mNGS在1例兒童感染性疾病后期的臨床應(yīng)用及文獻分析*

祁云霞 王 森 司艷鳳 李樹軍 王志遠(yuǎn)

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，河南省衛(wèi)輝市 453100

近年來宏基因組二代測序(mNGS)技術(shù)在兒童感染性疾病中的臨床應(yīng)用逐漸增多，成為病原學(xué)診斷的新方法，mNGS在疾病早期可快速明確病原，為臨床及時、精準(zhǔn)治療提供有力證據(jù)[1]；本文介紹1例膿毒性休克患兒的診療經(jīng)過，探討mNGS檢測在治療后期的臨床應(yīng)用價值，并結(jié)合相關(guān)文獻分析進行論述，以期為兒科醫(yī)師提供相關(guān)經(jīng)驗。

1 病例資料

患兒女，3歲2個月，以“咳嗽6d，發(fā)熱、皮疹1d，間斷抽搐半天”為代主訴入住我院兒童重癥監(jiān)護室(PICU)。偶咳黃黏痰，1d前出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹，熱峰39.8℃，熱型不規(guī)則，伴有全身散在皮疹，以軀干部為著，呈暗紅色出血性皰疹，凸出皮面，伴瘙癢；半天前突發(fā)抽搐，表現(xiàn)為意識喪失、雙眼向上凝視、雙手握拳、四肢僵直、面色青紫、口吐泡沫、持續(xù)約2min后緩解，緩解后入睡，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院頭顱CT未見明顯異常；3h前再次出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)同前，意識障礙進行性加重，出現(xiàn)昏迷，急診入我院PICU。病程中無呼吸困難、腹痛、大小便失禁等表現(xiàn)。飲食差，睡眠多，大便偏稀，小便正常，體質(zhì)量無變化。既往史、個人史、家族史未見異常。體格檢查：體溫37.7℃，脈搏161次/min，呼吸30次/min，體質(zhì)量14kg，血壓104/65mmHg(1mmHg=0.133kPa)，昏迷。全身較多紅色皮疹，以頭面部及軀干為著，呈圓形皰疹、斑丘疹及出血性皮疹，直徑0.2～0.5cm不等，較大者可達(dá)3.0cm，家屬訴有癢感、可見抓痕，凸出皮面，壓之不褪色，見圖1。頸抵抗，經(jīng)口氣管插管，心率增快。雙肺呼吸音粗，未聞及啰音，腹部查體未見明顯異常。毛細(xì)血管再充盈時間(CRT)6s、生理反射、病理反射未引出。Glasgow評分：刺激后無反應(yīng)1分、無運動反應(yīng)1分、無說話反應(yīng)1分。患兒血壓進行性下降至58/30mmHg，心率236次/min。輔助檢查：血常規(guī)：白細(xì)胞28.2×109/L，紅細(xì)胞4.54×1012/L，血紅蛋白127g/L，血小板74×109/L，中性粒細(xì)胞比值89.5%，淋巴細(xì)胞比值7.8%；超敏C反應(yīng)蛋白(CRP)370.7mg/L；免疫五項：補體C3 0.56g/L；降鈣素原(PCT)>100ng/ml；白介素6(IL-6)887.2pg/ml；乳酸3.0mmol/L；快速血氨35μmol/L；腎功能：尿素8.87mmol/L、尿酸596μmol/L；肝功能：白蛋白29.1g/L、谷丙轉(zhuǎn)氨酶130U/L、谷草轉(zhuǎn)氨酶281U/L；心肌酶：乳酸脫氫酶2 652U/L、肌酸激酶10 435U/L、肌酸激酶同工酶活力243U/L；B型鈉尿肽前體2 040pg/ml；凝血六項：凝血酶原時間22.7sec、凝血酶原活動度40%、活化部分凝血活酶時間71.9sec、纖維蛋白原425mg/dl、纖維蛋白降解產(chǎn)物151.1μg/ml、D二聚體59.6μg/ml；心臟彩超、胸部正位片未見明顯異常；血清嗜肺軍團菌血清1型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、2和3型IgM抗體均陰性；心肌酶標(biāo)志物：肌紅蛋白266.1ng/ml、肌鈣蛋白I 0.215ng/ml、CK同工酶質(zhì)量15.65ng/ml；血培養(yǎng)結(jié)果：唾液鏈球菌，藥敏：阿莫西林、氯霉素、美羅培南、利耐唑胺、萬古霉素敏感；腰椎穿刺：腦脊液壓力>200mmH2O(1mmH2O=0.098kPa)；常規(guī)：無色、清亮、無凝集、潘氏試驗陰性，有核細(xì)胞計數(shù)2×106/L；生化：氯122.8mmol/L、葡萄糖3.5mmol/L、腺苷脫氨酶1.3U/L、總蛋白193.7mg/L；頭顱MRS+增強：左側(cè)海馬MRS考慮抽搐后改變；24h視頻腦電圖：正常睡眠腦電圖。臨床診斷：(1)膿毒性休克；(2)皮疹查因：病毒性皮疹？(3)重癥病毒性腦炎。入院緊急給予擴容抗休克、血管活性藥物應(yīng)用、頭孢曲松抗細(xì)菌、阿昔洛韋抗病毒、補充凝血因子、人免疫球蛋白應(yīng)用、降顱壓、呼吸機輔助呼吸、營養(yǎng)神經(jīng)等治療；單重血漿置換(Plasma exchange ，PE)1次，連續(xù)性血液透析濾過 (Continuous veno-venous hemodiafiltration，CVVHDF )治療4d后患兒意識漸恢復(fù)正常，自主呼吸增強，逐步撤離呼吸機、停用血管活性藥物。住院第8天，感染指標(biāo)逐步恢復(fù)正常，但患兒皮疹仍未消退，皮膚科醫(yī)師會診考慮為膿皰瘡，行皮損處皮膚活檢，病理診斷：表皮角化過度，角質(zhì)層與表皮松解，可見大皰形成，表皮下結(jié)締組織增生伴玻璃樣變性，可見灶性炎細(xì)胞浸潤，見圖2。皮膚病理無明確指向性，血培養(yǎng)唾液鏈球菌不能解釋患兒皮疹情況。送檢5ml血液行mNGS(DNA+RNA)檢查，PathoSeqTM病原微生物宏基因組檢測報告：人類皰疹病毒3型(序列數(shù)59、相對豐度100%)。停用抗菌藥物，繼續(xù)阿昔洛韋抗病毒及對癥支持治療，動態(tài)復(fù)查血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、心肌酶、炎癥指標(biāo)均未見明顯異常，患兒神志恢復(fù)正常，精神好，未再抽搐，住院治療18d，皮疹基本消退，痊愈出院。住院期間該患兒父親感染水痘。最終診斷：(1)膿毒性休克；(2)出血性水痘；(3)重癥病毒性腦炎；(4)呼吸衰竭；(5)多臟器損傷；(6)彌散性血管內(nèi)凝血。

圖1 患兒皮損情況

圖2 患兒皮膚病理

2 討論

該患兒病情危重且進展迅速，感染唾液鏈球菌后引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，并迅速出現(xiàn)呼吸衰竭、組織低灌注、凝血功能障礙、肝臟、心臟損傷；病情進展為膿毒性休克，伴血壓進行性下降，為失代償期，有進一步加重出現(xiàn)多器官功能障礙的趨勢，符合兒科重癥血液凈化治療的應(yīng)用范疇[2]，及早治療是改善預(yù)后、降低病死率的關(guān)鍵。在嚴(yán)重膿毒癥患兒中進行血液凈化治療，CVVHDF是常用模式，主要清除中小分子物質(zhì)，聯(lián)合PE模式可清除致病的大分子物質(zhì)，改善凝血功能。其機制在于調(diào)節(jié)致炎和抗炎介質(zhì)濃度，下調(diào)炎性反應(yīng)，阻斷膿毒癥的細(xì)胞因子風(fēng)暴，阻止多器官功能衰竭的發(fā)生，改善機體血流動力學(xué)狀態(tài)、減少正性肌力藥物用量，提高存活率。

病原檢測是感染性疾病診斷的重要環(huán)節(jié)，該患兒血培養(yǎng)結(jié)果并不能解釋其全部臨床表現(xiàn)，皮膚科醫(yī)師的經(jīng)驗及皮膚活檢結(jié)果并未給出明確病原指向。尋求一種更好的檢測方法至關(guān)重要，高通量測序技術(shù)又稱為二代測序(NGS)，可同時對大量核酸片段進行檢測，將NGS應(yīng)用于臨床微生物檢測的研究方法稱為宏基因組二代測序[3]。mNGS直接從樣本中獲得病原體的核酸序列，再對獲得的核酸序列進行對比分析，不僅可以檢測已知病原體的基因組，還能從頭組裝未知微生物的基因組，對發(fā)現(xiàn)未知病原體感染有重要意義[4]。2019nCoV就是從2位成年患者的肺泡灌洗液中提取的核酸進行mNGS測序鑒定出來的[5]。

《中國宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識》的推薦意見：(1)懷疑血流感染，對于懷疑血流感染的患者，如有條件，推薦在抽取血培養(yǎng)標(biāo)本時同步留取2ml血標(biāo)本，分離血漿后保存于-16～20 ℃冰箱，血培養(yǎng)3d未報陽且經(jīng)驗性抗感染治療無效時，推薦對留存血標(biāo)本進行二代測序檢測。若未留標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本(A，Ⅱ)。(2)對于臨床疑似感染的危重患者，建議完善傳統(tǒng)實驗室及分資生物學(xué)檢測的同時，采集疑似感染部位的標(biāo)本進行二代測序(B，Ⅱ)[6]。共識推薦對于重癥感染患者早期采取二代測序檢測病原，推薦對血流感染的患者若血培養(yǎng)結(jié)果未報陽性結(jié)果且經(jīng)驗性治療無效時也可進行二代測序，依據(jù)共識該患兒可行二代測序檢測。

早期已經(jīng)開始的抗感染治療是否影響二代測序診斷性能，目前并無高質(zhì)量的研究證據(jù)，血流感染進行mNGS的時間窗并未確定。有研究證實發(fā)病1～2周后二代測序的陽性率仍高于血培養(yǎng)，但會隨著發(fā)病時間的延長，陽性率下降[7]。這也可解釋血培養(yǎng)中出現(xiàn)唾液鏈球菌，但mNGS卻未發(fā)現(xiàn)唾液鏈球菌，考慮與抗感染治療后細(xì)菌清除有關(guān)。這也恰恰為停用抗菌藥物、預(yù)防抗菌藥物濫用提供了依據(jù)，明確指導(dǎo)了下一步的抗病毒治療，本病例在治療后期應(yīng)用mNGS測序為精準(zhǔn)治療提供了有力支持。

關(guān)于mNGS檢測出的人類皰疹病毒3型，又稱為水痘—帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus，VzV)，是嗜神經(jīng)及皮膚的皰疹病毒，基因組為雙股DNA，感染兒童后多出現(xiàn)水痘，是一種具有高傳染性的出疹性疾病，皮疹特征為：全身皮膚黏膜成批出疹，皮疹呈向心性分布，斑丘疹、丘疹、皰疹、結(jié)痂同時存在。少數(shù)體弱或應(yīng)用免疫抑制劑治療者會出現(xiàn)重癥水痘，有出血性皰疹?；純焊赣H出現(xiàn)水痘表現(xiàn)，進一步證實了該患兒感染VzV病原。

總之，mNGS對于兒童感染性疾病的病原體診斷靈敏性高、檢測速度快，同時可以為某些病因未明病例提供更全面的病原檢測方法，被推薦為癥感染病例的早期檢測手段，也作為常規(guī)檢測陰性結(jié)果的補充檢測。疾病后期的mNGS檢測可能會為疾病的精準(zhǔn)治療提供有力證據(jù)。