五味子提取物對(duì)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元損傷的修復(fù)作用及其機(jī)制

劉美華，王素榮，劉平，郝正燕

（1.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東菏澤 274000；2.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院藥學(xué)科，山東菏澤 274000）

抑郁癥是一種精神障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為情緒消沉、思維遲鈍、語(yǔ)言行動(dòng)減少等，快感缺乏、動(dòng)力低下是其主要癥狀。隨著生活節(jié)奏加快，競(jìng)爭(zhēng)壓力加大，抑郁癥患病率迅速升高[1]。目前，臨床上常用的抗抑郁癥西藥類(lèi)，雖具有一定的改善效果，但同時(shí)存在耐藥性及伴有多種不良反應(yīng)等問(wèn)題[2]。而五味子為補(bǔ)虛固本中藥，具有收斂固澀、益氣生津、寧心安神的功效，作為保健食品的原料被廣泛應(yīng)用于心悸失眠、津少口渴、體虛多汗等癥的治療[3]。有研究[4-6]表明，五味子及其提取物有鎮(zhèn)靜、催眠和抗焦慮作用。但有關(guān)五味子及其提取物更確切的抗抑郁作用機(jī)制仍不甚清楚。janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）信號(hào)通路參與多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性突觸功能，是引起長(zhǎng)期抑郁的關(guān)鍵通路[7]。因此，本研究通過(guò)建立慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，觀察五味子提取物對(duì)抑郁癥大鼠的治療作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為五味子藥物的開(kāi)發(fā)和抑郁癥的臨床治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50只清潔級(jí)SD雄性大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度為（65±5）%，光照周期12 h/12 h。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)前曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不存在明顯差異。

1.2 藥物、試劑與儀器五味子提取物（五味子總素≥25.0%，五味子乙素≥18.0%，五味子甲素≥6.3%，五味子酯甲+五味子醇甲+五味子醇乙≥0.7%），陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：190617。羧甲基纖維素鈉（sodium carboxylmethyl cellulose，CMC-Na）（西安鴻朗生物科技有限公司）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（北京中杉試劑公司）；兔抗大鼠JAK1單克隆抗體、磷酸化JAK1（p-JAK1）單克隆抗體、STAT3單克隆抗體、磷酸化STAT3（p-STAT3）單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國(guó)Abcam公司）。Lightcycler480 PCR儀（瑞士羅氏公司）；微型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 造模與分組隨機(jī)取40只大鼠單籠孤養(yǎng)，參照文獻(xiàn)方法[8]并加以改進(jìn)，建立CUMS抑郁大鼠模型。方法：大鼠接受不同應(yīng)激刺激，包括4℃冰水游泳5 min、禁食禁水24 h、45℃熱應(yīng)激5 min、夾尾1 min、晝夜顛倒、濕墊料24 h、噪音1 h（1 500 Hz，92 dB）、搖晃（1次/s，15 min）等，每日接受1～2種，同種刺激不能連續(xù)2次出現(xiàn)，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，連續(xù)刺激21 d。若大鼠出現(xiàn)飲水減少、體質(zhì)量減輕、毛色晦暗、探索行為減少等癥狀，則提示建模成功[9]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，五味子提取物低、中、高劑量組，每組各10只。剩余10只大鼠按單籠2只混養(yǎng)，作為正常組，正常飼養(yǎng)，不給任何刺激。

1.4 給藥方法從造模第1天開(kāi)始，按照動(dòng)物與人體間的等效劑量換算[10]并參照以往文獻(xiàn)研究[11]用量，五味子提取物低、中、高劑量組分別以100、200、400 mg·kg-1·d-1劑量灌胃五味子提取物（溶解于0.5%CMC-Na），正常組和模型組灌胃等體積0.5%CMC-Na，每日1次，連續(xù)21 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 造模結(jié)束2 h后，參照文獻(xiàn)研究[12]將各組大鼠逐個(gè)置于曠場(chǎng)箱內(nèi)，曠場(chǎng)箱大小為80 cm×80 cm×40 cm，箱底由25塊16 cm×16 cm的正方形組成，內(nèi)壁和箱底均涂為黑色，上方安裝攝像頭，實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于曠場(chǎng)箱內(nèi)適應(yīng)10 min。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后將大鼠置于曠場(chǎng)箱內(nèi)，觀察其活動(dòng)情況并錄像，每只大鼠記錄5 min水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)情況。水平活動(dòng)得分以大鼠穿越箱底正方形塊數(shù)計(jì)，跨一格計(jì)1分；垂直活動(dòng)得分以大鼠前爪離地、后爪直立次數(shù)計(jì)，每次計(jì)1分。上只大鼠測(cè)試完畢后將糞便清理干凈，用酒精清潔箱底后再測(cè)試下只大鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)錄像回放，記錄每組大鼠活動(dòng)得分。

1.5.2 蔗糖偏好實(shí)驗(yàn) 造模結(jié)束24 h后，每只大鼠孤籠飼養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)研究[13]方法，實(shí)驗(yàn)前72 h訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水，給予大鼠飲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖水。第1個(gè)24 h每籠放置2瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖水，第2個(gè)24 h每籠放置1瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖水和1瓶純凈水，2個(gè)水瓶外觀相同，水瓶位置隨機(jī)擺放，第3個(gè)24 h禁食禁水。之后每只大鼠同時(shí)給予1瓶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蔗糖水和1瓶純凈水，放置前稱(chēng)質(zhì)量定量，12 h后記錄大鼠純凈水和蔗糖水消耗量。1%蔗糖水消耗率（%）=1%蔗糖水消耗量/1%蔗糖水消耗量+純凈水消耗量。

1.5.3 尼氏染色法 糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取右側(cè)海馬組織固定，進(jìn)行低溫冰凍切片，二甲苯脫脂，逆行濃度梯度乙醇脫脂，用蒸餾水沖洗2 min，尼氏染色液染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，95%乙醇沖洗，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯溶液透明，中性助教封片后，顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.5.4 TUNEL染色法 海馬組織切片后按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色：切片脫蠟，水化；蛋白酶K室溫處理20 min；PBS漂洗3次后滴加TUNEL反應(yīng)液，暗盒37℃反應(yīng)1 h；PBS漂洗3次后滴加轉(zhuǎn)化劑POD，37℃反應(yīng)30 min；PBS漂洗3次，滴加DAB底物溶液，25℃反應(yīng)10 min，PBS漂洗3次，常規(guī)封片鏡檢。每只大鼠選擇3張海馬CA3區(qū)切片，每張選擇5個(gè)視野進(jìn)行鏡檢，計(jì)算神經(jīng)元凋亡百分率。神經(jīng)元凋亡率（%）=凋亡神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)×100%。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法 取左側(cè)海馬組織80 mg，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，研磨后冰上裂解30 min，離心取上清；加熱變性10 min，冷卻后用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)蛋白濃度；配制凝膠，樣品加入上樣緩沖液混勻，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），30 min后將蛋白冰上轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；轉(zhuǎn)膜后TBST溶液漂洗10 min×3次，置于搖床室溫封閉2 h；將膜分別放入JAK1（1∶1 000稀釋?zhuān)?、p-JAK1（1∶1 000稀釋?zhuān)?、STAT3（1∶1 000稀釋?zhuān)?、p-STAT3（1∶1 000稀釋?zhuān)┑纫豢瓜♂屢褐袚u床4℃孵育過(guò)夜；TBST溶液漂洗10 min×3次，將膜放入二抗稀釋液（1∶2 000稀釋?zhuān)u床室溫孵育1 h；TBST溶液漂洗10 min×3次，加入電化學(xué)發(fā)光液（ECL），暗室顯影、定影、掃描。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度/內(nèi)參β-actin條帶灰度表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較與正常組比較，模型組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分均降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分均升高，五味子提取物高劑量組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分高于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠1%蔗糖水消耗率比較正常組、模型組、五味子提取物低劑量組、五味子提取物中劑量組、五味子提取物高劑量組1%蔗糖水消耗率分別為（83.16±8.54）%、（52.67±6.01）%、（61.54±6.51）%、（68.26±7.53）%、（75.49±7.37）%。與正常組比較，模型組1%蔗糖水消耗率降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組1%蔗糖水消耗率均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組1%蔗糖水消耗率均升高（P＜0.05），且五味子提取物高劑量組1%蔗糖水消耗率高于中劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較Table 1 Comparison of horizontalmovement and verticalmovement scores between various groups of rats（±s，分）

表1 各組大鼠水平運(yùn)動(dòng)和垂直運(yùn)動(dòng)得分比較Table 1 Comparison of horizontalmovement and verticalmovement scores between various groups of rats（±s，分）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與五味子提取物低劑量組比較；④P＜0.05，與五味子提取物中劑量組比較

組別正常組模型組五味子提取物低劑量組五味子提取物中劑量組五味子提取物高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10水平運(yùn)動(dòng)35.10±3.78 8.50±0.97①15.20±1.87②21.30±2.48②③27.60±2.82②③④164.067＜0.001垂直運(yùn)動(dòng)13.30±1.34 5.20±0.67①7.50±0.81②9.40±1.02②③11.70±1.31②③④92.247＜0.001

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化比較正常組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)正常，未見(jiàn)明顯壞死；模型組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元萎縮、排列紊亂稀疏，壞死神經(jīng)元較多；五味子提取物各劑量組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則，壞死神經(jīng)元較少，均較模型組有不同程度恢復(fù)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率比較正常組、模型組、五味子提取物低劑量組、五味子提取物中劑量組、五味子提取物高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡率分別為（5.15±1.34）%、（43.68±3.47）%、（25.26±3.19）%、（15.21±2.77）%、（10.33±2.13）%。與正常組比較，模型組海馬神經(jīng)元凋亡率均升高（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡率均降低（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡率均降低（P＜0.05），五味子提取物高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡率低于中劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化比較（尼氏染色，×200）Figure 1 Comparison of morphologicalchanges of hippocampalneurons between various groups of rats（by Nissl’s staining，×200）

圖2 各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡情況比較（TUNEL法，×200）Figure 2 Comparison of hippocampal CA3 neuronal apoptosis between various groups of rats（by TUNEL method，×200）

2.5 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較海馬組織p-JAK1、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組及五味子提取物低、中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，五味子提取物高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于五味子提取物中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。海馬組織JAK1、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

3 討論

抑郁癥是一種心理障礙，表現(xiàn)為持續(xù)性的情緒低落，常伴有思維和行為的改變，病程遷延，多數(shù)患者有反復(fù)發(fā)作的傾向。而西藥治療抑郁癥往往有一定的局限性，因此，深入研究抑郁癥及其發(fā)病機(jī)制，尋找更可靠有效的治療藥物，提高患者的生活及生存質(zhì)量，具有重要的實(shí)際意義。中藥根據(jù)辨證施治治療抑郁癥有較好的療效，且五味子鎮(zhèn)靜催眠、改善認(rèn)知作用已被證實(shí)[4-6，14-15]。許方敏等[16]研究顯示，使用五味子醇甲干預(yù)抑郁癥小鼠，抑郁行為較正常組顯著減輕。Yan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，五味子對(duì)大鼠不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激刺激引起的抑郁行為和睡眠剝奪引起的焦慮行為有治療作用。Li等[18]證實(shí)，五味子提取物對(duì)帕金森小鼠具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。

CUMS是制備抑郁動(dòng)物模型的常見(jiàn)方法，本研究采用此法誘導(dǎo)大鼠抑郁癥模型，通過(guò)模擬抑郁癥患者日常生活中遇到的各種應(yīng)激刺激，復(fù)制患者的異常行為，可以較好地評(píng)價(jià)藥物的抗抑郁作用。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用于評(píng)定動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)與探索行為，水平運(yùn)動(dòng)反映大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，垂直運(yùn)動(dòng)反映大鼠對(duì)周?chē)迈r環(huán)境的好奇性。蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)用于評(píng)定動(dòng)物對(duì)糖水偏好的敏感度，動(dòng)物快感缺失則對(duì)糖水的偏好敏感度降低。海馬神經(jīng)元損傷與抑郁癥發(fā)病機(jī)制有著密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠處于抑郁狀態(tài)，五味子提取物各劑量組水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分、1%蔗糖水消耗率均顯著上升，海馬神經(jīng)元形態(tài)較模型組有不同程度改善，海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著下降，提示五味子提取物有修復(fù)海馬神經(jīng)元損傷并抗抑郁的作用。

表2 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of protein expression of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 in hippocampal tissues between various groups of rats（±s）

表2 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of protein expression of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 in hippocampal tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與五味子提取物低劑量組比較；④P＜0.05，與五味子提取物中劑量組比較

組別正常組模型組五味子提取物低劑量組五味子提取物中劑量組五味子提取物高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 10 JAK1相對(duì)表達(dá)量0.95±0.12 0.97±0.11 0.89±0.09 0.92±0.10 0.95±0.11 0.864 0.493 p-JAK1相對(duì)表達(dá)量0.85±0.09 0.38±0.04①0.53±0.07②0.62±0.07②③0.73±0.08②③④63.069＜0.001 STAT3相對(duì)表達(dá)量1.12±0.13 1.06±0.11 1.08±0.12 1.04±0.11 1.09±0.13 0.635 0.640 p-STAT3相對(duì)表達(dá)量1.03±0.11 0.52±0.06①0.61±0.07②0.73±0.09②③0.85±0.09②③④54.783＜0.001

圖3 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白Western Blot電泳條帶灰度比較Figure 3 Comparison of the gray level of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 proteins in hippocampaltissues between various groups of rats by Western Blot electrophoresis

JAK/STAT信號(hào)通路廣泛存在于各種組織中，參與多種細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活動(dòng)。JAKs屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，STATs是JAKs的下游底物，STATs通過(guò)與磷酸化JAKs偶聯(lián)活化，完成細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并啟動(dòng)核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[19]。JAK1/STAT3是JAK/STAT信號(hào)通路中的一條重要途徑，與神經(jīng)元凋亡關(guān)系密切。細(xì)胞因子作用于JAK1，導(dǎo)致JAK1活化，激活下游STAT3，p-STAT3進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合靶基因，可活化下游基因表達(dá)，調(diào)控神經(jīng)元的增殖與凋亡[20]。既往研究顯示，激活JAK1/STAT3通路可減少小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21-22]。本研究結(jié)果顯示，五味子提取物各劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白表達(dá)量較模型組顯著升高，提示五味子提取物可能通過(guò)激活JAK1/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

綜上所述，五味子提取物的抗抑郁作用機(jī)制，可能與激活JAK1/STAT3信號(hào)通路進(jìn)而抗神經(jīng)元凋亡有關(guān)。