設(shè)施菜地種植年限對土壤nosZ型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響

王喜英 趙輝 譚智勇 余高

摘要：反硝化微生物在土壤氮素?fù)p失和溫室氣體轉(zhuǎn)化方面具有重要的作用，研究設(shè)施菜地土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化，對評價設(shè)施菜地長期種植土壤質(zhì)量狀況和提高氮轉(zhuǎn)化認(rèn)知水平具有重要意義。應(yīng)用熒光定量PCR和 Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，以nosZ基因?yàn)榘袠?biāo)，研究設(shè)施菜地種植3、5、7年和露天菜地（CK）對土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響。結(jié)果表明：露天菜地（CK）nosZ基因豐度顯著高于其他處理，分別是3、5、7年的1.32倍、1.45倍和1.69倍。隨種植年限延長，nosZ基因豐度逐漸降低。不同處理土壤反硝化微生物群落α多樣性指數(shù)差異顯著，α多樣性指數(shù)隨種植年限延長逐漸降低，且露天菜地（CK）的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高。門水平上優(yōu)勢類群為變形菌門;屬水平上優(yōu)勢類群為慢生根瘤菌屬和無色桿菌屬;變形菌門和慢生根瘤菌屬相對豐度隨設(shè)施種植年限延長逐漸降低。主成分分析（PCA）結(jié)果表明，隨種植年限延長nosZ群落結(jié)構(gòu)差異較大;其中3年和5 年群落結(jié)構(gòu)相似，7、3、5 年群落結(jié)構(gòu)差異較大。土壤速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量是nosZ型反硝化微生物數(shù)量、α多樣性和群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素。綜上可知，設(shè)施菜地長期種植顯著降低了nosZ型反硝化微生物數(shù)量，并對群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

關(guān)鍵詞：設(shè)施菜地;種植年限;反硝化微生物;nosZ基因;群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S182 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0240-07

設(shè)施蔬菜是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集約化發(fā)展的一個重要分支，對提高自然資源利用率和增加農(nóng)民收入具有重要的意義。隨著人口的不斷增長和對蔬菜消費(fèi)需求的增加以及有限的耕地資源，設(shè)施蔬菜在過去的40年里得到了高度發(fā)展[1]。截至2016年，我國設(shè)施蔬菜種植面積已達(dá)387多萬hm2，位居世界第一，產(chǎn)值占蔬菜總產(chǎn)值的50%以上[2]。然而，設(shè)施蔬菜具有種植指數(shù)高、農(nóng)業(yè)投入大、棚內(nèi)溫濕度較高的封閉或半封閉環(huán)境，且無雨水淋溶等特點(diǎn)。因此，設(shè)施蔬菜長期種植已經(jīng)引起了人們對土壤質(zhì)量退化、土壤和蔬菜潛在污染以及對人類健康的負(fù)面影響的擔(dān)憂[3-4]。

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化、污染物降解和土傳病害防治等作用[5]。相關(guān)研究認(rèn)為，設(shè)施蔬菜長期種植對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能有負(fù)面影響，主要指從細(xì)菌為主到以真菌為主的群落演替，功能相關(guān)微生物群落成員和物種相互作用的減少，導(dǎo)致一些土傳病原菌替代了對生態(tài)有益的微生物群落[6-9]。目前，研究者更多關(guān)注的是土壤微生物群落的整體變化或某些選定的與土傳病害有關(guān)的微生物。由于土壤微生物具有高度的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，不同類型的土壤生物過程由所涉及的功能群微生物驅(qū)動完成。迄今為止，在設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中，土壤功能微生物對蔬菜長期生產(chǎn)的響應(yīng)仍然知之甚少，尤其是與養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)的微生物。

氮（N）是植物生長的主要限制因子，土壤氮有效性在決定植物氮素吸收和產(chǎn)量方面起著重要作用[10]。氮轉(zhuǎn)化主要包括氮固定、礦化、硝化和反硝化過程[11]。反硝化作用產(chǎn)生的溫室氣體（N 2O）是大氣臭氧的主要消耗物質(zhì)，變暖潛力是二氧化碳的298倍[12]。其中，由土壤微生物驅(qū)動的反硝化作用對調(diào)節(jié)氮循環(huán)及維持全球氮平衡起著重要的作用[13]。N 2O主要由反硝化作用產(chǎn)生，耕地土壤是最大的來源[14-15]。設(shè)施菜地由于投入大量氮肥和大水漫灌，導(dǎo)致土壤反硝化作用強(qiáng)烈，N 2O釋放通量比大田高1.41倍[16]。因此，如何通過微生物來調(diào)控N 2O轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為許多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[17-18]。目前，反硝化中唯一已知的是通過nosZ基因編碼的N 2O還原酶還原N 2O的生物過程[19]。在森林、草地和耕地中已開始利用nosZ基因來研究反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[20-21]。然而，關(guān)于設(shè)施蔬菜長期種植對土壤nosZ型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的研究未見報(bào)道。

為此，本研究運(yùn)用熒光定量PCR和Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對不同種植年限設(shè)施菜地土壤nosZ型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度進(jìn)行研究，主要目的在于：（1）隨設(shè)施菜地種植年限延長，反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性如何變化？有哪些優(yōu)勢類群發(fā)生變化？（2）設(shè)施蔬菜長期種植中，哪些土壤環(huán)境因子對反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大？揭示設(shè)施蔬菜長期種植過程中的反硝化能力，為深入了解設(shè)施蔬菜土壤氮循環(huán)過程提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

試驗(yàn)樣地位于貴州省銅仁市和平鄉(xiāng)（109°07′44″E，27°46′46″N），屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫18 ℃，年降水量1 313 mm，土壤類型為黃壤，有機(jī)碳含量為22.32 g/kg，全氮含量為1.05 g/kg，pH值為6.15，容重為1.23 g/cm3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇3個種植年限（3、5和7 年）設(shè)施大棚（長、寬規(guī)格分別為8、40 m）各3個，以周圍種植的露天蔬菜為對照（CK）。設(shè)施菜地基肥施用氮磷鉀復(fù)合肥80～100 kg/667 m2，追施氮肥40～50 kg/667 m2。露天菜地施用基肥40～50 kg/667 m2，追肥20～30 kg/667 m2。設(shè)施大棚每年蔬菜種植類型一致，主要種植黃瓜和豇豆等。在整個試驗(yàn)處理中，除種植年限差異外，其余生產(chǎn)管理措施一致。

于2017年7月取樣，當(dāng)季種植的作物均為黃瓜，每個樣地按“S”形（五點(diǎn)法）采集0～10 cm土壤樣品，用低溫冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行2 mm過篩處理。土樣分為3份，一份新鮮土壤用于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測定;一份-80 ℃冰箱保存用于nosZ基因群落結(jié)構(gòu)和豐度分析;一份室內(nèi)風(fēng)干處理用于土壤化學(xué)指標(biāo)測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測定 采用鮑士旦的方法[22]進(jìn)行測定。土壤pH值采用電位法測定;有機(jī)碳（SOC）含量采用重鉻酸鉀氧化法測定;全氮（TN）含量采用凱氏定氮法測定;速效磷（AP）含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定;速效鉀（AK）含量采用乙酸銨提取-火焰光度法測定;銨態(tài)氮（NH+ 4-N）含量采用靛酚藍(lán)比色法測定;硝態(tài)氮（NO- 3-N）含量采用酚二磺酸比色法測定。

1.3.2 土壤DNA提取及nosZ基因擴(kuò)增和熒光定量PCR 稱取0.5 g土壤，按照E.Z.N.A. Mag-BindSoil DNA Kit（Omega，GA，USA）試劑盒操作步驟提取土壤DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，用核酸定量儀（Nanodrop-NC2000）檢測DNA濃度和純度。采用引物nosZ-F（5′-GGGCTBGGGCCRTTGCA-3′）與nosZ-R（5′-GAAGCGRTCCTTSGARAACTTG-3′）擴(kuò)增nosZ基因高變區(qū)片段[23]。

PCR產(chǎn)物純化回收后，將其連接至pMD8-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽性克隆，提取nosZ基因重組質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度經(jīng)核酸定量儀測定后，計(jì)算基因拷貝數(shù)，按照10倍梯度稀釋至103～108拷貝數(shù)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。

1.3.3 高通量測序 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后，樣品送至上海派森諾生物科技有限公司，運(yùn)用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序。使用QIIME軟件調(diào)用UCLUST序列比對工具，按照97%的序列相似度進(jìn)行OTU劃分和歸并，并選取豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。利用QIIME軟件將OTU的代表序列與功能基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲取每個OTU對應(yīng)的分類學(xué)信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行土壤化學(xué)性質(zhì)、反硝化細(xì)菌α多樣性指數(shù)、豐度和群落組成相對豐度的差異顯著性分析（α=0.05）和相關(guān)性分析。采用R軟件進(jìn)行主成分分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

由表1可知，不同設(shè)施菜地種植年限土壤pH值及有機(jī)碳、速效鉀含量均顯著小于CK，隨種植年限延長逐漸降低。種植3、5、7 年土壤全氮、速效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量均高于CK。種植5、7年土壤全氮含量分別比CK顯著增加38.26%、51.30%，種植3 年和CK差異不顯著。不同處理土壤速效磷含量大小順序?yàn)?年>3年>5年>CK。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量隨種植年限延長而增加，大小順序?yàn)?年>5年>3 年>CK。

2.2 nosZ基因豐度

由圖1可知，不同設(shè)施菜地種植年限土壤nosZ基因拷貝數(shù)變化范圍為5.19×106～8.78×106拷貝/g。不同設(shè)施種植年限nosZ基因拷貝數(shù)均顯著小于CK（P<0.05），CK分別是設(shè)施種植3、5、7年的1.32倍、1.45倍、1.69倍。設(shè)施種植3、5、7年的nosZ基因拷貝數(shù)之間差異不顯著，隨種植年限延長逐漸降低。

為明確nosZ基因豐度差異的影響因素，由nosZ基因豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析。由圖2可知，nosZ基因豐度分別與土壤pH值和有機(jī)碳含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;與土壤全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）;與速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）;與速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。

2.3 nosZ型反硝化微生物α多樣性指數(shù)

由表2可知，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)變化趨勢相同，范圍分別為1 057.51～1 423.84和1 070.06～1 429.96，各設(shè)施蔬菜種植年限的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均小于CK，隨種植年限延長而逐漸降低。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)范圍為6.20～7.02和0.82～0.86，種植7年均顯著小于其他處理（P<0.05）。Shannon指數(shù)在種植3 年時最高，大小順序?yàn)?年>CK>5 年>7年。Simpson指數(shù)在種植5年時最高，大小順序?yàn)?年>3年>CK>7年。

由相關(guān)性分析（圖2）可知，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別與土壤pH值、有機(jī)碳和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）;與全氮、速效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。Shannon指數(shù)與土壤有機(jī)碳含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）;與全氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）;與速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）;與銨態(tài)氮和硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

2.4 nosZ群落組成

由圖3可知，通過對樣品獲得的nosZ群落OTUs進(jìn)行歸類，在門水平上共獲得6個類群，分別為變形菌門（Proteobacteria）、Bacteria_unclassified、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）。 不同設(shè)施蔬菜種植年限土壤變形菌門、Bacteria_unclassified、酸桿菌門和綠彎菌門相對豐度差異顯著或極顯著。變形菌門、Bacteria_unclassified和芽單胞菌門為主要優(yōu)勢類群，相對豐度范圍為62.27%～70.42%、16.66%～25.19%和2.88%～3.82%。種植5、7年的變形菌門相對豐度均小于CK，分別比CK降低2.69%、10.34%。Bacteria_unclassified相對豐度在種植7年中最高，顯著高于種植3年和5年。芽單胞菌門相對豐度在3年中最高，種植5年中最低，大小順序?yàn)?年>7年>CK>5年。設(shè)施菜地種植年限對變形菌門有抑制作用，隨種植年限增加抑制作用增強(qiáng)。

在屬水平上，可得到平均相對豐度>1%的10個類群（圖4），分別為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、Bacteria_unclassified、無色桿菌屬（Achromobacter）、Aromatoleum、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、Azoarcus、固氮螺菌屬（Azospirillum）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）。其中慢生根瘤菌屬、Bacteria_unclassified、無色桿菌屬和紅假單胞菌屬相對豐度在不同設(shè)施蔬菜種植年限中差異顯著或極顯著。慢生根瘤菌屬、Bacteria_unclassified和無色桿菌屬為主要優(yōu)勢類群，相對豐度范圍為39.01%～47.88%、18.48%～27.68%和5.28%～8.57%。慢生根瘤菌屬相對豐度在不同設(shè)施種植年限均大于CK，分別是CK的1.23倍、1.12倍、1.07倍。無色桿菌屬相對豐度在種植7 年顯著小于其他處理，大小順序?yàn)?年>CK>3年>7年。Aromatoleum相對豐度隨設(shè)施蔬菜種植年限的延長逐漸增加，種植3年和5年均小于CK。

2.5 nosZ群落結(jié)構(gòu)及其與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

通過對nosZ群落進(jìn)行主成分分析（圖5）可知，不同設(shè)施種植年限土壤nosZ群落結(jié)構(gòu)差異明顯，第1、第2主成分軸共解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的69.94%，其中第1主成分軸解釋了總變異的48.41%，第2主成分軸解釋了總變異的21.53%。種植7年分別與種植3、5年在PC1和PC2上分離都較大，說明隨設(shè)施蔬菜種植年限延長，nosZ群落結(jié)構(gòu)變化較大;種植3、5年的群落相聚較近，說明群落相似度較大。

為分析土壤化學(xué)性質(zhì)對nosZ群落結(jié)構(gòu)的影響，對nosZ群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行冗余分析。由圖6可知，第1主軸能夠解釋所有信息的46.61%，第2主軸解釋22.44%，兩者累計(jì)解釋信息量達(dá)69.05%。由此可知，前2軸很好地反映了nosZ群落組成與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系，且第1主軸作用較大。

在屬水平上，進(jìn)一步對nosZ群落和土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（表3）。Bacteria_unclassied與土壤速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。無色桿菌屬與土壤有機(jī)碳含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。Aromatoleum與土壤有機(jī)碳含量和速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)，與全氮、銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)。蒼白桿菌屬與土壤pH值呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。固氮螺菌屬與土壤全氮、銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，與速效鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。紅假單胞菌屬與土壤pH值、有機(jī)碳和速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與全氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

長期種植設(shè)施蔬菜對土壤化學(xué)指標(biāo)有顯著影響，土壤全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量隨設(shè)施種植年限增加而顯著增加，同時也高于露天菜地（CK），可能由于設(shè)施栽培集約化種植，肥料持續(xù)高投入且長期連作限制植物生長，影響植物對養(yǎng)分的吸收，大部分養(yǎng)分在土壤中逐年積累[25-26]。由本研究結(jié)果可知，設(shè)施菜地土壤有機(jī)碳含量低于露天菜地（CK），隨種植年限延長逐漸降低，與前人研究結(jié)果[27-28]相反，但與Song等的研究結(jié)果[29]相似，可能與該區(qū)域很少施用有機(jī)肥及植物殘?bào)w歸還較少等因素有關(guān)。本研究中土壤pH值隨種植年限延長逐漸降低，與許多研究結(jié)果[30-31]相同，可能是由于長期過量施（氮）肥導(dǎo)致SO2- 4和NO- 3等不斷積累，最終引起土壤酸化增強(qiáng)。

反硝化作用主要由微生物驅(qū)動完成，與土壤施肥密切相關(guān)[32]。本研究中，nosZ數(shù)量隨設(shè)施種植年限增加逐漸下降，且顯著小于露天菜地（CK），可能由于設(shè)施蔬菜高水肥投入，土壤pH值降低，不利于微生物的N 2O還原酶組裝，降低N 2O還原酶活性，導(dǎo)致微生物對N 2O還原能力下降[33-34]。Hallin等研究認(rèn)為，nosZ基因拷貝數(shù)隨施氮量增加快速下降[32]。本研究中nosZ基因豐度與土壤pH值、有機(jī)碳含量呈顯著正相關(guān)，由于反硝化微生物為化能異養(yǎng)型生物，有機(jī)質(zhì)可作為能量來源[35]。Matlou等研究認(rèn)為，土壤有機(jī)碳含量與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系緊密，有機(jī)碳為土壤微生物活動提供需要的底物以及能量來源[36]。在本研究，隨設(shè)施蔬菜種植年限延長，土壤有機(jī)碳含量逐漸降低，不能為反硝化微生物提供充足的能量來源。Bowden等研究認(rèn)為，土壤有機(jī)碳積累是因?yàn)槲⑸锷锪繙p少導(dǎo)致[37]。土壤pH值是反硝化微生物數(shù)量變化的主要環(huán)境因子[38]。土壤pH值隨設(shè)施蔬菜種植年限延長逐漸降低，土壤酸化會引起鐵、鋁等積累，鐵、鋁氫氧化物通過吸附土壤可溶性碳來降低微生物對碳源的利用[39];土壤酸性越強(qiáng)，Al3+積累越多，對土壤細(xì)菌細(xì)胞膜損害越大[40]。Bauhus等研究表明，在酸性森林土壤中，添加磷可以促進(jìn)土壤反硝化[41]。本研究中，nosZ基因拷貝數(shù)與速效磷含量呈顯著相關(guān)，進(jìn)一步支撐了土壤磷對反硝化微生物具有調(diào)控作用，然而關(guān)于磷如何調(diào)控反硝化微生物生長的機(jī)制仍不清楚。硝態(tài)氮可作為反硝化底物和反硝化過程的電子受體，影響反硝化微生物生長[42]。本研究中，nosZ反硝化微生物群落ɑ多樣性指數(shù)在各處理差異顯著。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均是露天菜地（CK）最高，隨種植年限延長逐漸降低，可能由于設(shè)施蔬菜長期種植，土壤酸化和鹽漬化嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤反硝化細(xì)菌物種豐度降低。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是種植3年較高，7年較低，隨種植年限延長土壤反硝化微生物物種多樣性降低;可能是由于設(shè)施蔬菜長期種植，導(dǎo)致土壤有機(jī)碳含量下降，不能為反硝化微生物生長提供豐富碳源。

nosZ型反硝化細(xì)菌中優(yōu)勢類群均為變形菌門，與許多研究結(jié)果[12，43]一致。變形菌門的高低可反映土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量高低，同時在pH值較高的土壤環(huán)境中生長較好[44]。本研究中，變形菌門豐度隨種植年限延長表現(xiàn)出遞降趨勢，露天菜地（CK）和種植3年土壤最高，可能與土壤養(yǎng)分含量高及pH值較高有關(guān)，有利于變形菌門生長。屬水平上共有優(yōu)勢類群為慢生根瘤菌屬，相對豐度平均占nosZ基因序列的43%。種植3、5、7 年的慢生根瘤菌屬相對豐度均大于露天菜地（CK），隨種植年限延長逐漸降低。

相關(guān)研究人員認(rèn)為，反硝化微生物對施肥的反映差異性在于土壤pH值、全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量[32]。土壤pH值被認(rèn)為是影響反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子，pH值對反硝化微生物具有選擇效應(yīng)，其變化可以影響反硝化微生物的群落結(jié)構(gòu)，并進(jìn)而影響它們對環(huán)境變化的響應(yīng)[38]。本研究中，土壤pH值在不同處理中存在顯著差異，并且土壤pH值與nosZ相對豐度之間存在顯著相關(guān)關(guān)系，說明土壤pH值是引起反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要因素。硝態(tài)氮是反硝化的底物，硝態(tài)氮含量直接影響反硝化微生物的利用程度[45]。

nosZ基因豐度、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)變化趨勢一致，隨種植年限延長逐漸降低。門水平上，變形菌門相對豐度占nosZ型反硝化微生物總量的62.27%～70.42%，是設(shè)施菜地土壤共有優(yōu)勢類群，在種植3年土壤中最高。屬水平上，慢生根瘤菌屬和無色桿菌屬為共有優(yōu)勢類群。為準(zhǔn)確評價設(shè)施土壤反硝化作用變化規(guī)律，需要開展長期試驗(yàn)，同時還需要對涉及反硝化途徑的其他功能微生物群落進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hu W Y，Zhang Y X，Huang B，et al. Soil environmental quality in greenhouse vegetable production systems in eastern China：current status and management strategies[J]. Chemosphere，2017，170：183-195.

[2]榮勤雷.有機(jī)肥/秸稈替代化肥模式對設(shè)施菜田土壤團(tuán)聚體微生物特性的影響[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2018.

[3]寧德富，孔麗瓊，湯 娜，等. 不同種植年限蔬菜地土壤養(yǎng)分變化規(guī)律研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，34（1）：67-72.

[4]Sun J T，Pan L L，Zhan Y，et al. Contamination of phthalate esters，organochlorine pesticides and polybrominated diphenyl ethers in agricultural soils from the Yangtze River Delta of China[J]. Science of the Total Environment，2016，544：670-676.

[5]van der Heijden M G A，Wagg C.Soil microbial diversity and agro-ecosystem functioning[J]. Plant and Soil，2013，363（1/2）：1-5.

[6]Yao Z Y，Xing J J，Gu H P，et al. Development of microbial community structure in vegetable-growing soils from open-field to plastic-greenhouse cultivation based on the PLFA analysis[J]. Journal of Soils and Sediments，2016，16（8）：2041-2049.

[7]Li X G，Ding C F，Zhang T L，et al. Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing[J]. Soil Biology and Biochemistry，2014，72：11-18.

[8]Xiong W，Li R，Ren Y，et al. Distinct roles for soil fungal and bacterial communities associated with the suppression of Vanilla Fusarium wilt disease[J]. Soil Biology and Biochemistry，2017，107：198-207.

[9]Liu X，Zhang Y，Ren X J，et al. Long-term greenhouse vegetable cultivation alters the community structures of soil ammonia oxidizers[J]. Journal of Soils and Sediments，2019，19（2）：883-902.

[10]李生秀.中國旱地土壤植物氮素[M]. 北京：科學(xué)出版社，2008：3-5.

[11]Kuypers M M M，Marchant H K，Kartal B.The microbial nitrogen-cycling network[J]. Nature Reviews Microbiology，2018，16（5）：263-276.

[12]Thomson A J，Giannopoulos G，Pretty J，et al. Biological sources and sinks of nitrous oxide and strategies to mitigate emissions[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society（B：Biological Sciences），2012，367（1593）：1157-1168.

[13]楊亞東，宋潤科，馬俊永，等. 長期氮磷不同施用量對土壤細(xì)菌、硝化與反硝化微生物數(shù)量的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，23（9）：81-88.

[14]Hu H W，Chen D L，He J Z.Microbial regulation of terrestrial nitrous oxide formation：understanding the biological pathways for prediction of emission rates[J]. FEMS Microbiology Reviews，2015，39（5）：729-749.

[15]Shcherbak I，Millar N，Robertson G P.Global meta-analysis of the nonlinear response of soil nitrous oxide （N 2O） emissions to fertilizer nitrogen[J]. PNAS，2014，111（25）：9199-9204.

[16]Ravishankara A R，Daniel J S，Portmann R W.Nitrous oxide （N 2O）：the dominant ozone-depleting substance emitted in the 21st century[J]. Science，2009，326（5949）：123-125.

[17]Hallin S，Philippot L，L ffler F E，et al. Genomics and ecology of novel N 2O-reducing microorganisms[J]. Trends in Microbiology，2018，26（1）：43-55.

[18]Schreiber F，Wunderlin P，Udert K M，et al. Nitric oxide and nitrous oxide turnover in natural and engineered microbial communities：biological pathways，chemical reactions，and novel technologies[J]. Frontiers in Microbiology，2012，3：372.

[19]Domeignoz-Horta L，Putz M，Spor A，et al. Non-denitrifying nitrous oxide-reducing bacteria-An effective N 2O sink in soil[J]. Soil Biology and Biochemistry，2016，103：376-379.

[20]陳秀波，朱德全，趙晨晨，等. 涼水國家自然保護(hù)區(qū)不同林型紅松林土壤nosZ型反硝化微生物群落組成和多樣性分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2019，55（8）：106-117.

[21]Dandie C E，Burton D L，Zebarth B J，et al. Changes in bacterial denitrifier community abundance over time in an agricultural field and their relationship with denitrification activity[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（19）：5997-6005.

[22]鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：25-114.

[23]Chen Z，Hou H J，Zheng Y，et al. Influence of fertilisation regimes on a nosZ-containing denitrifying community in a rice paddy soil[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92（5）：1064-1072.

[24]Kloos K，Mergel A，Rosch C，et al. Denitrification within the genus Azospirillum and other associative bacteria[J]. Functional Plant Biology，2001，28（9）：991-998.

[25]宋蒙亞，李忠佩，吳 萌，等. 不同種植年限設(shè)施菜地土壤微生物量和群落結(jié)構(gòu)的差異[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（18）：3635-3644.

[26]王學(xué)霞，陳延華，王甲辰，等. 設(shè)施菜地種植年限對土壤理化性質(zhì)和生物學(xué)特征的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2018，24（6）：1619-1629.

[27]Liu Y，Liu X Y，F(xiàn)eng Y F，et al. Composition of a soil organic carbon increment under different vegetable cultivation patterns：a study using three SOC pools[J]. Sustainability，2018，11（1）：35.

[28]Wang Y，Xu H，Wu X，et al. Quantification of net carbon flux from plastic greenhouse vegetable cultivation：a full carbon cycle analysis[J]. Environmental Pollution，2011，159（5）：1427-1434.

[29]Song Y，Xu M，Li X N，et al. Long-term plastic greenhouse cultivation changes soil microbial community structures：a case study[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66（34）：8941-8948.

[30]高新昊，張英鵬，劉兆輝，等. 種植年限對壽光設(shè)施大棚土壤生態(tài)環(huán)境的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（5）：1452-1459.

[31]Yang L Q，Huang B A，Hu W Y，et al. The impact of greenhouse vegetable farming duration and soil types on phytoavailability of heavy metals and their health risk in Eastern China[J]. Chemosphere，2014，103：121-130.

[32]Hallin S，Jones C M，Schloter M，et al. Relationship between N-cycling communities and ecosystem functioning in a 50-year-old fertilization experiment[J]. The ISME Journal，2009，3（5）：597-605.

[33]田 浩，楊柳青，曹文超，等. 設(shè)施菜田與棚外糧田土壤菌群和反硝化氣體產(chǎn)生的比較分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（5）：835-844.

[34]Bergaust L，Mao Y J，Bakken L R，et al. Denitrification response patterns during the transition to anoxic respiration and posttranscriptional effects of suboptimal pH on nitrous oxide reductase in Paracoccus denitrificans[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（19）：6387-6396.

[35]Menyailo O V，Huwe B.Activity of denitrification and dynamics of N 2O release in soils under six tree species and grassland in central Siberia[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，1999，162（5）：533-538.

[36]Matlou M C，Haynes R J.Soluble organic matter and microbial biomass C and N in soils under pasture and arable management and the leaching of organic C，N and nitrate in a lysimeter study[J]. Applied Soil Ecology，2006，34（2/3）：160-167.

[37]Bowden R D，Davidson E，Savage K，et al. Chronic nitrogen additions reduce total soil respiration and microbial respiration in temperate forest soils at the Harvard Forest[J]. Forest Ecology and Management，2004，196（1）：43-56.

[38]Enwall K，Philippot L，Hallin S.Activity and composition of the denitrifying bacterial community respond differently to long-term fertilization[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（12）：8335-8343.

[39]Tang Y Q，Zhang X Y，Li D D，et al. Impacts of nitrogen and phosphorus additions on the abundance and community structure of ammonia oxidizers and denitrifying bacteria in Chinese fir plantations[J]. Soil Biology and Biochemistry，2016，103：284-293.

[40]Yaganza E S，Rioux D，Simard M，et al. Ultrastructural alterations of Erwinia carotovora subsp. atroseptica caused by treatment with aluminum chloride and sodium metabisulfite[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70（11）：6800-6808.

[41]Bauhus J，Khanna P K.Carbon and nitrogen turnover in two acid forest soils of southeast Australia as affected by phosphorus addition and drying and rewetting cycles[J]. Biology and Fertility of Soils，1994，17（3）：212-218.

[42]Liu C X，Dong Y H，Sun Q W，et al. Soil bacterial community response to short-term manipulation of the nitrogen deposition form and dose in a Chinese fir plantation in southern China[J]. Water，Air，& Soil Pollution，2016，227（12）：1-12.

[43]彭衛(wèi)福.土壤肥力對水稻氮素利用效率和氮循環(huán)相關(guān)微生物的影響[D]. 南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[44]萬 盼，胡艷波，張弓喬，等. 甘肅小隴山油松與柴胡栽培土壤細(xì)菌群落特征[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2018，38（17）：6016-6024.

[45]King D，Nedwell D B.The influence of nitrate concentration upon the end-products of nitrate dissimilation by bacteria in anaerobic salt marsh sediment[J]. FEMS Microbiology Letters，1985，31（1）：23-28.