玉米秸稈降解真菌的篩選鑒定

張艷萍 趙瑛 張運(yùn)暉

摘要：為篩選適宜的玉米秸稈纖維素降解菌株作為玉米秸稈腐熟菌劑菌株資源儲備，通過采用腐殖玉米秸稈土壤微生物培養(yǎng)篩選、剛果紅水解圈測試及酶活測定等多種方法的應(yīng)用，篩選得到2株具有纖維降解能力的真菌1#菌株和2#菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，初步確定1#菌株為長枝木霉，2#菌株為聚多曲霉。真菌1#菌株和2#菌株在剛果紅培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)比生長圈大2倍的水解圈。2個菌株在液體、固體2種酶液發(fā)酵情況下均表現(xiàn)內(nèi)切酶活較強(qiáng)（65.202～217.614 U/mL），均高于外切酶活（55.398～85.322 U/mL）和濾紙酶活（46.074～141.366 U/mL），認(rèn)為這2個菌株可作為玉米秸稈專用腐熟菌劑研發(fā)的儲備菌株。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈;降解;真菌;菌株;纖維素;篩選;鑒定

中圖分類號：S513;X172? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）05-0055-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.05.014

Screening and Identification of Fungi for Maize Straw Degradation

ZHANG Yanping， ZHAO Ying， ZHANG Yunhui

（Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to screen cellulose-degrading strains for maize straw as the reserve of decomposing agents， in this study， a variety of methods such as screening medium with only corn stalk powder，congo red hydrolytic circle test and enzyme activity determination were used toscreen out two strains 1# and 2# with fiber degradation ability. After morphological and molecular identification， strain 1# was Trichodema longibrachiatum and strain 2# was Aspergillus sydowii. Two fungi showed hydrolytic circles twice larger than growth circles on congo red medium. Through liquid and solid fermentation， two fungi showed stronger endonuclease activity（65.202 to 217.614 U/mL） than exonuclease activity（55.398 to 85.322 U/mL） and filter paper activity （46.074～141.366 U/mL）， two fungi could be used as reserve strains for developing special decomposing agent of maize straw.

Key words：Maize straw; Degrade; Fungus; Strain; Cellulose; Screening; Identification

作物的秸稈是一種有利于土壤改良的有機(jī)肥源，是直接有效的可再生資源，主要由木質(zhì)素和纖維素組成，含有非常豐富的有機(jī)質(zhì)、微量元素、氮、磷、鉀，可以提供農(nóng)作物生長所需的多種營養(yǎng)元素，對作物增產(chǎn)起到一定作用[1 - 2 ]。我國每年產(chǎn)生的玉米秸稈可超過2億t[3 ]。目前對秸稈較廣泛且有效的利用方式為直接機(jī)械破碎還田[4 - 5 ]。秸稈因其主要成分為纖維素、木質(zhì)素和半纖維素[6 ]，還田后普遍存在降解所需時間長問題，有時會影響種植需求[7 ]。能降解秸稈纖維素的微生物得到諸多學(xué)者的關(guān)注和研究[8 - 13 ]，這些微生物將是解決秸稈問題的重要資源。目前報道的秸稈降解菌雖然已經(jīng)很豐富，但菌株也會有衰退發(fā)生，篩選更多的秸稈降解菌作為資源庫儲備，對秸稈還田意義重大。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

1.1.1? ? 試驗(yàn)樣品? ? 腐殖玉米秸稈土壤采集于甘肅省臨洮縣玉米種植地。60目玉米秸稈購于惠豐秸稈農(nóng)產(chǎn)品深加工專業(yè)合作社。

1.1.2? ? 試驗(yàn)藥品? ? 試驗(yàn)中所用藥品試劑均購于甘肅艾爾維科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3? ? 培養(yǎng)基? ? 土壤中微生物培養(yǎng)、純化和保存采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），篩選采用玉米秸稈篩選培養(yǎng)基（YS）、羧甲基纖維素鈉剛果紅瓊脂培養(yǎng)基（CMC-Na），發(fā)酵采用玉米秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基（YFY）和玉米秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基（YFG）。①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃滅菌30 min。②YS培養(yǎng)基：稱取60目的玉米秸稈80 g，加蒸餾水煮沸30 min，用紗布過濾，濾液中加瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃滅菌30 min。③CMC-Na培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g、剛果紅0.4 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4 0.5 g、（NH4）2SO4 2.0 g、NaCl 0.5 g、瓊脂18.0 g，加蒸餾水定容至1 L，自然pH，121 ℃下滅菌30 min。④YFY培養(yǎng)基：稱取60目的玉米秸稈20 g，赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基1 000 mL，pH 7.2左右，121℃下滅菌30 min。⑤YFG培養(yǎng)基：稱取60目的玉米秸稈20 g，赫奇遜氏無機(jī)鹽培養(yǎng)基40 mL，pH 7.2左右，121 ℃蒸汽滅菌30 min。⑥赫奇遜氏（Huchinson）無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaNO3 2.5 g、KH2PO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 0.1 g、FeCl3 0.01 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2左右。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 菌株初篩? ? 稱取腐殖玉米秸稈土壤1 g接種于100 mL的PDA液體培養(yǎng)基內(nèi)，180 r/min、28 ℃富集培養(yǎng)24 h。在無菌操作臺內(nèi)，取1 mL培養(yǎng)液用無菌水按梯度稀釋至10、102、103、104、105的濃度，分別涂布于YS平板上，在28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。選取長勢旺盛的真菌菌株再接種于PDA培養(yǎng)基上純化后保存。

1.2.2? ? CMC-Na水解圈篩選? ? 將初篩得到的菌株用0.5 cm的打孔器制備成菌餅，分別倒置接種在CMC-Na培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5 d。根據(jù)剛果紅培養(yǎng)基顯示的透明圈的大小及透明圈與菌落直徑比，挑取比值大的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? ? 酶液的制備? ? ①液體發(fā)酵酶液的制備：將菌株孢子液（×108個孢子量）按1%的體積比接種到Y(jié)FY培養(yǎng)基上，28 ℃、200 r/min下培養(yǎng)6 d，取發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，取上清液即為制備的粗酶液。②固體發(fā)酵酶液的制備：將菌株孢子液（×108個孢子量）按10%的體積比接種到Y(jié)FG培養(yǎng)基上，28 ℃下暗培養(yǎng)6 d后取出1 g發(fā)酵培養(yǎng)物，加10倍于酶曲質(zhì)量的無菌水，30 ℃、200 r/min下浸提1 h，取發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.2.4? ? 酶活測定? ? ①全酶活（FPase）測定：將50 mg無淀粉的新華濾紙置于刻度試管，再加入1.5 mL檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5.0）和0.5 mL粗酶液，混合后50 ℃下水浴1h，隨后按DNS法測定還原糖含量[14 ]。②外切酶活（CBH）測定：將50 mg的脫脂棉置于刻度試管，再加入1. 5 mL檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5.0）和0.5 mL粗酶液，混合后放于50 ℃水浴1 h，隨后按DNS法測定還原糖含量[14 ]。③內(nèi)切酶活（EG）測定：取具刻度試管，依次加入1.5 mL含有1% CMC的檸檬酸緩沖液（0.05 mol/L、pH 5.0）和0.5 mL粗酶液，混合后50 ℃下水浴30 min，隨后按DNS法測定還原糖含量[14 ]。

酶活性單位定義：50 ℃時1 mL酶液在1 h內(nèi)生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

酶活力（U/mL）=（葡萄糖含量×1 mg葡萄糖物質(zhì)的量）/（酶液用量×反應(yīng)時間×1 000）

1.2.5? ? 菌株鑒定? ? ① 形態(tài)學(xué)觀察。蘸取一環(huán)菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察和記錄菌株生長形態(tài)。②分子生物學(xué)鑒定。菌株DNA提取和ITS擴(kuò)增測序均交于南京集思慧遠(yuǎn)公司進(jìn)行。將測序結(jié)果拼接，除去兩端不可信序列，利用Nucleotide BLAST進(jìn)行序列比對分析，用MEGA 6.0軟件聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?玉米秸稈降解真菌篩選

通過富集、稀釋，從篩選培養(yǎng)基YS上篩選培養(yǎng)的微生物中，選取其中生長旺盛的2株真菌，分別標(biāo)記為1#菌株和2#菌株，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)點(diǎn)接進(jìn)行分離純化。

2.2?  CMC-Na水解圈檢測

純化好的真菌接于剛果紅培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑（d）和水解圈直徑（D），以D/d > 2為界限篩選菌株（表1）。結(jié)果（圖1）顯示，在剛果紅培養(yǎng)基上1#菌株和2#菌株均有所生長，生長圈呈圓形，直徑分別為1.73 cm和1.67 cm，生長圈邊緣均呈現(xiàn)比生長圈大2倍的水解圈，直徑分別為3.83 cm和3.40 cm。

2.3? ?菌株纖維素酶活力

將1#菌株和2#菌株分別進(jìn)行液體和固體發(fā)酵下的濾紙酶活（Fpase）、外切酶活（CBH）和內(nèi)切酶活（EG）測定結(jié)果（表2）顯示，2個菌株在液體、固體2種發(fā)酵情況下均表現(xiàn)為內(nèi)切酶活較強(qiáng)（65.202～217.614 U/mL），均高于外切酶活（55.398～85.322 U/mL）和濾紙酶活（46.074～141.366 U/mL）。

2.4? ?菌株形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1? ? 形態(tài)鑒定? ? 1#菌株在PDA培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)5 d，菌體鋪滿整個培養(yǎng)皿，菌絲在菌落中央生長濃密且為草綠色，向外逐漸生長稀疏且顏色變淺，邊緣白色菌斑較多。菌體生長的培養(yǎng)基顏色也變?yōu)辄S綠色（圖2）。2#菌株在PDA培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)5 d，菌體僅在初期接種部位有所生長變厚，初期為白色，逐漸變成灰黑色（圖3）。

2.4.2? ? 分子生物學(xué)鑒定? ? 對1#菌株和2#菌株進(jìn)行ITS擴(kuò)增測序，對測序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行同源比對分析可看出，1#菌株的基因序列與公開發(fā)表的木霉屬同源性較高，相似度達(dá)99.66%;2#菌株與曲霉屬同源性較高，相似度達(dá)99.81%。采用MEGA6.0的Neighbor-Joining將1#菌株與木霉菌屬內(nèi)的多個不同種的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，遺傳距離顯示1#菌株與長枝木霉種的最近（圖4）。對2#菌株與曲霉菌屬內(nèi)的多個不同種的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，遺傳距離顯示菌株2#與聚多曲霉種最近（圖5）。結(jié)合形態(tài)鑒定，參照《真菌鑒定手冊》《中國真菌志》并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15 - 20 ]，初步確定1#菌株為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），2#菌株為聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。

3? ?結(jié)論與討論

試驗(yàn)通過采用腐殖玉米秸稈土壤微生物培養(yǎng)篩選、剛果紅水解圈測試及酶活測定等多種方法，篩選得到了2株具有纖維降解能力的菌株1#菌株和2#菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，初步確定1#菌株為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），2#菌株為聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。1#菌株和2#菌株在液體、固體2種發(fā)酵情況下均表現(xiàn)內(nèi)切酶活較強(qiáng)（65.202～217.614 U/mL），均高于外切酶活（55.398～85.322 U/mL）和濾紙酶活（46.074～141.366 U/mL）。纖維素酶不是單一酶，而是起協(xié)同作用的能夠使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，其中外切酶和內(nèi)切酶主要的作用就是溶解纖維素[21 ]。經(jīng)測定1#菌株和2#菌株均有較高的內(nèi)切酶活和外切酶活，接下來應(yīng)進(jìn)一步探索其對玉米秸稈纖維素的降解能力，分析將其制備成玉米秸稈腐熟菌劑的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用價值。

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