7 種植物精油對2 種蘋果病害病原菌的抑菌活性*

張 坤，張鵬九，高 越，劉中芳，楊 靜，樊建斌，趙勁宇，范仁俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點實驗室，太原 030031）

目前蘋果樹病害的防治措施主要為化學(xué)防治，由于化學(xué)農(nóng)藥的頻繁使用，導(dǎo)致了土壤化學(xué)農(nóng)藥的高殘留、果樹上耐藥性菌株的出現(xiàn)等一系列生態(tài)環(huán)境問題，這些因素嚴(yán)重限制了化學(xué)農(nóng)藥的使用和蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。

按發(fā)病部位來劃分，蘋果樹病害可分為果實病害、枝干病害、葉片病害，其中，由于目前果園大多采用套袋技術(shù)，果實病害大大減少[3]。蘋果枝干病害分為蘋果樹腐爛病、蘋果干腐病和蘋果輪紋病，其中蘋果樹腐爛病是蘋果樹的重要病害，病原菌為黑腐皮殼菌（Valsa mali），枝干被侵染后，引起樹勢衰弱甚至整株死亡，在發(fā)病初期，常使用甲基硫菌靈可濕性粉劑防治[4]。葉片病害，蘋果斑點落葉病以發(fā)病早、傳播快、侵染后快速造成葉片早落，嚴(yán)重影響樹勢和產(chǎn)量為特點，成為蘋果七大落葉?。ㄌO果斑點落葉病、蘋果黑斑病、蘋果炭疽葉枯病、蘋果銹病、蘋果灰斑病、蘋果輪斑病、蘋果圓斑病）中最為典型易發(fā)的病害[5]，病原菌為鏈格孢蘋果?；途ˋlternaria alternataf.sp.mali），在發(fā)病早期常使用戊唑醇微乳劑噴霧殺菌[6-7]。

植物精油作為一種植物源物質(zhì)，是存在于植物中不同部位的一類相對分子質(zhì)量較小、可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶的油狀成分的總稱[8]，是植物的次生代謝產(chǎn)物[9]。植物精油在自然界中分布廣泛，化學(xué)成分繁多，主要有萜類化合物、酸性化合物（如苯甲酸）、醇類化合物（如香葉醇、薄荷醇）、醛類化合物（如檸檬醛、肉桂醛）、酮體以及酚類等，其中萜烯類、萜類和芳香酚類化合物在精油活性中起重要作用，而醛類的抗真菌活性最高[10-11]。截至目前，已有多篇文獻研究報道了陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油、桉葉油、青蒿精油、生姜精油具有一定的抗菌活性[12-20]，而關(guān)于這7 種精油對上述2 種病原菌的抑菌活性以及精油對化學(xué)殺菌劑的藥量和藥效的影響卻鮮有報道。因此，我們選取蘋果樹上具代表性的2 種病菌作為供試病原菌，研究上述已被證實具有抑菌性的7 種植物精油對其的抑菌活性，同時在室內(nèi)條件下研究了7 種植物精油對甲基硫菌靈和戊唑醇用藥量和藥效的影響，旨在為開發(fā)綠色植物源抑菌劑奠定基礎(chǔ)，并為果樹病害防治中農(nóng)藥減施增效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥劑

99%陳皮精油、99%松樹油、99%薄荷精油、99%檸檬精油、99%青蒿精油、99%生姜精油、99%桉葉油等7 種供試精油均購自江西雪松天然藥用油有限公司；無水乙醇、吐溫-80 為市售化學(xué)純；丙酮為市售分析純；95%甲基硫菌靈原藥，由陜西美邦農(nóng)藥有限公司提供；97%戊唑醇原藥，購自山東華陽科技股份有限公司；超純水為本實驗室制備。

1.2 試驗菌株和微生物培養(yǎng)基

蘋果樹腐爛病主要致病菌黑腐皮殼屬病菌，蘋果斑點落葉病主要致病菌鏈格孢蘋果?；途缮轿鬓r(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院果蔬病害實驗室提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）：馬鈴薯精粉6.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂20.00 g，稱取本品46.00 g，加蒸餾水1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.3 試驗儀器設(shè)備

FA1604B 萬分之一電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司），KQ-300E 超聲波振蕩器（上海五相儀器儀表有限公司），LDZH-150KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海精密儀器儀表有限公司），ULUP-Ⅱ超濾除熱源型超純水器（西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司），ZHJH-C1112B 超凈工作臺（北京思博晟達(dá)科技有限公司），HWS-80 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

（1）7 種供試精油的單劑抑菌活性[21]。將1 g樣品用少許丙酮溶解后，配制成100 mg/mL 溶液備用，溶解過程中加入少許吐溫-80，并在超聲波振蕩器上振蕩5 min。用PDA 培養(yǎng)基梯度稀釋母液，稀釋至10、20、50、100、200、500 mg/L，倒入滅菌后的無菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，迅速接入活化以后的待測菌種，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，空白對照為只加少許吐溫-80 的等量丙酮。上述操作均在無菌操作臺完成后，將培養(yǎng)皿用封口膜處理并置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落的直徑，根據(jù)菌絲生長速率法計算抑制率和抑制中濃度EC50。

（2）復(fù)配劑的抑菌活性。選擇單獨使用抑菌效果相對較好的精油單劑兩兩復(fù)配，通過預(yù)試驗篩選不同精油復(fù)配比例，最佳配比為1∶1，故選擇松樹油、薄荷精油、陳皮精油、檸檬精油按體積比1∶1 進行復(fù)配，復(fù)配精油濃度梯度為10、20、50、100、200、500 mg/L，空白對照為只加少許吐溫-80 的等量丙酮，按（1）步驟配制培養(yǎng)基，加入待測菌種培養(yǎng)，測量菌落的直徑，根據(jù)Wadley 法計算復(fù)配劑的增效系數(shù)（SR）[22]。

（3）殺菌劑的抑菌活性。稱取95%甲基硫菌靈、97%戊唑醇原藥，分別用丙酮溶解配制成有效成分含量為1 000 mg/L 溶液備用，將溶液進行梯度稀釋，根據(jù)一系列預(yù)試驗結(jié)果，最終稀釋液濃度梯度為0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，倒入滅菌后的無菌培養(yǎng)皿中。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在加入甲基硫菌靈的培養(yǎng)皿中迅速接入活化以后的黑腐皮殼屬病菌，在加入戊唑醇的培養(yǎng)皿中迅速接入活化以后的鏈格孢蘋果?；筒【?，空白對照均為等量丙酮，其他步驟同（1）。

（4）精油單劑和農(nóng)藥混配后對農(nóng)藥抑菌性的影響。選擇單獨使用抑菌效果好的精油單劑備用，稱取一定量原藥溶解于丙酮和精油中，甲基硫菌靈原藥和戊唑醇原藥的使用濃度梯度均為0.25、0.50、1.25、2.50、5、10 mg/L，精油濃度為各自的抑制中濃度（EC50），配制成抑菌劑-精油混合溶液，對照組為（3）試驗組，其他步驟同（3）。

（5）精油復(fù)配劑和農(nóng)藥混配后對農(nóng)藥抑菌性的影響。選擇精油復(fù)配劑中抑菌效果好的檸檬-薄荷精油復(fù)配劑、檸檬-松樹油復(fù)配劑、薄荷-松樹油復(fù)配劑，分別加入到對應(yīng)的抑菌劑溶液中，對照組為（3）試驗組，其他步驟同（3）。

抑制率（%）＝［（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅初始直徑）］×100

增效系數(shù)（SR）＝X1/X2，X1＝［（PA＋PB）×100］/（PA/A＋PB/B）

式中，X1 是混劑的EC50理論值；X2 為混劑EC50實測值；PA 為混劑中A 的百分含量；PB 為混劑中B 的百分含量；A 為混劑中A 的EC50值；B 為混劑中B 的EC50值。

SR≥1.50 表示具有增效作用；0.50＜SR＜1.50為相加作用；SR≤0.50 表示具有拮抗作用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010、SPSS 17.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果?；途囊种谱饔?/h3>

由表1 可知，不同單劑對2 種病原菌抑制效果存在差異。7 種單劑均對黑腐皮殼菌具有抑制作用，其中陳皮精油、松樹油、薄荷精油抑菌活性最好，EC50分別為123.37、157.12、193.13 mg/L；其次為檸檬精油和青蒿精油，EC50分別為219.31、294.97 mg/L；生姜精油和桉葉油的EC50分別為2 153.16、2 632.33 mg/L，其抑制黑腐皮殼菌的活性明顯弱。

表1 7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果?；途z生長的抑制效果

7 種單劑中，對鏈格孢蘋果?；途囊种菩Ч詈玫氖顷惼ぞ停珽C50為148.13 mg/L，松樹油和薄荷精油、檸檬精油次之，EC50在188～423 mg/L之間，青蒿精油、生姜精油、桉葉油未見抑制效果（表1）。

2.2 植物精油復(fù)配劑對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果?；途囊种谱饔?/h3>

由圖1 可知，薄荷精油-松樹油復(fù)配劑對蘋果黑腐皮殼菌的抑制效果比二者單獨使用時強，增效系數(shù)（SR）為2.30，表現(xiàn)增效作用，EC50為75.04 mg/L；檸檬精油-薄荷精油復(fù)配劑的抑菌效果也表現(xiàn)為增效作用，SR 為2.11，EC50為96.74 mg/L；其他精油復(fù)配劑的抑菌活性均較相應(yīng)的單劑低，SR＜0.50，具有拮抗作用，EC50在239.25～725.51 mg/L 之間。

圖1 精油復(fù)配劑對黑腐皮殼菌的抑制作用

由圖2 可知，檸檬精油-松樹油復(fù)配劑對鏈格孢蘋果?；途囊种菩Ч^二者單獨使用時要好，SR 為2.10，表現(xiàn)增效作用，EC50為122.02 mg/L；其他精油復(fù)配劑的抑菌效果均較相應(yīng)的單劑差，SR＜0.50，表現(xiàn)為拮抗作用，EC50在122.02～589.66 mg/L 之間。

圖2 精油復(fù)配劑對鏈格孢蘋果?；途囊种谱饔?/p>

2.3 不同植物精油單劑和復(fù)配劑對化學(xué)殺菌劑的減施增效作用

2.3.1 對甲基硫菌靈防治黑腐皮殼菌的減施增效作用

由圖3-A 可知，甲基硫菌靈＋松樹油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為1.43 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時降低55.86%；甲基硫菌靈＋薄荷精油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為1.55 mg/L，降低52.16%；甲基硫菌靈+陳皮精油對黑腐皮殼菌的EC50為1.60 mg/L，降低50.62%；甲基硫菌靈＋檸檬精油對蘋果黑腐皮殼菌的EC50為2.35 mg/L，降低27.47%，甲基硫菌靈對黑腐皮殼菌的EC50為3.24 mg/L。

圖3 精油單劑和復(fù)配劑對甲基硫菌靈抑制黑腐皮殼菌的作用

由圖3-B 可知，薄荷精油和松樹油復(fù)配劑與甲基硫菌靈混配后，對黑腐皮殼菌的抑菌活性較甲基硫菌靈單劑高，EC50為1.03 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時降低68.21%；檸檬精油和薄荷精油復(fù)配劑與甲基硫菌靈混配后，抑菌活性較甲基硫菌靈單劑要低，EC50為4.78 mg/L，較甲基硫菌靈單獨使用時增高47.53%。

2.3.2 對戊唑醇防治鏈格孢蘋果?；途臏p施增效作用

由圖4-A 可知，戊唑醇＋陳皮精油對鏈格孢蘋果?；途腅C50為2.04 mg/L，較戊唑醇單獨使用降低56.32%；戊唑醇＋松樹油對鏈格孢蘋果?；途腅C50為2.79 mg/L，降低40.26%；戊唑醇＋薄荷精油對鏈格孢蘋果?；途腅C50為3.90 mg/L，降低16.49%；戊唑醇＋檸檬精油對鏈格孢蘋果?；途腅C50為4.33 mg/L，降低7.28%，戊唑醇對鏈格孢蘋果?；途z生長的EC50為4.67 mg/L。

由圖4-B 可知，松樹油和檸檬精油復(fù)配劑與戊唑醇混配后，對鏈格孢蘋果?；途腅C50為1.93 mg/L，較戊唑醇單獨使用時降低58.68%。

圖4 精油單劑和復(fù)配劑對戊唑醇抑制鏈格孢蘋果?；途淖饔?/p>

3 討論與結(jié)論

本文研究了在室內(nèi)條件下7 種植物精油對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果?；途囊志钚?，同時研究了7 種精油對甲基硫菌靈防治蘋果黑腐皮殼菌、戊唑醇防治鏈格孢蘋果?；途挠绊?。結(jié)果表明，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油4 種精油單劑對黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌2 種病原菌均具有一定程度的抑制作用，青蒿精油僅明顯抑制黑腐皮殼菌菌絲生長，而桉葉油與生姜精油對2 種病原菌均無明顯的抑制效果。左春生等[23]發(fā)現(xiàn)桉葉油可明顯抑制鴨疫里默氏菌，其最小抑菌濃度為78.12 μL/L。這與本研究結(jié)果存在不同，其原因可能是鴨疫里默氏菌是一種黃桿菌種，屬于卵生類家禽細(xì)菌，而本研究中黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果?；途鶠榘胫鷣嗛T真菌[24]。魯萌萌等[25]通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)生姜精油能延長細(xì)菌的生長停滯期，抑制細(xì)菌的生長速率，且能引起細(xì)菌細(xì)胞膜破損，致使胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，從而抑制細(xì)菌活性。因此，桉葉油和生姜精油對細(xì)菌具有抑菌作用，而對果樹病害真菌卻無明顯抑菌作用。而關(guān)于植物精油的抑菌機理，國內(nèi)外也進行了相關(guān)研究，普遍認(rèn)為精油中的抑菌成分抑制了病原菌菌絲生長以及孢子萌發(fā)，同時改變了細(xì)胞膜的滲透性和宿主抗病性，增加了細(xì)胞膜相對電導(dǎo)率，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)和ATP 都發(fā)生丟失[26-27]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與其單獨使用相比，薄荷精油-松樹油復(fù)配劑、薄荷精油-檸檬精油復(fù)配劑對黑腐皮殼菌的抑制作用增強，檸檬精油-松樹油復(fù)配劑對鏈格孢蘋果?；途囊种谱饔迷鰪?。這與劉歡等[28]的研究結(jié)果相似，他們測試了精油有效成分肉桂醛/檸檬醛協(xié)同抑菌活性，發(fā)現(xiàn)精油復(fù)配以后使葡萄灰霉菌的細(xì)胞溶出物釋放量和細(xì)胞膜滲透性顯著增加，抑菌效果更強。

精油與甲基硫菌靈和戊唑醇2 種殺菌劑混配后，其中，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油的單劑均增強了甲基硫菌靈對蘋果黑腐皮殼菌、戊唑醇對鏈格孢蘋果專化型菌的抑菌能力。但精油復(fù)配劑與殺菌劑混配后，僅薄荷精油-松樹油復(fù)配劑增強了甲基硫菌靈對蘋果黑腐皮殼菌的抑菌能力，檸檬精油-松樹油復(fù)配劑增強了戊唑醇對鏈格孢蘋果專化型菌的抑菌能力。結(jié)合農(nóng)藥助劑的作用原理[29]，推測可能是精油增強了化學(xué)殺菌劑的滲透性和潤濕性，使殺菌劑成分更快、更有效地進入病原菌細(xì)胞內(nèi)，加快影響了蘋果黑腐皮殼菌和鏈格孢蘋果專化型菌細(xì)胞膜的通透性，甚至破壞了其磷脂雙分子層；或者破壞了2 種菌的細(xì)胞膜，使內(nèi)溶物和離子外流導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]；同時，也有可能精油與化學(xué)殺菌劑成分之間多點協(xié)同，破壞了2 種菌的胞內(nèi)酶系統(tǒng)，阻礙了遺傳物質(zhì)的復(fù)制傳遞和微生物的繁殖，最終結(jié)果是抑制了它們的生長甚至導(dǎo)致死亡[31]。綜上，陳皮精油、松樹油、薄荷精油、檸檬精油不僅可以抑制2 種病原菌的生物活性，還對甲基硫菌靈和戊唑醇的抑菌性產(chǎn)生增效作用，具有成為綠色植物源殺菌劑和化學(xué)農(nóng)藥助劑的潛力。

本研究為植物精油在蘋果樹枝干、葉部病害的防治提供了新的思路，也為植物源殺菌劑和植物源農(nóng)藥助劑的開發(fā)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但當(dāng)下植物精油作為天然殺菌劑和農(nóng)藥助劑成分的應(yīng)用仍然面臨諸多問題，比如植物原材料提取精油效率不高[32]、提取后存放不恰當(dāng)會見光分解造成浪費[33]、植物精油具有強烈揮發(fā)性[34]等，這些問題可以借鑒精油在食品行業(yè)中的應(yīng)用原理從而得到解決，如優(yōu)化精油的提取工藝、改良儀器設(shè)備，避免原材料浪費，提取后采用不透光密封罐儲存，田間施用時采用殼聚糖膜包裹制成殼聚糖精油復(fù)合膜，從而延遲精油的釋放[35-36]。

本試驗通過室內(nèi)測定發(fā)現(xiàn)，與精油混配后，甲基硫菌靈的使用量減少27.47%～68.21%，戊唑醇的使用量減少7.28%～58.68%，如果能應(yīng)用到生產(chǎn)中，會改善生態(tài)環(huán)境。但是有關(guān)精油對殺菌劑的增效機制還有待進一步研究，下一步將探明機制并將篩選出來的精油開發(fā)成植物源農(nóng)藥助劑產(chǎn)品，應(yīng)用到果園生產(chǎn)中。