補(bǔ)腎益精法經(jīng)外泌體途徑對(duì)系統(tǒng)性硬皮病的血管保護(hù)作用研究

朱珂，謝頌苗，楊海詩(shī)，朱佳玲，李東海，齊慶

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116；3.東莞市中醫(yī)院，廣東東莞 523000；4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州 510260）

系統(tǒng)性硬皮?。╯ystemic scleroderma，SSc）是一種以多器官進(jìn)行性纖維化為主要表現(xiàn)的臨床疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要與血管損傷、免疫異常及纖維化有關(guān)[1]。血管損傷發(fā)生在SSc疾病的早期，血管損傷的范圍和程度直接影響疾病的進(jìn)展及預(yù)后。補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方是基于國(guó)醫(yī)大師鄧鐵濤教授“肺脾腎相關(guān)論”而擬定的方劑，具有補(bǔ)腎益精、健脾潤(rùn)肺、活血化瘀的功效。前期臨床及基礎(chǔ)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方可減輕SSc患者皮膚纖維化，改善患者微循環(huán)障礙，具有抑制纖維化及保護(hù)血管的療效。外泌體（exosome）是一種直徑為30～150 nm的胞外囊泡，其通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及核酸等物質(zhì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)及信息交換，是一種細(xì)胞之間非接觸的新型通訊方式[5]。外泌體攜帶的內(nèi)容物和功能可隨分泌細(xì)胞及所處微環(huán)境的變化而變化，其介導(dǎo)的信息傳遞是中藥發(fā)揮藥理效應(yīng)的重要途徑。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能障礙是SSc血管損傷的中心環(huán)節(jié)[6]，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的外泌體可以在一定程度上影響血管的修復(fù)及再生。中醫(yī)藥對(duì)SSc的治療作用是基于其對(duì)細(xì)胞功能及機(jī)體微環(huán)境的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，探究補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方能否通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體的功能發(fā)揮對(duì)SSc血管損傷的治療作用，對(duì)其臨床應(yīng)用及進(jìn)一步的機(jī)制研究具有重要意義?，F(xiàn)將本研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，6～8周齡，體質(zhì)量（190±5）g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量（20.0±1.5）g，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（粵）2011-0029。

1.2 細(xì)胞株人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），來(lái)源于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方，由阿膠10 g、山萸肉10 g、黃芪30 g、茯苓15 g、淮山藥30 g、熟地黃20 g、川紅花5 g組成，所有中藥材均購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。制備：用1 200 mL蒸餾水浸泡復(fù)方20 min，煮沸45 min后，收集過(guò)濾后的藥液，100℃水浴蒸發(fā)濃縮至134 mL（相當(dāng)于含生藥量0.9 g/mL）。

1.4 主要試劑與儀器TRIzol試劑（美國(guó)MRC公司）；血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）、白細(xì)胞表面分化抗原（CD）81、CD63多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Matrigel基質(zhì)膠（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；博來(lái)霉素粉劑（Aladin公司）；鼠抗血管生成素1（ANG-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管性假血友病因子（vWF）、CD31等一抗，兔抗鼠二抗[Rabbit Anti-Mouse IgG（H+L）-UNLB]（北京百奧博萊科技有限公司）。EPS-300電泳儀（天能公司）；NICOMP 380DLS納米粒徑分析儀（美國(guó)PSS公司）；JJ-12J病理組織脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；NIKONECLIPSEE100正置光學(xué)顯微鏡、NIKONDSU3成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.5 體外研究

1.5.1 大鼠血清制備 將10只SD大鼠分為藥物干預(yù)組和對(duì)照組。藥物干預(yù)組：按大鼠實(shí)際體質(zhì)量計(jì)算給藥量，每100 g體質(zhì)量給予相當(dāng)于1.8 g生藥量的補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方藥液灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。對(duì)照組：給予等體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。2組大鼠末次給藥3 h后，嚴(yán)格在無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈采血，離心，分離制備補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清和對(duì)照血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 用無(wú)血清DMEM-H培養(yǎng)基（10%FBS，1%P/S，pH=7.0～7.5）在37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞。將細(xì)胞分為2組，分別加入“1.5.1”項(xiàng)藥物干預(yù)組、對(duì)照組的大鼠血清培養(yǎng)48 h。

1.5.3 外泌體的分離、提取 收集HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，超速離心法分離提取外泌體。實(shí)驗(yàn)離心全程4℃，2 000×g離心30 min，去除死細(xì)胞，10 000×g離心45 min，去除細(xì)胞碎片。0.45μm一次性濾器收集上清，以100 000×g離心70 min，棄上清，沉淀，重懸，分裝，最后置于-80℃冰箱保存。

1.5.4 外泌體的鑒定 ①透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：將獲得的外泌體沉淀置于含體積分?jǐn)?shù)為2%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（PBS）中混懸，取混懸液置于電鏡銅網(wǎng)，干燥后以1%戊二醛固定，用0.4%醋酸雙氧鈾染色，甲基纖維素和醋酸雙氧鈾混合物染色并包被，置于透射電鏡下拍照觀察外泌體的形態(tài)。②Nano Analyzer法檢測(cè)外泌體徑粒與濃度：取5μL外泌體懸液稀釋到30μL，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器性能測(cè)試合格后，使用外泌體樣品上樣，獲得Nano Analyzer儀器檢測(cè)的外泌體粒徑和濃度信息。③Western Blot法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63、CD81和腫瘤易感基因（TSG101）表達(dá)：外泌體混懸液中加入Running buffer后變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體，電化學(xué)發(fā)光（ECL）A/B混合液顯影成像。

1.5.5 HUVEC細(xì)胞增殖和成管能力的測(cè)定 將HUVEC細(xì)胞分為2組，以DMEM-H無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，分別加入對(duì)照血清干預(yù)后HUVEC來(lái)源的外泌體和補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清干預(yù)后HUVEC來(lái)源的外泌體，作為對(duì)照血清-外泌體組和含藥血清-外泌體組，24 h后觀察2組HUVEC增殖情況。HUVEC增殖能力檢測(cè)：40 g/L多聚甲醛固定HUVEC后，取預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入3 mL Triton X-100；經(jīng)過(guò)3次PBS漂洗后再用5%山羊血清封閉，孵育一抗CD31（1∶200），4℃過(guò)夜；孵育二抗后PBS漂洗，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），暗室孵育；PBS漂洗，暗室中滴加抗熒光淬滅劑，共聚焦顯微鏡下觀察采集的圖像。HUVEC成管能力檢測(cè)：48孔板中加入100μL預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠，靜置30 min使膠凝固，將消化后的HUVEC懸液濃度調(diào)整到2×105個(gè)/mL，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，孔板蓋上蓋子，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 體內(nèi)研究

1.6.1 SSc小鼠造模及外泌體療效觀察 實(shí)驗(yàn)分組及處理：30只雌性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只，各組小鼠均選取背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛發(fā)。①正常組：每日以100μL生理鹽水，定點(diǎn)皮下注射，每天1次，共28 d；②SSc小鼠模型組：每日定點(diǎn)皮下注射100μL·mg-1·d-1博來(lái)霉素，每日1次，共28 d，并在第1、7天，額外皮下注射50μL外泌體溶液（PBS溶劑）；③外泌體治療組：每日定點(diǎn)皮下注射100μL·mg-1·d-1博來(lái)霉素，每日1次，共28 d，并在第1、7天，皮下注射補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清干預(yù)后HUVEC來(lái)源的外泌體懸液50μL。4周后處死小鼠，分離收取注射區(qū)皮膚組織進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠皮膚組織病理變化 分離小鼠注射處皮膚組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，HE染色，脫水，透明及封片，顯微鏡下觀察，并采集圖像及分析。

1.6.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)小鼠皮膚內(nèi)皮細(xì)胞ANG-1、VEGF、vWF、CD31表達(dá)情況 將小鼠皮膚標(biāo)本制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，加一抗，PBS漂洗3次，加二抗后PBS漂洗3次，DAB顯色后在顯微鏡下觀察，乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的提取與鑒定結(jié)果將所提取的外泌體置于透射電鏡下觀察，可見(jiàn)大小不等的圓形或類(lèi)圓形高亮膜性微囊泡，見(jiàn)圖1-A（箭頭所示即為外泌體）。納米顆粒示蹤分析（NTA）法測(cè)量外泌體粒徑-濃度分布：x軸及y軸分別表示外泌體的大小、密度，平均粒徑為96.6 nm，中位數(shù)粒徑為82.3 nm，粒子個(gè)數(shù)為6.9×107，粒徑主峰為76.2 nm，主峰所占百分比為98.1%。NTA結(jié)果顯示，外泌體直徑30～150 nm，平均約為96.6 nm，濃度為1.4×1013個(gè)/mL，見(jiàn)圖1-B。Western Blot結(jié)果顯示，所提取外泌體的標(biāo)志物TSG101、CD81、CD63呈高表達(dá)，見(jiàn)圖1-C。

2.2 補(bǔ)腎益精法通過(guò)外泌體途徑對(duì)HUVEC成管能力的影響補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清組內(nèi)皮細(xì)胞在3 h的成管分支數(shù)目對(duì)比對(duì)照血清組無(wú)顯著性差異（P=0.782），4、7 h的成管表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照血清組，分支數(shù)目多于對(duì)照血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，P=0.042）。具體結(jié)果見(jiàn)圖2-A、圖2-B。補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清組HUVEC在4、7 h的小管長(zhǎng)度高于對(duì)照血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022，P=0.034），表明補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清成管能力優(yōu)于對(duì)照血清。結(jié)果見(jiàn)表1。相對(duì)于對(duì)照血清-外泌體組，含藥血清-外泌體組的HUVEC成管較早，小管長(zhǎng)度及分支數(shù)目高于對(duì)照血清-外泌體組，但對(duì)照血清-外泌體組和含藥血清-外泌體組的HUVEC的成管表現(xiàn)均不及補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方含藥血清干預(yù)組顯著。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1 電鏡下外泌體超微結(jié)構(gòu)（A）、納米顆粒示蹤分析（NTA）結(jié)果（B）和外泌體標(biāo)志物Western Blot電泳條帶（C）圖Figure 1 Electron microscopic ultrastructure of exosomes（A），nanoparticle tracking analysis（NTA）results（B）and Western Blot bands of exosome markers（C）

2.3 補(bǔ)腎益精法通過(guò)外泌體途徑對(duì)HUVEC增殖能力的影響細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益精含藥血清組HUVEC的CD31的表達(dá)較對(duì)照血清組顯著增強(qiáng)，具體結(jié)果見(jiàn)圖4。含藥血清-外泌體組HUVEC的CD31的表達(dá)較對(duì)照血清-外泌體組顯著增強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

2.4 補(bǔ)腎益精法通過(guò)外泌體途徑對(duì)SSc小鼠皮膚血管損傷的影響正常組小鼠皮膚內(nèi)膠原纖維含量及膠原間隙正常，皮膚內(nèi)可見(jiàn)正常數(shù)量及結(jié)構(gòu)血管；模型組小鼠皮損區(qū)域膠原纖維增粗且排列緊密，血管數(shù)量減少，管腔狹窄；與模型組比較，外泌體治療組小鼠皮膚內(nèi)膠原纖維含量有所減少，膠原間間隙有所增寬，血管數(shù)量增多，管腔結(jié)構(gòu)正常。結(jié)果見(jiàn)圖6。與正常組比較，模型組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF及CD31表達(dá)水平明顯降低；外泌體治療組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF、CD31表達(dá)水平顯著高于模型組，較正常組有所降低。結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖2 對(duì)照血清組與含藥血清組HUVEC的成管能力Figure 2 The tube-forming ability of HUVEC in the control serum group and drug-containing serum group

表1 對(duì)照組血清與含藥血清組HUVEC小管長(zhǎng)度的比較Table 1 Comparison of the length of HUVEC tubules in the control serum group and drug-containing serum group（±s，mm；n=3）

表1 對(duì)照組血清與含藥血清組HUVEC小管長(zhǎng)度的比較Table 1 Comparison of the length of HUVEC tubules in the control serum group and drug-containing serum group（±s，mm；n=3）

①P＜0.05，與對(duì)照血清組比較

組別對(duì)照血清組含藥血清組3 h 29 449.33±901.16 29 681.00±1 010.38 4 h 32 420.33±1 425.94 35 934.00±885.11①7 h 31 663.67±1 377.95 34 520.67±732.31①

圖3 對(duì)照血清-外泌體組與含藥血清-外泌體組HUVEC的成管能力（×200）Figure 3 The tube-forming ability of HUVEC in the controlserum-exosome group and drug-containing serum-exosome group（×200）

圖4 對(duì)照血清組與含藥血清組HUVEC的CD31表達(dá)（免疫熒光染色，×200）Figure 4 The CD31 expression in HUVEC in the controlserum group and drug-containing serum group（by immunofluorescence staining，×200）

圖5 對(duì)照血清-外泌體組與含藥血清-外泌體組HUVEC的CD31表達(dá)（免疫熒光染色，×400）Figure 5 The CD31 expression in HUVEC in the controlserum-exosome group and drug-containing serum-exosome group（by immunofluorescence staining，×400）

圖6 各組小鼠皮膚組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 6 Comparison of the histopathologicalmorphologicalfeatures of the skin tissues between various groups of mice（by HE staining，×200）

3 討論

系統(tǒng)性硬皮?。⊿Sc）是一種少見(jiàn)、難治的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制主要與免疫異常、纖維化和血管病變有關(guān)。硬皮病歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，國(guó)醫(yī)大師鄧鐵濤教授認(rèn)為“肺脾腎氣陰不足，五臟俱虛”是本病的重要病機(jī)[7]，治療應(yīng)以肺脾腎同治、補(bǔ)腎益精為主。補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方是本課題組根據(jù)鄧鐵濤教授辨治硬皮病思路制定的SSc臨床治療方劑，全方以補(bǔ)腎益精為主，兼以健脾潤(rùn)肺。血管病變發(fā)生于SSc早期，其中，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與功能障礙是血管病變的中心環(huán)節(jié)。血管微環(huán)境的變化可激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1信號(hào)通路誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT），進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)量的膠原蛋白及細(xì)胞間質(zhì)，導(dǎo)致組織和器官纖維化[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方可通過(guò)干預(yù)Fli1表達(dá)調(diào)控TGF-β信號(hào)抑制SSc血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT，可通過(guò)拮抗Snail介導(dǎo)的EndMT所參與的纖維增生性閉塞性血管損傷發(fā)揮血管保護(hù)作用[9-10]。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討并證實(shí)了補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方可基于對(duì)血管微環(huán)境與外泌體功能的調(diào)節(jié)作用治療SSc血管損傷。

圖7 各組小鼠皮膚組織ANG-1、VEGF、vWF、CD31陽(yáng)性表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 7 Comparison of positive expression of ANG-1，VEGF，vWF and CD31 in skin tissues between various groups of mice（by Immunohistochemistry，×200）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)對(duì)腎、髓、血、脈之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)基本一致。中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨，生髓主腦，髓生血”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等與血管生成關(guān)系密切的功能細(xì)胞是由骨髓化生而來(lái)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示，補(bǔ)腎中藥可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)血管修復(fù)與新生[11]?？梢?jiàn)，“腎”在血管形成及血液生成方面起著重要作用。有學(xué)者在研究補(bǔ)腎復(fù)方與血管生成相關(guān)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上提出“補(bǔ)腎生脈”之說(shuō)[12]，認(rèn)為“補(bǔ)腎生脈”的過(guò)程中，內(nèi)皮祖細(xì)胞可能起到關(guān)鍵的橋梁作用。本研究中，我們也觀察到，補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方促進(jìn)SSc血管修復(fù)之功效可通過(guò)直接影響內(nèi)皮細(xì)胞功能或經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞源性外泌體的介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)，可見(jiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的功能狀態(tài)是決定補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方治療SSc血管損傷療效的關(guān)鍵因素。

外泌體是由細(xì)胞分泌的一種攜帶蛋白、RNA等多種活性物質(zhì)的胞外囊泡，可介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞功能。外泌體的功能及內(nèi)容物隨其分泌細(xì)胞的變化而變化，而微環(huán)境的變化可影響細(xì)胞及外泌體的功能[13]。中藥復(fù)方通過(guò)發(fā)揮辨證論治和整體治療的優(yōu)勢(shì)，能夠調(diào)整人體陰陽(yáng)虛實(shí)，達(dá)到陰平陽(yáng)秘的狀態(tài)；同時(shí)，現(xiàn)代研究顯示中藥單體或復(fù)方能夠通過(guò)改變局部微環(huán)境，延緩或改善疾病狀態(tài)[14]。既往研究表明：治療糖尿病腎病的保腎通絡(luò)方通過(guò)降低外泌體內(nèi)miR-192的表達(dá)水平抑制腎纖維化的發(fā)生[15]；健脾消癌方降低由外泌體及TGF-β1誘導(dǎo)的正常人胚肺成纖維細(xì)胞（HFL1）活化，抑制結(jié)腸癌肺部轉(zhuǎn)移[16]；滋陰化痰方通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體抑制胃癌細(xì)胞的血管生成[17]。在本研究中，我們得出了類(lèi)似的結(jié)果，補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方可以通過(guò)影響HUVEC來(lái)源的外泌體功能，通過(guò)外泌體途徑促進(jìn)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、成管能力及硬皮病小鼠皮膚血管的再生修復(fù)，提高ANG-1、VEGF、vWF等重要促血管生成因子的表達(dá)水平。

外泌體介導(dǎo)的效應(yīng)基于其內(nèi)部所攜帶物質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。有研究[18]表明，攜帶miR-151-5P的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體，經(jīng)受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接收后，可下調(diào)受體細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路，進(jìn)而改善SSc小鼠骨量減少、皮膚緊繃及免疫紊亂的表現(xiàn)。此外，有研究[19]顯示，伴有血管損害的SSc患者血清中外泌體水平較正常者低，但局部皮損處成纖維細(xì)胞中的外泌體標(biāo)志物（CD63、CD9及CD81）的表達(dá)水平卻較正常成纖維細(xì)胞顯著增高，提示血管功能的異?？捎绊懲饷隗w的組織分布。本研究雖明確了外泌體可介導(dǎo)補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方對(duì)SSc的血管保護(hù)作用，但其具體作用方式及分子機(jī)制尚不明確，有待深入研究。由于早期血管損傷是SSc疾病進(jìn)展加重的重要因素，故本研究中，我們選擇小鼠造模第1、7天給予外泌體干預(yù)，以觀察外泌體對(duì)早期血管損傷的保護(hù)作用。盡管明確了外泌體可介導(dǎo)補(bǔ)腎益精中藥復(fù)方對(duì)SSc早期血管損傷的保護(hù)作用，但不同濃度及不同治療頻率外泌體的療效差異尚不明確，亦有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)了補(bǔ)腎益精法的血管保護(hù)作用可由血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體介導(dǎo)，但該研究目前僅限于觀察性研究，具體的作用途徑及機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探索。