逍遙散對(duì)卒中后抑郁大鼠的治療機(jī)制研究

付劭靜，周延華，卑紅喆，姜連堃，楊月明

[1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古包頭 014000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院）藥劑科，內(nèi)蒙古包頭 014000]

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）屬于卒中后的一種多發(fā)性、情感性精神障礙類疾病，典型的臨床表現(xiàn)包括情緒低落、嚴(yán)重失眠、頭暈頭痛、腸胃不適、記憶力下降、暴躁易怒等。有數(shù)據(jù)[1-2]顯示，PSD越來(lái)越常見(jiàn)，發(fā)生率不減反增。與非抑郁患者相比，PSD患者病情進(jìn)展更快，研究[1，3]表明，PSD可增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)及病死率。在PSD治療中有效緩解患者抑郁狀態(tài)對(duì)疾病控制和病情康復(fù)有重要的臨床意義。中醫(yī)藥具有相對(duì)安全、多效應(yīng)、效果持久等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。經(jīng)典方劑逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾功效，為中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域首選抗抑郁的中藥復(fù)方[4]。已有研究[5-7]表明逍遙散發(fā)揮抗抑郁作用，可被用于治療應(yīng)激誘發(fā)的精神性疾病，諸如偏頭痛、抑郁焦慮、失眠癥以及帕金森病等。本研究通過(guò)構(gòu)建PSD大鼠模型，進(jìn)一步探討逍遙散的干預(yù)機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用治療PSD提供參考依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只SPF級(jí)U14品系雄性SD大鼠，30周齡，體質(zhì)量320～350 g，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蒙）20030001。飼養(yǎng)環(huán)境和條件：飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，每籠5只（7 d后，對(duì)于隨機(jī)選取的擬造模大鼠采取單籠飼養(yǎng)），飼養(yǎng)溫度控制在25℃，相對(duì)濕度控制在53%～55%，通風(fēng)換氣10次/h，光照、黑暗按照12 h/12 h交替變化，期間大鼠自由獲取食物和水。

1.2 藥物逍遙散組成：北柴胡、白芍、當(dāng)歸、白術(shù)、茯苓各30 g，薄荷、煨姜各10 g，炙甘草15 g。以上中藥材均購(gòu)自內(nèi)蒙古東誠(chéng)中藥有限公司，由本院中藥研究中心專業(yè)姜連堃中藥師鑒定。常規(guī)方法煮沸、濃縮至實(shí)驗(yàn)?zāi)康臐舛取?/p>

1.3 試劑與儀器尼氏染色法試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；一氧化氮合酶（iNOS）、白細(xì)胞介素10（IL-10）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測(cè)試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；五羥色胺（5-HT）、五羥吲哚丁酸（5-HIAA）ELISA檢測(cè)試劑盒由天津市廣成化學(xué)試劑有限公司提供；兔抗鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1（GLT-1）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、Caspase-9和Caspase-3及其剪切體、GAPDH等抗體由美國(guó)Abcam公司提供；羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）由美國(guó)Abcam公司提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白免疫印跡（Western Blot）化學(xué)發(fā)光試劑盒由美國(guó)Thermo公司提供；Bradford蛋白定量試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；TRIzol RNA提取試劑由美國(guó)Gibco公司提供。酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo公司提供；光學(xué)顯微鏡由日本Nikon公司提供；凝膠成像分析儀由法國(guó)Vilber Lourm公司提供；紫外分光光度計(jì)由美國(guó)Beckman公司提供）；電泳儀和電泳槽，由北京索萊寶科技有限公司提供。

1.4 PSD大鼠模型的建立造模方法參考賀旭等[8]方法，采用四血管阻斷法構(gòu)建大鼠缺血性腦卒中模型。四血管阻斷法：1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于腦立體定位儀臺(tái)面，沿頸部正中線一側(cè)行手術(shù)切口，鈍性分離頸部?jī)蓚?cè)頸總動(dòng)脈，電凝大鼠兩側(cè)椎動(dòng)脈，第2天采用乙醚吸入麻醉，外科縫線拉出頸總動(dòng)脈，微動(dòng)脈夾阻塞血管30 min后再灌注。若大鼠出現(xiàn)瞳孔放大、呼吸加深、翻正反射消失，則判斷卒中模型制作成功[8]。卒中模型制作成功7 d后，采用社會(huì)隔離+慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（CUMS）方法制備PSD大鼠模型。CUMS方法主要包括禁食水、束縛、噪音、夾尾、冰水、熱水、傾斜、異物等各種不同的應(yīng)激刺激，每日1種刺激，連續(xù)6周，隨機(jī)交替進(jìn)行。

1.5 給藥與分組將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及逍遙散低、中、高劑量組，每組各10只，另將剩余的10只大鼠設(shè)為正常組。造模的同時(shí)，逍遙散低、中、高劑量組分別對(duì)應(yīng)給予4.5、9、18 g·kg-1·d-1（生藥）逍遙散煎劑灌胃，正常組、模型組灌胃等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥6周。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 采用Zea-Longa法[9]評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能損傷情況 采用Zea-Longa 5級(jí)評(píng)分法，分值范圍為0～4分，分值高低與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)，其中0分表示正常，1分表示左前肢不能完全伸展，2分表示向左轉(zhuǎn)圈，3分表示向左傾倒，4分表示意識(shí)喪失，不能行走。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化 頸椎脫臼法處死大鼠，于冰上解剖取出腦組織，40 g/L多聚甲醛固定，依次脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織病理形態(tài)學(xué)變化情況，拍照記錄。

1.6.3 尼氏染色法檢測(cè)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 按照上述“1.6.2”項(xiàng)中同樣方法制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，用50℃甲苯胺藍(lán)水溶液浸染15 min后，立即用水洗一遍，然后按照常規(guī)方法進(jìn)行脫水，依次二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別透明10 min，封片，最后于顯微鏡下觀察和拍照。

1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血液中iNOS、TNF-α、IL-10和腦組織5-HT及其代謝物5-HIAA水平 具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.6.5 Western Blot法檢測(cè)腦組織GLT-1、BDNF，Caspase通路相關(guān)蛋白（Caspase-9、Caspase-3及其剪切體）等蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取出凍存的腦組織，提取總蛋白，BCA定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉；分別加入稀釋后的一抗GLT-1、BDNF、Caspase-9及其剪切體、Caspase-3及其剪切體以及GAPDH（除GAPDH以1∶100稀釋外，其余抗體均以1∶1 000稀釋），4℃冰箱孵育過(guò)夜；TBST洗3～5次，15 min/次，室溫孵育二抗1 h；TBST洗3～5次，15 min/次，利用Western Blot化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色和拍照。最后采用凝膠成像分析儀掃描各Western Blot條帶灰度值并進(jìn)行分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度值比值表示。

1.6.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）mRNA表達(dá)水平 SOD上游引物序列為5’-CTTCC TCCCTTTAACTTATCCATTCAC-3’，下游引物序列為5’-CTCTTCCTCCACCATTACCAACAATAC-3’；MDA上游引物序列為5’-CAGGAAACAGCTATGA CC-3’，下游引物序列為5’-TGTAAAACGACGGC CAGT-3’。提取腦組織總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以20μL反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系：1×SYBR Green I master-mix、0.5μmol/L特異反向引物、0.5μmol/L特異前向引物、1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s，共循環(huán)40次。應(yīng)用ABI 7600儀器進(jìn)行RT-PCR，樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化比較圖2結(jié)果顯示：正常組海馬組織細(xì)胞界限、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如核膜、核仁等）均清晰可見(jiàn)，海馬錐體細(xì)胞排列較為緊密，間質(zhì)無(wú)水腫，細(xì)胞核圓又大、染色淡；模型組海馬組織細(xì)胞界限模糊，海馬錐體細(xì)胞排列混亂、模糊，部分細(xì)胞核發(fā)生皺縮，染色較深，間質(zhì)有水腫現(xiàn)象；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組腦組織病理形態(tài)均得到不同程度的改善，其中逍遙散高劑量組最優(yōu)、逍遙散中劑量組次之。

2.3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較圖3結(jié)果顯示：正常組可見(jiàn)較多的尼氏小體；模型組、逍遙散低劑量組幾乎沒(méi)有尼氏小體；逍遙散中劑量組、逍遙散高劑量組可見(jiàn)較多的尼氏小體，且逍遙散高劑量組較逍遙散中劑量組可見(jiàn)更多的尼氏小體。

2.4 各組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量比較圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（±s）Figure 1 Comparison of neurological deficit scores between various groups of rats（±s）

2.5 各組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比較圖5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠血清iNOS、TNF-α含量均顯著降低，IL-10含量均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色）Figure 2 Comparison of histomorphological changes in the brain tissue between various groups of rats（by HE staining）

圖3 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較（尼氏染色）Figure 3 Comparison of apoptosis of neuralcells in brain tissue between various groups of rats（by Nisslstaining）

2.6 各組大鼠腦組織SOD、MDA mRNA表達(dá)比較圖6結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組腦組織SOD mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），MDA mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組腦組織SOD mRNA表達(dá)水平均顯著升高，MDA mRNA表達(dá)水平均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腦組織5-HT、5-HIAA含量比較（±s）Figure 4 Comparison of 5-HT and 5-HIAA contents in brain tissue in various groups of rats（±s）

2.7 各組大鼠腦組織Caspase-9、Caspase-3及其剪切體表達(dá)情況比較圖7結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織Cleaved Caspase-9/Caspase-9、Cleaved Caspase-3/Caspase-3水平均顯著降低，其中，逍遙散中、高劑量組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.8 各組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)比較圖8結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，逍遙散低、中、高劑量組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高，其中，逍遙散中、高劑量組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠血清iNOS、TNF-α、IL-10含量比較（±s）Figure 5 Comparison of serum iNOS，TNF-αand IL-10 levels in various groups of rats（±s）

圖6 各組大鼠腦組織SOD、MDA mRNA表達(dá)比較（±s）Figure 6 Comparison of SOD and MDA mRNA expression in brain tissue between various groups of rats（±s）

圖7 各組大鼠腦組織Caspase-9、Caspase-3及其剪切體表達(dá)情況比較（±s）Figure 7 Comparison of expression of Caspase-9，Caspase-3 and their shedders in various groups of rats（±s）

圖8 各組大鼠腦組織GLT-1、BDNF蛋白表達(dá)比較（±s）Figure 8 Comparison of GLT-1 and BDNF protein expression in brain tissue in various groups of rats（±s）

3 討論

對(duì)于卒中后抑郁（PSD）患者需重視抗抑郁治療[1-3]。PSD發(fā)病機(jī)制涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多方面。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦組織出現(xiàn)不同程度的病理學(xué)形態(tài)變化，推測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷與抑郁癥發(fā)病有關(guān)，而凋亡是神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要形式之一[10-11]。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激刺激可以降低機(jī)體本身神經(jīng)元水平，同時(shí)會(huì)降低機(jī)體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，終致抑郁。5-HT為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)分子，5-HIAA是5-HT代謝終產(chǎn)物之一，無(wú)生物學(xué)活性。5-HT參與調(diào)控人類多種行為學(xué)現(xiàn)象，與抑郁焦慮、暴躁等性格問(wèn)題關(guān)聯(lián)密切[13]。又有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[14]指出，抑郁癥患者的免疫功能會(huì)發(fā)生一定程度的變化，主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)過(guò)度活躍，諸如細(xì)胞因子釋放增多、急性炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)，身體或心理應(yīng)激將誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞因子釋放量增多，給予大鼠心理應(yīng)激30 min后可檢測(cè)到IL-10、TNF-α水平急劇上升的狀態(tài)，上升幅度與給予的刺激時(shí)間和刺激強(qiáng)度呈正相關(guān)。iNOS、IL-10、TNF-α等是細(xì)胞內(nèi)典型的炎性反應(yīng)因子，參與調(diào)控發(fā)熱、進(jìn)食、睡眠、感染等過(guò)程，有文獻(xiàn)研究[15]表明其水平過(guò)高與情緒低落、抑郁以及精神分裂等情感障礙相關(guān)。GLT-1是機(jī)體內(nèi)清除突觸間隙過(guò)高濃度谷氨酸的重要蛋白，可保護(hù)神經(jīng)元免受神經(jīng)毒性損害[16]。BDNF是機(jī)體細(xì)胞內(nèi)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白分子，可促進(jìn)外周神經(jīng)元存活和分化。研究[17]表明，BDNF在中樞神經(jīng)元呈泛表達(dá)，有參與維持神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及行為學(xué)調(diào)控的功能，與人類精神性疾病相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠腦組織海馬細(xì)胞排列紊亂無(wú)序，細(xì)胞界限以及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核發(fā)生皺縮，未見(jiàn)尼氏小體；模型組大鼠Zea-Longa評(píng)分，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9剪切蛋白、Caspase-3剪切蛋白，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA及炎癥因子iNOS水平均顯著高于正常組，GLT-1、BDNF、5-HT、5-HIAA、SOD水平均顯著低于正常組。表明PSD模型大鼠發(fā)生了神經(jīng)細(xì)胞突質(zhì)性病變，PSD并非完全是功能性主觀性疾病，與腦組織海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷以及氧化應(yīng)激損傷同樣有一定的關(guān)聯(lián)。而逍遙散組腦組織損傷以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)均有不同程度改善，表明給予PSD模型大鼠逍遙散干預(yù)可修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠促炎因子iNOS、TNF-α，抑炎因子IL-10水平較正常組均顯著升高，逍遙散組可下調(diào)iNOS、TNF-α水平，上調(diào)IL-10水平，表明逍遙散可改善PSD大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，逍遙散可通過(guò)抑制PSD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌，改善免疫功能和氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮抗抑郁作用。但本研究存在一定局限性，由于時(shí)間限制和經(jīng)費(fèi)限制，未設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，研究結(jié)果可能有一定偏倚，有待進(jìn)一步完善。