抑制GRK2異常轉(zhuǎn)膜控制JAK1-STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少CIA小鼠樹突狀細(xì)胞的成熟

張春梅，斯 夢，劉瀟一，楊雪枝，姜 玲，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心、安徽醫(yī)科大學(xué)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究中心，安徽 合肥 230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)對稱性發(fā)展的慢性滑膜炎為特征，關(guān)節(jié)的持續(xù)炎癥最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至殘疾[1]。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中不同免疫細(xì)胞復(fù)雜的相互作用和活化參與RA疾病的發(fā)生發(fā)展。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，可啟動次級淋巴組織中的幼稚T細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，并浸潤滑膜組織和滑液，在局部吸收、加工和呈遞抗原，從而促進(jìn)RA的持續(xù)存在[2]。IFN-α主要由漿細(xì)胞樣DCs產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn),在一部分RA患者中Ⅰ型干擾素上調(diào)，IFN-α可以與IFNAR1和IFNAR2結(jié)合引起Janus激酶1(Janus kinase 1，JAK1)和tyrosine 激酶2(tyrosine kinase 2，TYK2)的激活，從而引起下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1(signal transducers and activators of transcription，STAT1)/STAT2的磷酸化，隨后p-STAT1/p-STAT2進(jìn)入細(xì)胞核以啟動炎癥因子轉(zhuǎn)錄[3]。JAK-STAT信號通路已被確認(rèn)參與RA中各種免疫細(xì)胞的激活和炎癥細(xì)胞因子的釋放。JAK抑制劑通過阻斷JAK-STAT信號通路，從而抑制炎癥因子的釋放和免疫細(xì)胞的激活，在RA的治療中取得了較好的治療效果，但藥物不良反應(yīng)很多[4]，這可能與炎癥免疫反應(yīng)的過度調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，我們提出炎癥免疫反應(yīng)軟調(diào)節(jié)，通過在不同細(xì)胞中尋找共同或相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵分子和特征，同時(shí)盡量地減少對細(xì)胞的傷害，選擇性的將異常變化的細(xì)胞活性恢復(fù)到生理水平[5-6]。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)是被廣泛研究的藥物靶點(diǎn)，主要是因?yàn)樗鼈兣c人體生理、病理和藥理活性密切相關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)通過磷酸化活性受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)多種GPCR，導(dǎo)致受體脫敏和內(nèi)化[7]。越來越多的數(shù)據(jù)表明，GRK2在RA等炎癥性疾病中高表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)炎癥免疫細(xì)胞反應(yīng)[8]。在生理?xiàng)l件下，GRK2主要位于細(xì)胞質(zhì)中，炎癥情況下GRK2向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化[9]、成纖維樣滑膜細(xì)胞異常增殖[10]、內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移并促進(jìn)血管生成[11]，促進(jìn)RA的發(fā)生發(fā)展。研究表明GRK2參與多種信號通路的調(diào)控，如PI3K/Akt、TLR、p38 MAPK、MEK1/2、ERK1/2等信號通路[6，12]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IFN-α刺激后頜下腺細(xì)胞中GRK2與JAK1之間共定位減少[13]，提示GRK2與JAK1之間可能存在聯(lián)系，但是有關(guān)GRK2與JAK1-STAT1信號通路的關(guān)系尚未報(bào)道。本文主要通過建立小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型和體外誘導(dǎo)DCs細(xì)胞模型研究GRK2與JAK1之間關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)RA的新的病理機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級DBA/1 ♂小鼠，7～8 w，(18±2)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理學(xué)研究所SPF動物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20～25)℃，濕度(40%～70%)，光照12 h?！?BALB/c小鼠，6～8 w，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2試劑 雞Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)(批號20011)購自美國Chondrex公司。RPMI 1640培養(yǎng)基(批號01-100-1ACS)和胎牛血清(批號04-001-1ACS)購自以色列BI公司。GSK180736A(批號HY-18990)和tofacitinib(批號477600-75-2)購自美國MedChemExpress公司。GRK2(批號sc-13143)和protein A/G瓊脂糖(批號sc-2003)購自美國Santa公司。重組鼠干擾素-α(IFN-α)(批號752802)、APC-CD11c(批號117309)、FITC-MHCⅡ(批號107615)均購自美國BioLegend公司。流式抗體PE-CD83(批號130-104-474)、PE-Cy7-CD40(批號130-116-112)、PB450-CD86(批號130-123-279)均購自德國Miltenyi公司。PGE2(批號3632464)、重組鼠白介素4(rmIL-4)(批號021749)、重組鼠粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(批號091855)均購自美國Peprotech公司。JAK1(批號ab133666)、p-STAT1(批號ab109461)抗體購自英國Abcam公司。p-JAK1(批號AF2012)、STAT1(批號AF6300)抗體購自美國Affinity公司，ELISA試劑盒PGE2(批號ml037542)、IFN-α(批號ml002017)、IL-6(批號ml002293-J)、TNF-α(批號ml002095-J)均購自上海酶聯(lián)公司。

1.1.3儀器 Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；Image Quant化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司)；Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；Leica DM4B 正置熒光顯微鏡(Leica公司)；Beckman CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman 公司)；ImageStreamX MarkⅡ成像流式細(xì)胞儀(Meck Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠CIA模型的建立 在無菌條件下，將雞CⅡ溶解在乙酸(0.1 mol·L-1)中，終濃度為2 g·L-1，4 ℃過夜。BCG疫苗80 ℃滅活1 h，溶于液體石蠟，冰上研磨2 h，制備終濃度為2 g·L-1的弗氏完全佐劑(CFA)。二者等體積混合研磨乳化制成Ⅱ型膠原乳劑。于小鼠尾根部多處皮內(nèi)注射0.1 mL，d 21后加強(qiáng)注射，d 29開始評分。

1.2.2小鼠整體指標(biāo)評分 根據(jù)小鼠CIA模型評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，建立的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：無腫脹和局部發(fā)紅跡象；1分：踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑及輕微腫脹；2分：踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)出現(xiàn)中度紅腫；4分：踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)出現(xiàn)中度紅腫。對所有爪子進(jìn)行評分，每只小鼠的最大可能關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分為16。每只爪子都有五個(gè)指骨關(guān)節(jié)和一個(gè)踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)，因此每只小鼠的最大腫脹關(guān)節(jié)數(shù)為24。小鼠踝關(guān)節(jié)用石蠟包埋，切片進(jìn)行HE染色，觀察滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤、軟骨破壞、血管翳生成的情況。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測CIA小鼠外周血和脾臟中DCs表型 使用淋巴細(xì)胞分離液分離出小鼠外周血和脾臟中的淋巴細(xì)胞，置于15 mL離心管中，加適量PBS清洗2遍，1 mL PBS重懸，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取5×106個(gè)細(xì)胞，分別加入流式抗體CD11c、MHCⅡ、CD40、CD83，避光孵育30 min，加適量PBS離心洗去抗體，300 μL PBS重懸細(xì)胞，過濾網(wǎng)上機(jī)檢測。

1.2.4免疫組化法檢測小鼠脾臟中p-JAK1、p-STAT1、GRK2表達(dá) 將小鼠脾臟包埋切片，(1)脫蠟：將切片于60 ℃烘箱放置2 h，然后置于二甲苯浸泡2次(每次20 min)。(2)水化：100%乙醇浸泡2次(每次5 min)，95%乙醇2 min，85%乙醇2 min，70% 乙醇2 min，雙蒸水5 min，PBS洗3遍。加0.5% triton 通透20 min，PBS洗3遍。(3)抗原修復(fù)：EDTA修復(fù)10 min，PBS洗3遍，3% H2O220 min，PBS洗3遍。然后加3% BSA封閉1 h，PBS洗3遍，加p-JAK1(1 ∶50)、p-STAT1(1 ∶100)、GRK2(1 ∶50)一抗孵育過夜。PBS洗3遍，加二抗孵育20 min，PBS洗3遍，加DBA染色，蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹脂封片。

1.2.5小鼠骨髓源DCs的培養(yǎng) BALB/c小鼠處死后，于無菌環(huán)境中取出小鼠股骨，75%乙醇浸泡1 min，PBS沖洗2遍，用RPMI 1640培基沖出骨髓，6孔板鋪板。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，留貼壁細(xì)胞，加入含GM-CSF(20 μg·L-1)和IL-4(20 μg·L-1)的RPMI 1640培基，隔天半量換液，補(bǔ)充GM-CSF和IL-4，d 7收集骨髓源DCs。

1.2.6ELISA檢測CIA小鼠血漿中IFN-α、PGE2、IL-6、TNF-α以及DCs培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α水平 收集小鼠外周血血漿和各組DCs培養(yǎng)上清，根據(jù)ELISA試劑盒使用標(biāo)準(zhǔn)檢測IFN-α、PGE2、IL-6、TNF-α水平。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測DCs表型以及吞噬功能 收集d 7的DCs,于6孔板中培養(yǎng)，分為4組，加入IFN-α(40 μg·L-1)和PGE2(1 μmol·L-1)刺激24 h后，分別加入GRK2抑制劑(GSK180736A)(2 μmol·L-1)和tofacitinib(10 μmol·L-1)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞于EP管中，2 000 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞上清留作ELISA樣本。BMDCs中加入CD11c、CD40、CD83、CD86和MHCⅡ抗體，避光孵育30 min，加入PBS離心洗去抗體，300 μL的PBS重懸，過濾網(wǎng)后上機(jī)檢測。吞噬功能檢測步驟與表型檢測一致，各組細(xì)胞等量分成兩管，分別加入FITC-dextran(1 g·L-1)抗體100 μL，于4 ℃和37 ℃兩種環(huán)境下，避光孵育90 min，加入PBS洗去抗體，300 μL的PBS重懸細(xì)胞，過濾網(wǎng)上機(jī)檢測。

1.2.8Western blot法檢測BMDCs中JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1以及細(xì)胞膜GRK2表達(dá) DCs培養(yǎng)48 h后，收集DCs于EP管中，加入適量的細(xì)胞裂解液，提取總蛋白?？偟鞍子?00 000g下離心1 h，留沉淀，加入適量細(xì)胞裂解液溶解沉淀，得細(xì)胞膜蛋白。加入蛋白上樣緩沖液后于100 ℃煮10 min，使蛋白變性。10%的SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，加JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1、GRK2抗體4 ℃孵育過夜，TPBS洗去一抗，二抗37 ℃孵育2 h，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，ImageJ軟件于分析灰度值。

1.2.9成像流式法檢測BMDCs中p-STAT1的入核情況 同“1.2.7”收集DCs后，加入100μL的細(xì)胞固定液避光孵育10 min，PBS洗去固定液，之后加100 μL細(xì)胞破膜液，避光孵育15 min。除空白管外，其余各組加p-STAT1抗體室溫孵育40 min，PBS洗1遍，棄去上清后，加熒光二抗避光孵育40 min，PBS洗去熒光二抗，加DAPI避光孵育5 min，隨后加入PBS洗去DAPI，棄去上清，加200 μL的PBS重懸，過濾網(wǎng)上機(jī)檢測。

1.2.10免疫共沉淀檢測DCs中JAK1與GRK2共表達(dá)情況 同“1.2.8”收集細(xì)胞蛋白留用，取80 μL protein A/G珠置于EP管中，再加16 μL IgG抗體與protein A/G珠孵育2 h后，加COIP洗液清洗3遍，等量分為4管，分別加入各組細(xì)胞蛋白液孵育2 h，同時(shí)取80 μL protein A/G珠置于EP管中，再加16 μL GRK2抗體與protein A/G珠孵育2 h，取GRK2管，加COIP洗液清洗3遍，等量分為4管。取IgG管，3 000 r·min-1離心5 min，留上清加到GRK2管孵育16 h以上。3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，留珠子，加COIP洗液清洗3遍，加入細(xì)胞裂解液和蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。后續(xù)步驟同“1.2.8”。

2 結(jié)果

2.1 CIA小鼠整體指標(biāo)與炎癥因子的變化小鼠CIA模型成功建立，并根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)進(jìn)行評分，發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及關(guān)節(jié)腫脹數(shù)在d 38～41達(dá)到高峰，然后關(guān)節(jié)腫脹開始消退。與正常組相比，CIA模型組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)與足爪腫脹度明顯升高(P<0.01)(Fig 1A)，對小鼠踝關(guān)節(jié)HE染色評分，CIA模型組有明顯滑膜細(xì)胞增殖、淋巴細(xì)胞浸潤、軟骨侵蝕、血管翳生成(P<0.01)(Fig 1B)。ELISA結(jié)果顯示，CIA模型組小鼠血漿中IFN-α、PGE2、IL-6、TNF-α含量明顯上升(P<0.01)(Fig 1C)。

Fig 1 Overall indicators of CIA mice

2.2 CIA小鼠外周血和脾臟中DCs活化研究表明，RA患者體內(nèi)DCs活化，并參與RA的發(fā)生發(fā)展。流式細(xì)胞術(shù)檢測CIA小鼠外周血中DCs共刺激分子CD40、CD83的變化。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，與正常組相比，CIA小鼠外周血中DCs表面共刺激分子CD40、CD83明顯上調(diào)(P<0.01)(Fig 2A)，CIA小鼠脾臟中DCs表面共刺激分子CD40(P<0.05)、CD83(P<0.01)同樣上調(diào)(Fig 2B)。提示CIA模型小鼠的DCs處于活化狀態(tài)。

Fig 2 Expression of costimulatory molecules on surface of DCs detected by flow cytometry in CIA mice

2.3 CIA小鼠脾臟中p-JAK1、p-STAT1和GRK2的表達(dá)增加免疫組化法結(jié)果顯示，CIA模型小鼠脾臟中p-JAK1、p-STAT1表達(dá)明顯增加(P<0.01)(Fig 3A、3B)。課題組前期發(fā)現(xiàn)AA大鼠淋巴細(xì)胞中GRK2的表達(dá)增加[14]。免疫組化法檢測小鼠脾臟GRK2表達(dá)的變化，CIA模型小鼠脾臟中GRK2表達(dá)明顯增加(P<0.01)(Fig 3C)。相關(guān)性分析結(jié)果表明GRK2與p-JAK1、p-STAT1的表達(dá)呈正相關(guān)(Fig 4A)。為了進(jìn)一步確定GRK2是否與JAK1-STAT1信號通路有關(guān)，免疫共沉淀結(jié)果表明，CIA模型組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中GRK2與JAK1的共表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)(Fig 4B)。

Fig 3 Expression of p-JAK1/p-STAT1 and GRK2 in spleen of CIA mice detected by

Fig 4 Correlation between GRK2 and JAK1-STAT1 signaling pathway

2.4 GRK2抑制劑調(diào)節(jié)DCs的功能為了確定GRK2和JAK1在DCs中的作用，我們將小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)成DCs，使用IFN-α和PGE2刺激48 h模擬炎癥環(huán)境，再給予GSK180736和tofacitinib培養(yǎng)24 h。為確認(rèn)各組細(xì)胞活力是否有差異，使用CCK-8法對各組DCs的活力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞活力無明顯變化(Fig 5A)。ELISA和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，刺激組DCs中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.01)，吞噬功能下調(diào)(P<0.01)，其表面共刺激分子CD40、CD86、CD83、MHCⅡ水平上調(diào)(P<0.01)，與IFN-α+PGE2組相比，GSK180736A下調(diào)DCs中炎癥因子IL-6、TNF-α水平(P<0.01)(Fig 5B)，上調(diào)DCs吞噬功能(P<0.01)(Fig 5C)，并下調(diào)DCs中CD40(P<0.01)、CD86(P<0.01)、CD83(P<0.05)、MHCⅡ(P<0.05)的水平(Fig 6)。提示DCs的功能與GRK2的活性有關(guān)。

Fig 5 Effect of GRK2 inhibitor on secretion of inflammatory factors and phagocytosis of DCs

2.5 GRK2抑制劑對DCs中胞膜GRK2的表達(dá)以及GRK2與JAK1共定位的影響為了進(jìn)一步確定GRK2對DCs中JAK1-STAT1信號通路的影響，Western blot結(jié)果表明，與control組相比，IFN-α+PGE2組DCs胞膜GRK2上調(diào)(P<0.01)，GSK180736A下調(diào)DCs胞膜GRK2的表達(dá)(P<0.01)(Fig 7A)。免疫共沉淀結(jié)果表明，與control組相比，IFN-α+PGE2組GRK2與JAK1共表達(dá)減少(P<0.05)，與IFN-α+PGE2組相比，GSK180736A組GRK2與JAK1共表達(dá)增加(P<0.05)，而tofacitinib組并無變化(Fig 7B)。提示GRK2抑制劑通過抑制炎癥環(huán)境下GRK2向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移，將其留在胞質(zhì)中，增加與JAK1的共定位。

Fig 6 Effect of GRK2 inhibitor on expression of CD40，CD83，CD86，and MHCⅡ on DCs treated with IFN-α and PGE2

Fig 7 Effect of GRK2 inhibitor on expression of GRK2 membrane in DCs and co-expression between GRK2 and JAK1

Fig 8 Effect of GRK2 inhibitor on JAK1-STAT1 pathway in DCs

2.6 GRK2抑制劑對DCs中JAK1-STAT1信號通路的影響為了進(jìn)一步評估GRK2對DCs中JAK1-STAT1信號通路的調(diào)節(jié)作用，Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，IFN-α+PGE2組p-JAK1、p-STAT1表達(dá)增加(P<0.01)，GSK180736A組p-JAK1(P<0.05)、p-STAT1(P<0.01)表達(dá)降低，tofacitinib組p-JAK1、p-STAT1表達(dá)降低(P<0.01)(Fig 8A)。成像流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，IFN-α+PGE2組p-STAT1入核率增加(P<0.01)，與IFN-α+PGE2組相比，GSK180736A組和tofacitinib組p-STAT1入核率下調(diào)(P<0.01)(Fig 8B)。提示DCs功能的變化與GRK2調(diào)控JAK1-STAT1信號通路有關(guān)。

3 討論

DCs作為體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，參與RA的發(fā)病機(jī)制。在穩(wěn)態(tài)情況下，DCs表現(xiàn)未成熟表型，其特征在于低表達(dá)共刺激分子和炎性細(xì)胞因子，當(dāng)遇到外來抗原以及炎癥環(huán)境刺激時(shí)，未成熟DCs分化成為成熟的DCs，高表達(dá)共刺激分子，并分泌大量炎癥因子促進(jìn)T細(xì)胞活化，成熟DCs浸潤滑膜和關(guān)節(jié)組織，加重炎癥免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)RA的持續(xù)發(fā)展[15]。研究表明JAK-STAT信號通路在RA患者中激活。JAK抑制劑在RA的治療中表現(xiàn)出較好的療效，但長期使用會帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括帶狀皰疹發(fā)病率增加、嚴(yán)重感染、靜脈血栓栓塞、自然殺傷細(xì)胞數(shù)量減少、血小板減少和貧血等[4]。JAK抑制劑引起的不良反應(yīng)可能與長期使用導(dǎo)致JAK-STAT信號功能喪失有關(guān)，JAK-STAT信號通路涉及機(jī)體各種生理功能，如JAK1信號缺失可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病和嚴(yán)重淋巴細(xì)胞損傷、JAK2信號缺失可引起造血功能受損并導(dǎo)致胚胎死亡，JAK3的缺失引起嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷、TYK2的缺陷可產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏表型[4，16]。因此，需要恢復(fù)炎癥信號通路正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡量減少或避免因過度抑制炎癥信號通路而引發(fā)的不良反應(yīng)。GRK2廣泛存在于各種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，主要位于細(xì)胞質(zhì)，并調(diào)控多種信號通路的活化，如細(xì)胞質(zhì)的GRK2可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1/2信號通路的激活，炎癥情況下的GRK2向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移導(dǎo)致ERK1/2信號通路活化，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力增加，抑制GRK2異常轉(zhuǎn)膜可恢復(fù)ERK1/2正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力[11]。但GRK2的轉(zhuǎn)膜是否調(diào)控JAK1-STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)尚不清楚，本研究主要探討GRK2對DCs中JAK1-STAT1信號通路的調(diào)控作用。

我們構(gòu)建了CIA小鼠模型，結(jié)果顯示CIA模型小鼠外周血和脾臟中DCs共刺激分子CD40和CD83的表達(dá)上調(diào)，血漿中IL-6、TNF-α、PGE2和IFN-α的含量增加，這些結(jié)果表明DCs在CIA小鼠中被激活。而CIA小鼠脾臟中的JAK1-STAT1信號通路被激活，GRK2的表達(dá)增加，并且GRK2與JAK1的共定位在CIA小鼠脾臟中明顯下調(diào)。提示GRK2與JAK1-STAT1信號通路存在相關(guān)性。

為了進(jìn)一步確定GRK2與DCs中JAK1-STAT1信號通路的關(guān)系，我們在體外用骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)DCs進(jìn)行研究。結(jié)果表明，GRK2抑制劑降低了經(jīng)IFN-α和PGE2的刺激的DCs中CD40、CD83、CD86和MHCⅡ的表達(dá)，增強(qiáng)抗原攝取能力，減少炎癥因子分泌。另外有研究表明沉默STAT1抑制了CD40、CD83和CD86的上調(diào)，并減弱了TNF-α、IL-6和IL-12的分泌，這表明STAT1與DCs的功能有關(guān)[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DCs經(jīng)IFN-α和PGE2刺激后，GRK2在細(xì)胞膜表達(dá)增多，且GRK2與JAK1共定位減少，JAK1-STAT1信號通路激活，p-STAT1入核率增加，GRK2抑制劑抑制了GRK2向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移將其留在細(xì)胞質(zhì)中，并增加了GRK2與JAK1的共定位，p-JAK1、p-STAT1表達(dá)減少，p-STAT1的入核率降低。這些結(jié)果表明，在IFN-α和PGE2的刺激下，GRK2發(fā)生異常轉(zhuǎn)膜降低了對JAK1-STAT1信號通路的控制，通過抑制GRK2向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移，恢復(fù)JAK1-STAT1信號通路正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減少DCs的成熟。

基于以上研究，在炎癥條件下，細(xì)胞膜上的GRK2增加，JAK1-STAT1失去控制，引起下游信號異常轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，課題組前期研究表明，EP4-cAMP信號通路被PGE2激活，GRK2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜引起EP4受體脫敏，導(dǎo)致cAMP水平降低，DCs成熟度增加[10，18]。當(dāng)抑制GRK2向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移時(shí)，EP4受體恢復(fù)敏感性，下游cAMP水平被恢復(fù)，同時(shí)留在胞質(zhì)中的GRK2抑制JAK1的激活，從而降低DCs的成熟度。在本研究中，我們對GRK2調(diào)節(jié)DCs功能的作用有了更深入的了解，這可能與控制JAK1-STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。本文也為調(diào)控細(xì)胞異常活化恢復(fù)至生理水平的藥物研究提供了新的依據(jù)。但GRK2調(diào)控JAK1的具體作用分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。