據(jù)方差分析，黃酒用量和炮制時間因素差異有顯著性，燜潤時間和火力大小因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義，酒量3水平最佳，燜潤時間1水平最佳，即酒用量40%，燜潤1 h，選擇火力大小60%，炮制時間3 min。結(jié)合直觀分析與方差分析結(jié)果，確定工藝為加酒用量40%，燜潤1 h，60%微波火力下炮制3 min。

表3 L9(34)正交設(shè)計

注：總堿(A)；Alk1、Alk2、Alk3、Alk4的和值(B)。

表4 方差分析

2.10驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取白屈菜粉末3份，每份約100 g，分別加40 g黃酒拌勻，燜潤1 h，60%微波火力下炮制3 min。分別按“2.1.2”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)進(jìn)行供試品溶液配制和HPLC檢測。結(jié)果表明，3份樣品中7種生物堿總堿的平均含量為2.15 mg/g(n=3)，RSD為0.26%，表明優(yōu)選出的微波酒制白屈菜炮制工藝可靠。

3 討論

本研究采用多指標(biāo)分組考察，以7個對照品及其總生物堿含量為指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)結(jié)果更客觀，更接近實(shí)際結(jié)果，具有顯著的特點(diǎn)。在對7個對照品分別做正交數(shù)據(jù)處理過程中發(fā)現(xiàn)，極性相對大的前4個生物堿，即原阿片堿、別隱品堿、白屈菜堿和鹽酸黃連堿的數(shù)據(jù)變化趨勢趨于一致，即燜潤時間與火力大小均對其影響小，而黃酒用量和炮制時間均對其影響大，說明黃酒用量和炮制時間因素對水溶性生物堿具有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。別隱品堿等4個生物堿成分水溶性相對強(qiáng)，由于酒的加入使更多生物堿溶出，因而可更好地發(fā)揮白屈菜的止痛功效。本研究建立的白屈菜7個成分多指標(biāo)評價的HPLC含量測定方法，分離度較高，符合相關(guān)要求，較前期研究增加了別隱品堿，具有一定新意。