慢性阻塞性肺疾病患者INOS、HIF-1α及PPAR-γ的表達(dá)及與氣流阻塞的相關(guān)性研究

王紀(jì)偉 孫曉麗 景小麗

鄭州陽(yáng)城醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南省登封市 452470

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由于氣道炎癥的存在，導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生病理生理改變，能進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭的慢性疾病[1]。炎癥細(xì)胞分泌高濃度蛋白酶和氧化產(chǎn)物引起的氧化應(yīng)激是COPD的主要發(fā)病機(jī)制，由于氣道分泌物增多，慢性咳嗽、咳痰、氣短和呼吸困難成為本癥典型癥狀[2]。

過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(Peroxisome proliferactor-activited receptors，PPARs)是核激素受體家族中的配體激活受體，目前已發(fā)現(xiàn)包括PPAR-α、PPAR-β/δ、PPAR-γ在內(nèi)的三個(gè)亞型[3]。PPAR-γ是重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在人體的脂肪組織、血管平滑肌組織、心肌組織中均有表達(dá)[4]。其中氣道上皮組織中的PPAR-γ可對(duì)細(xì)胞活素介導(dǎo)的誘生型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，INOS)的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，而INOS作為一種同工酶，當(dāng)其表達(dá)受到抑制時(shí)，其在免疫系統(tǒng)對(duì)抗病原體的能力也得到削弱[5]。此外，低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible，HIF-1)是一種調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α及HIF-1β兩個(gè)亞基組成[6]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在伴有不同程度缺氧的COPD患者中HIF-1出現(xiàn)異常表達(dá)，推測(cè)其與氣道炎癥、重塑及肺動(dòng)脈高壓等病理改變有密切關(guān)系[7]。目前關(guān)于INOS、HIF-1α及PPAR-γ在COPD患者中的表達(dá)及臨床意義存在諸多爭(zhēng)議，本研究通過(guò)研究COPD患者血清和肺組織中INOS、HIF-1α及PPAR-γ的表達(dá)和變化，并分析其與氣流阻塞之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析我院2018年9月—2019年9月因肺部占位性病變行支氣管鏡檢查的217例患者臨床資料，根據(jù)吸煙史、有無(wú)COPD史及肺功能檢查將受試者分為三組：A組(72例COPD患者)、B組(70例吸煙肺功能正常者)及C組(75例不吸煙肺功能正常者)，三組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，A組、B組吸煙指數(shù)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組一般資料比較

A組納入標(biāo)準(zhǔn)：滿(mǎn)足COPD診療標(biāo)準(zhǔn)[8]者；臨床資料完整者；無(wú)支氣管哮喘病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重重要器臟疾患者；合并除COPD以外的其他肺部疾病者；入組前3個(gè)月內(nèi)有呼吸、消化系統(tǒng)感染者。B、C組近2個(gè)月均無(wú)呼吸系統(tǒng)疾病史，且體格檢查、胸部X線攝片及肺通氣功能測(cè)定均未見(jiàn)異常。

1.2 研究方法 收集所有研究對(duì)象臨床資料，比較不同人群一般資料、肺功能指標(biāo)、INOS、HIF-1α及PPAR-γ表達(dá)的水平，并分析其與氣流阻塞程度的相關(guān)性。其中，通氣指標(biāo)[第1秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)及FEV1/FVC]以70%為界，分為≥70%和<70%, 而<70%部分又以依次遞減10%再分級(jí), 以此表達(dá)氣流阻塞的嚴(yán)重程度。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本收集：所有研究對(duì)象術(shù)前于空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5ml，離心(3 000r/min，15min)后取血清，并保存在-20℃冰柜中。術(shù)前霧化吸入2%利多卡因麻醉氣道，取仰臥位，給予鼻塞吸氧和心電監(jiān)護(hù)，支氣管鏡經(jīng)鼻腔進(jìn)入氣道，活檢部位選擇肺占位病變的對(duì)側(cè)葉支氣管間脊，鉗取組織置于多聚甲醛中固定、梯度酒精脫水、透明后石蠟包埋，做2μm厚切片以備免疫組織化學(xué)抗體染色用。

1.3.2 試劑：鼠抗人PPAP-γ一抗及兔抗人INOS、HIF-1α均購(gòu)自Santa cruze公司，即用型SP試劑盒、DAB染色試劑及蘇木素盒購(gòu)自北京中杉金橋有限公司。

1.3.3 免疫組化肺組織INOS、HIF-1α及PPAR-γ的表達(dá)：制備聚賴(lài)氨酸防脫切片，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)及山羊血清封閉。嚴(yán)格按照試劑盒檢查步驟，并進(jìn)行DAB染色、蘇木素復(fù)染，然后脫水封片。在顯微鏡400倍下用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性染色進(jìn)行分析，測(cè)定三者的平均吸光度值，隨機(jī)檢測(cè)4個(gè)高倍視野后計(jì)算平均值，作為該切片的代表值。

1.3.4 肺功能測(cè)定：COPD患者于早起時(shí)吸入支氣管擴(kuò)張劑后用肺功能儀檢測(cè)肺功能，反復(fù)檢測(cè)3次，取最高值，記錄FEV1、FVC及FEV1/FVC。

2 結(jié)果

2.1 三組肺功能比較 A組FEV1、FVC及FEV1/FVC較B組、C組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B(niǎo)、C組FEV1、FVC及FEV1/FVC比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 三組肺功能指標(biāo)比較

2.2 INOS、HIF-1α及PPAR-γ免疫組織化學(xué)平均吸光度值比較 A組和B組間INOS、HIF-1α及PPAR-γ表達(dá)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)；C組INOS、HIF-1α表達(dá)水平較A組、B組低，PPAR-γ表達(dá)水平較A組、B組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 三組INOS、HIF-1α及PPAR-γ免疫組織化學(xué)平均吸光度值比較

2.3 INOS、HIF-1α及PPAR-γ表達(dá)與肺功能相關(guān)性 PPAR-γ與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.05)，INOS、HIF-1α與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 INOS、HIF-1α及PPAR-γ表達(dá)與肺功能相關(guān)性分析

3 討論

COPD是一種常見(jiàn)的、治療耗資較高的可預(yù)防性慢性呼吸系統(tǒng)疾病，可對(duì)人們?nèi)粘Ｉ钅芰υ斐蓢?yán)重影響。在COPD的影響下，呼吸道中多個(gè)器官組織的結(jié)構(gòu)被破壞，可出現(xiàn)相應(yīng)的病理生理學(xué)改變[9]。其中持續(xù)的氣道阻塞是本病的主要特點(diǎn)，隨著COPD的進(jìn)展，長(zhǎng)期慢性缺氧可導(dǎo)致肺血管功能異常，造成肺循環(huán)的結(jié)構(gòu)重組[10]。因此對(duì)參與COPD氣道阻塞發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)指標(biāo)水平進(jìn)行研究，對(duì)評(píng)估患者疾病嚴(yán)重程度等方面有重要意義。

3.1 INOS與COPD 一氧化氮合酶為一種重要的同工酶，在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等中都有著廣泛的分布。INOS是一氧化氮合酶的亞型之一，其生物活性、調(diào)節(jié)方式等有一定的特性[11]。由于INOS為非鈣離子依賴(lài)型，在靜息細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子或免疫微生物刺激時(shí)則會(huì)催化合成大量一氧化氮[12]。而一氧化氮可參與機(jī)體氧化還原過(guò)程，并產(chǎn)生一氧化氮分子使血管擴(kuò)張，當(dāng)機(jī)體內(nèi)一氧化氮濃度高于生理濃度時(shí)，可造成嚴(yán)重的氧化損傷。此外，一氧化氮的代謝產(chǎn)物可活化基質(zhì)金屬蛋白酶，降解肺實(shí)質(zhì)的組分細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺氣腫等的發(fā)生，且此種作用機(jī)制在COPD的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。楊加鵬等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者INOS表達(dá)升高，認(rèn)為肺部無(wú)機(jī)物的賦存及INOS參與的相關(guān)信號(hào)通路的激活促進(jìn)了肺部病變的發(fā)生。另外在鼠實(shí)驗(yàn)[15]中也發(fā)現(xiàn)，注入高劑量羥基紅花黃色素A的大鼠INOS水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示，A組和B組患者INOS的表達(dá)均較C組強(qiáng)，通過(guò)相關(guān)性分析亦發(fā)現(xiàn)INOS與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。由此可證實(shí)，COPD患者支氣管黏膜中可分泌高濃度INOS，而INOS及其代謝物可使肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化，高濃度下可加重肺功能損傷，形成一個(gè)惡性循環(huán)。值得注意的是，吸煙能導(dǎo)致人體血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加，加速COPD的形成。

3.2 HIF-1α與COPD HIF-1α為具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜，包括炎癥發(fā)展、缺氧適應(yīng)及腫瘤生成等相關(guān)的靶基因[16]。當(dāng)其與相關(guān)的靶基因結(jié)合后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可產(chǎn)生一系列相應(yīng)的反應(yīng)，通常會(huì)給機(jī)體帶來(lái)病理性損害。近年來(lái)，關(guān)于COPD病理改變與HIF-1α的關(guān)系引起人們重視。由于HIF-1α可促進(jìn)趨化因子釋放介導(dǎo)氣道炎癥及起到重塑，改變氣道內(nèi)纖維功能，導(dǎo)致黏膜黏液的高分泌。鞠鑫鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)COPD合并肺部癌變組織HIF-1α呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肺組織勻漿HIF-1α與肺功能指標(biāo)負(fù)相關(guān)，并推測(cè)其與肺功能的異常改變有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在A組和B組的支氣管黏膜上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞的胞漿中表達(dá)增強(qiáng)，免疫組織化學(xué)平均吸光度值也高于C組(P<0.05)；進(jìn)一步通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1α與FEV1、FVC及FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示HIF-1α表達(dá)與COPD患者氣道阻塞關(guān)系密切。

3.3 PPAR-γ與COPD PPARs是一類(lèi)配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有N端區(qū)、居中高保守DNA結(jié)合區(qū)和C端的激素結(jié)合區(qū)。其配體通常為脂溶性分子，當(dāng)其與各自的配體結(jié)合后可引起機(jī)體的變化，促進(jìn)或抑制靶基因的表達(dá)。PPAR-γ作為其主要的亞型之一，與多種炎性細(xì)胞的活性和表達(dá)關(guān)系密切。其在原位支氣管氣道上皮細(xì)胞中有表達(dá)，可抑制此類(lèi)細(xì)胞的活性，并激活內(nèi)源性PPAR-γ，拮抗炎性反應(yīng)。Raoufy等[18]認(rèn)為PPAR-γ具有改變巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加巨噬細(xì)胞吞噬功能等作用，可促進(jìn)實(shí)用性免疫反應(yīng)的發(fā)生，減輕包括COPD在內(nèi)的多種疾病狀態(tài)。而李巧榮[19]發(fā)現(xiàn)吸煙可導(dǎo)致COPD患者及肺功能正常患者支氣管黏膜組織PPAR-γ表達(dá)增強(qiáng)，認(rèn)為其可能與煙草導(dǎo)致肺功能下降有關(guān)。而這基本與本研究關(guān)于PPAR-γ的結(jié)果一致，進(jìn)一步提示其表達(dá)可反映COPD患者氣道阻塞程度。

綜上所述，COPD患者INOS、HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)，而PPAR-γ表達(dá)減弱；INOS、HIF-1α及PPAR-γ與氣道阻塞有顯著的相關(guān)性，在誘導(dǎo)機(jī)體PPAR-γ的表達(dá)或提高其活性，對(duì)緩解COPD患者肺功能下降有一定作用，可作為臨床治療的新思路。