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    水稻耐冷基因OsICE1 的克隆與轉(zhuǎn)基因香菇菌絲體的創(chuàng)制

    2022-06-09 06:15:28王紅運(yùn)劉禹夫于曉明楊祥波曲一格張振宇王曉航
    北方水稻 2022年2期
    關(guān)鍵詞:泳道菌絲體香菇

    王紅運(yùn),劉禹夫,于曉明,楊祥波,曲一格,張振宇,王曉航*

    (1 吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,吉林 吉林 132101;2 吉林省種子管理總站,長(zhǎng)春 130000)

    香菇隸屬于真菌界 (Fungi)、 擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota),學(xué)名Lentinula edodes,是世界久負(fù)盛名的珍貴食用菌[1]。 香菇味道好,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[2]。 同時(shí)還可作藥用:有扶正補(bǔ)虛,健脾開(kāi)胃,祛風(fēng)透疹,化痰理氣,解毒,抗癌等功效。別名又為香蕈。 目前香菇的研究多為香菇多糖對(duì)人體心血管的影響, 香菇中微量元素的分析等等, 還未有太多關(guān)于香菇分子生物學(xué)方面的研究[3]。 所以對(duì)香菇進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究尤為重要。本研究選用的為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)香菇進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法能在自然條件下趨化性的將TDNA 插入到植物基因組中,它轉(zhuǎn)化率高,單拷貝比例高, 且轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定。 是近年來(lái)常用的轉(zhuǎn)化方法。 OsICE1 基因是水稻中的一種冷調(diào)控關(guān)鍵蛋白, 在多個(gè)文獻(xiàn)中對(duì)于OsICE1 的抗冷性多有研究,具有比較穩(wěn)定且作用明顯的抗寒功能,在水稻受到低溫時(shí)進(jìn)行表達(dá), 可以使水稻在一定程度上耐冷[4]。由此選用OsICE1 基因?qū)ο愎骄z體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[5],使得到帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體, 為實(shí)現(xiàn)香菇在寒冷條件大面積種植提供了重要依據(jù)與材料。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株和質(zhì)粒 香菇菌株由周玉麟食用菌研究所購(gòu)入; 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)、 根癌農(nóng)桿菌EHA105 感受態(tài)保存在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室, 日本晴水稻種子,pCsV1300 質(zhì)粒保存于吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室, 質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。

    圖1 pCsV1300 載體的T-DNA

    1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒由生工股份有限公司購(gòu)入,PCR、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于全式金公司。

    1.2 構(gòu)建抗寒基因OsICE1 的基因表達(dá)載體

    1.2.1 水稻發(fā)芽 首先挑選飽滿(mǎn)的日本晴水稻種子, 把其放入處理好的培養(yǎng)皿中, 用生汞進(jìn)行消毒,消毒15 min,把消毒后的種子在紗布上進(jìn)行沖洗,把沖洗后的種子重新放回培養(yǎng)皿中,把培養(yǎng)皿上下兩層分別平鋪已經(jīng)用超純水沾濕的濾紙,把消毒后的種子放在下層濾紙上, 再把上層帶有沾濕濾紙的培養(yǎng)皿蓋住, 放入25 ℃無(wú)光的條件下進(jìn)行培養(yǎng)[6]。 注意時(shí)常觀察濾紙上的水分,始終保持濾紙濕潤(rùn), 培養(yǎng)5 d 出現(xiàn)水稻根和芽。

    1.2.2 水稻RNA 提取 對(duì)1.2.1 中培養(yǎng)的水稻種子的芽進(jìn)行RNA 提取: 選用1.2.1 中的水稻芽0.2 g,用Trizol 法進(jìn)行提取。

    1.2.3 反轉(zhuǎn)錄體系 純化RNA 以去除基因組DNA[7], 操作按全式金公司的TransScript One-Step gRNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 其體系見(jiàn)表1。

    表1 反轉(zhuǎn)錄體系

    條件為:PCR 42 ℃孵育30 min。 85 ℃加熱5 s 失活TransScript RT/RI Enzyme Mix 和gDNA Remover。

    1.2.4 OsICE1 目的基因的克隆 用primer 軟件設(shè)計(jì)出的引物如下。

    OsICE1 的引物序列:

    OsICE1-clone-F: 5' ATGCTGCCGCGGTTTCA 3'OsICE1-clone-R: 5' CTAGATCATGGTATGGAAC CCG 3'

    OsICE1-clone-XbaI-F:5' TGCTCTAGAATGCTGC CGCGGTTTCA 3'

    OsICE1-clone-EcoRI-R: 5' CCGGAATTCCTAGAT CATGGTATGGAACCCG 3'

    由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

    PCR 擴(kuò)增制備水稻全基因, 操作如下:PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

    表2 PCR 反應(yīng)體系

    PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s,58 ℃退火32 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)30 次;72 ℃延伸5 min。 1%瓊脂糖凝膠電泳。

    PCR 擴(kuò)增OsICE1 片段。 上一步擴(kuò)增出來(lái)的水稻cDNA 全長(zhǎng)作為模板, 用OsICE1-clone-XbaI-F,OsICE1-clone-EcoRI-R,引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件同上面一樣。

    1.2.5 PCR 產(chǎn)物回收 將1.2.4 擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物用Coolaber 公司的試劑盒對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收,獲取所需要的目的基因片段。

    1.2.6 雙酶切 pCsV1300 質(zhì)粒, 用EcoRI,XBaI進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

    表3 酶切反應(yīng)體系

    在滅菌的0.2 mL 離心管中配制如下溶液(50 μL):

    37 ℃反應(yīng)15 min, 所得產(chǎn)物保存于-4 ℃冰箱備用。 電泳。

    選1.2.5 中回收的目的基因OsICE1 片段,用EcoRI,XBaI 進(jìn)行酶切,反應(yīng)體系見(jiàn)表4。

    表4 酶切反應(yīng)體系

    37 ℃反應(yīng)15 min, 所得產(chǎn)物保存于-4 ℃冰箱備用。 電泳。

    1.2.7 DNA 連接 將1.2.6 中的兩次酶切產(chǎn)物作為模板,用DNA 連接酶進(jìn)行連接,體系見(jiàn)表5。

    表5 酶連接反應(yīng)體系

    在滅菌的0.2 mL 離心管中配制如下溶液(15 μL):

    1.3 構(gòu)建含有OsICE1 基因的DH5α

    1.3.1 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。

    1.3.2 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定 選取單菌落接種到含有AMP 的液體培養(yǎng)基中[8],進(jìn)行培養(yǎng),鑒定。

    1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)

    1.4.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌EHA105 (含質(zhì)粒pCsV1300) 劃線于含有 (20 mg/L Rif,50 mg/L Kan)的LB 平板上,28 ℃培養(yǎng)2 d;單菌落在液體培養(yǎng)基中以28 ℃,200 r/min 培養(yǎng)2 d,用打孔器從培養(yǎng)6 d 左右的PDA 平板取菌絲塊[9],浸入農(nóng)桿菌菌液中,侵染20 min。置于含有200 μmol/L AS 的共培養(yǎng)基上,25 ℃共培養(yǎng)2 d。 將培養(yǎng)后的菌絲塊轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基中 (10 mg/L 潮霉素)篩選轉(zhuǎn)化子, 培養(yǎng)2 周后取菌塊周?chē)麻L(zhǎng)出的菌絲進(jìn)行復(fù)篩(12 mg/L 潮霉素培養(yǎng)基)。

    1.4.2 抗寒性能試驗(yàn)測(cè)試 把復(fù)篩過(guò)的菌絲進(jìn)行試管培養(yǎng), 在黑暗、pH 為適宜的情況下, 分別在10 ℃、25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng), 分別在12 h、48 h、72 h 進(jìn)行觀察。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA 完整性分析

    對(duì)發(fā)芽5 d 水稻進(jìn)行冷脅迫(4 ℃)1 h,提取芽組織的RNA[10]。 結(jié)果如圖2 顯示,獲得RNA 中28S 條帶顯著亮于18S,5S RNA 條帶最弱, 說(shuō)明提取的水稻RNA 具有較好的完整性。圖2 的三條泳道均為發(fā)芽5 天后進(jìn)行冷脅迫的水稻芽的RNA。

    圖2 發(fā)芽5 d 提取的水稻RNA

    2.2 OsICE1 基因的獲得

    通過(guò)對(duì)水稻全基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增[11],并用特定引物進(jìn)行PCR 后得到OsICE1 基因目的片段,它克隆獲得到2 個(gè)陽(yáng)性,如圖3,1、3 泳道為獲得的陽(yáng)性克隆,測(cè)序結(jié)果顯示為1627bp。

    圖3 水稻芽中OsICE1 基因的克隆

    2.3 pCsV1300-OsICE1 表達(dá)載體的構(gòu)建

    pCsV1300 經(jīng)過(guò)XBaI 與EcoRI 酶切后是9755bp 片 段 長(zhǎng),OsICE1 基 因 為1627bp 片 段 長(zhǎng)。如圖4 所示, 可以清楚地看到在2 條泳道上的兩條DNA 條帶。

    圖4 pCsV1300-OsICE1 表達(dá)載體

    2.4 轉(zhuǎn)基因香菇菌絲的鑒定

    從 轉(zhuǎn) 基 因 香 菇 菌 絲 體 中 提 取DNA[12],用OsICE1-clone-F,OsICE1-clone-R 引物對(duì)提取出來(lái)的香菇DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增, 電泳圖如圖5 所示。圖中第2 條泳道為陰性對(duì)照,第3、4 條泳道為用OsICE1-clone-F,OsICE1-clone-R 引 物PCR得到的產(chǎn)物,其大小在2000bp 左右。

    圖5 轉(zhuǎn)基因香菇菌絲的鑒定

    2.5 抗寒性試驗(yàn)的測(cè)試

    香菇菌絲在25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度, 試驗(yàn)主要做出了帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體與不帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體[13],把他們分別放入了10 ℃和最適溫度25 ℃。 可以看出,在25 ℃的溫度,其余條件都相同的情況下他們長(zhǎng)勢(shì)大致相同。 而在10 ℃的溫度,其余條件都相同的情況下, 帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)要比不帶有OsICE1 基因表達(dá)載體的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng), 但是明顯比25 ℃情況下的菌絲長(zhǎng)勢(shì)弱。 由此可見(jiàn),帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體可以在一定程度上抗寒, 比正常的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)好。

    3 結(jié)論

    香菇是一種重要的食用菌, 溫度是影響香菇菌絲生長(zhǎng)的重要因素, 每年有大面積的香菇遭受到寒冷溫度的威脅,導(dǎo)致其產(chǎn)量下降[14]。 OsICE1是水稻中的一種冷調(diào)控關(guān)鍵蛋白, 在水稻抗寒種質(zhì)創(chuàng)制中具有重要作用。 通過(guò)對(duì)水稻耐冷基因OsICE1 的克隆, 構(gòu)建了pCsV1300-OsICE1 表達(dá)載體。完成了對(duì)香菇菌絲體的轉(zhuǎn)化。抗寒性試驗(yàn)的測(cè)試可以看出,在10 ℃的溫度,其余條件都相同的情況下, 有OsICE1 基因的香菇菌絲體比不帶有OsICE1 基因的香菇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)好。 由此可見(jiàn),水稻耐冷基因OsICE1 的克隆與轉(zhuǎn)基因香菇菌絲體的創(chuàng)制的可行性[15]。

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