多功能皮特不動桿菌3K32菌株的發(fā)酵優(yōu)化

王鵬，車永梅，李雅華，趙方貴，王耀斌，姚甲淋，劉月田，劉新

(1. 山東青島煙草有限公司，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，山東青島 266109；3. 施可豐化工股份有限公司，山東臨沂 276023)

氮、磷和鉀是植物必需的大量元素，氮和磷是核酸、核蛋白和磷脂等重要生命物質(zhì)的組成成分，鉀參與調(diào)節(jié)氣孔運動、多種酶活性及細(xì)胞滲透勢等，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。植物對氮、磷和鉀的需求量大，土壤中可溶性氮、磷和鉀往往不能滿足作物的需求。長期以來，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要通過使用化學(xué)肥料補(bǔ)充植物需要的氮、磷和鉀等元素。化學(xué)肥料的大量使用引發(fā)一系列生態(tài)問題，如，土壤肥力下降，土壤微生態(tài)環(huán)境惡化及大氣和水體污染等[1]。如何降低化學(xué)肥料用量是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的問題。

土壤中90%～98%的鉀以礦質(zhì)形式存在[2-3]，大部分磷以難溶性化合物形式存在，僅有0.1%的磷能被植物直接吸收利用。生產(chǎn)中使用的磷肥中75%～90%的磷會很快與Ca2+、Fe3+、Fe2+和Al3+等結(jié)合形成難溶性磷。土壤微生物在土壤元素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，如，固氮菌可以將大氣中游離態(tài)氮轉(zhuǎn)化成植物可以直接吸收利用的氮，解磷菌和解鉀菌分別能將土壤中不溶性磷和鉀轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟梢灾苯游绽玫目扇苄粤缀外沎2,4]。利用土壤有益微生物提高土壤有效氮、磷和鉀含量是減少化學(xué)肥料用量及提高肥料利用效率的理想措施[5]。人們對固氮菌研究較早，對其固氮作用和機(jī)理研究較深入。近年來解磷菌和解鉀菌受到廣泛關(guān)注，目前已有多種解磷和解鉀微生物被分離鑒定。不同解磷菌和解鉀菌的解磷和解鉀能力、生物學(xué)特性及對環(huán)境的適應(yīng)性等存在差異。從杭州西湖和武漢巢湖等地分離到的解磷菌分別具有分解有機(jī)磷和無機(jī)磷的作用[6-7]；從香蕉根際分離到多種解磷菌具有溶解Ca3(PO4)2和大豆卵磷脂的作用[8]；從大豆根際分離的解磷菌成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)R-42具有一定分解FePO4和AlPO4的能力[9]。腸桿菌(Enterobactersp.)KM977992兼具解磷和解鉀功能[10]。假單胞菌(Pseudomonassp.) S14-3分解黑云母的能力比白云母高37%[11]；從馬鈴薯根際分離的多種解鉀菌對長石具有較強(qiáng)分解能力[12]；從水稻根際分離的多種解鉀菌具有不同分泌生長素的能力[13]；在酸性、堿性、低溫及干旱等不同環(huán)境中存在不同解鉀菌[14]。陳臘等[15]從中國東北黑土區(qū)的玉米根際土壤中篩選出3株解鉀菌，可耐受干旱、強(qiáng)堿及一定程度的酸和鹽。解磷菌的促生作用在水稻、小麥、薄荷和大豆等作物上得到驗證[16-18]。解鉀菌可影響土壤理化性狀及微生物活性進(jìn)而影響植物生長發(fā)育[19-20]。

目前雖然已從不同作物根際分離鑒定了多種解磷和解鉀微生物，但解磷和解鉀微生物資源尚不夠豐富，尤其缺乏兼具多種功能且對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的微生物。本實驗室從煙草根際分離到一株皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)，菌株編號為3K32，該菌具有解鉀、解磷和固氮等多種功能，為提高3K32菌株的增殖效率，本文擬對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為其開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：皮特不動桿菌3K32菌株，由本實驗室自山東省高密市煙草根際土壤中分離、鑒定和保存。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))和基礎(chǔ)培養(yǎng)基[蔗糖10 g·L-1、(NH4)2SO410 g·L-1、K2HPO42 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、FeCl3·6 H2O 5 g·L-1、pH 7.2 ]。

1.2 試驗方法

1.2.1 3K32菌株的活化與種子培養(yǎng)

將冰箱保存的菌株3K32接種在LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃、120 r·min-1的搖床培養(yǎng)活化20 h左右。將培養(yǎng)好的3K32菌液按照2%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 h作為種子待用。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素優(yōu)化：將2%的解鉀菌3K32種子接種到裝瓶量為20%的不同發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)20 h，檢測生物量OD600值。

碳源優(yōu)化：采用等量的碳源(甘油、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、淀粉和玉米粉)代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖，其他成分配比不變，培養(yǎng)后測定不同碳源對解鉀菌3K32的生物量影響，篩選出最佳的碳源；然后對最佳碳源設(shè)置不同添加量(10、15、20和25 g·L-1)，篩選最佳濃度。

氮源優(yōu)化：采用等量氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素以及豆餅粉)代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫酸銨，其他成分配比不變，測定不同氮源對菌株3K32生物量的影響，篩選出最佳氮源；然后對最佳氮源設(shè)置不同添加量(6、8、10、12、14和16 g·L-1)，篩選最佳濃度。

無機(jī)鹽優(yōu)化：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)上，采用不同濃度K2HPO4(0、1、2、3、4和5 g·L-1)處理，篩選最佳K2HPO4濃度；之后采用不同濃度MgSO4(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g·L-1)發(fā)酵處理，篩選最佳MgSO4濃度；由于FeCl3含量較少未進(jìn)行優(yōu)化，保存基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的含量。

正交設(shè)計優(yōu)化：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，篩選對3K32菌株生物量影響顯著的葡萄糖、胰蛋白胨以及硫酸鎂3個因素，每個因素設(shè)計3個水平，根據(jù)L9(34)正交表進(jìn)行水平設(shè)計(見表1)，以3K32菌株發(fā)酵液OD600值為生物量指標(biāo)，優(yōu)選3K32菌株的培養(yǎng)基組分。即將2%的菌株3K32種子接種到裝瓶量為20%的不同發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)20 h，適當(dāng)稀釋，檢測生物量OD600值。

表1 因素水平表

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

前期利用單因素試驗研究不同溫度、轉(zhuǎn)速及pH等因素對3K32菌株生長的影響，表明3K32菌株的最佳發(fā)酵溫度為30.12 ℃、轉(zhuǎn)速為140 r·min-1、pH為8、接種量為4%、裝瓶量為20%。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用Plackett-Burman試驗和中心復(fù)合設(shè)計(CCD)試驗對3K32菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3.1 Plackett-Burman試驗

用Plackett-Burman試驗對溫度、轉(zhuǎn)速、pH、接種量以及裝瓶量進(jìn)行檢測，以發(fā)酵后的OD600值為篩選指標(biāo)，以確定影響菌株生長的關(guān)鍵因素。采用最優(yōu)培養(yǎng)基配方制成發(fā)酵培養(yǎng)基，按照表2條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)20 h，適當(dāng)稀釋，檢測OD600值。試驗設(shè)計見表2，試驗次數(shù)為12，各因素設(shè)置高(1)、低(-1) 2個水平。

表2 Plackeet-Burman設(shè)計因素水平

1.2.3.2 中心復(fù)合設(shè)計(Central composite design，CCD)

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選擇溫度和pH作為主要因素，以發(fā)酵后的OD600值為篩選指標(biāo)，依據(jù)CCD原理設(shè)計試驗對2個因素進(jìn)行優(yōu)化。每個因素分為5個水平，因素水平設(shè)計表見表3。采用最優(yōu)培養(yǎng)基配方制成發(fā)酵培養(yǎng)基，按照表3條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)20 h，適當(dāng)稀釋，檢測OD600值。

表3 CCD設(shè)計因素水平

1.4 發(fā)酵優(yōu)化效果檢測

將3K32接種至優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時檢測OD600。將3K32接種至含1%鉀長石的優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在最佳的培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)10 d后，根據(jù)李忠等[21]的方法測定培養(yǎng)基中可溶鉀含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

文章圖中數(shù)據(jù)利用SPSS(20.0版本)軟件用T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析；表中數(shù)據(jù)利用DPS(15.10高級版)軟件用Tukey法進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3K32菌株的培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化

菌株3K32在8種碳源中均能生長，OD600值在1.6～2.3之間，最高為葡萄糖，并與其他碳源有顯著差異，說明菌株3K32利用單糖較好，因此，最佳碳源為葡萄糖(圖1A)。葡萄糖濃度試驗表明，濃度為15 g·L-1的處理OD600值最高，為2.2(圖1B)。

菌株3K32在7種氮源中生長有顯著差異，在胰蛋白胨中生長最好，OD600值為2.4。在氯化銨和硝酸鉀中生長最差，OD600僅為0.3和0.4(圖1C)，說明3K32菌株能很好地利用有機(jī)氮。進(jìn)一步做胰蛋白胨濃度試驗，結(jié)果表明濃度為14 g·L-1的處理OD600值最高，為2.3(圖1D)。

A. 碳源優(yōu)化；B. 葡萄糖濃度優(yōu)化；C. 氮源優(yōu)化；D. 胰蛋白胨濃度優(yōu)化；E. K2HPO4濃度優(yōu)化；F. MgSO4濃度優(yōu)化。

無機(jī)鹽優(yōu)化結(jié)果表明，菌株3K32的生長對MgSO4以及K2HPO4均有需求，MgSO4、K2HPO4的最佳濃度分別為2 g·L-1和0.4 g·L-1。

2.1.2 培養(yǎng)基正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，葡萄糖、胰蛋白胨和硫酸鎂等3個因素對發(fā)酵結(jié)果有較大影響，因此設(shè)計3因素3水平正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組合成分，結(jié)果見表4。

表4 正交試驗結(jié)果及極差分析

續(xù)表4 正交試驗結(jié)果及極差分析

正交試驗結(jié)果表明，A、B、C因素的極差值分別為0.339、0.409、0.277，根據(jù)極差R大小可知影響3K32菌株生長的各因素主次順序為：B>A>C，即胰蛋白胨>葡萄糖>硫酸鎂， A因素各水平的平均值不同，說明A因素水平的變化影響生物量，其中A2的值最高，因此A2為最佳水平，同理，B2和C2為B因素和C因素的最佳水平，因此，最佳組合為A2B2C2，即葡萄糖濃度為15 g·L-1，胰蛋白胨濃度為14 g·L-1，硫酸鎂濃度為0.4 g·L-1。

根據(jù)以上結(jié)果，3K32菌株最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖15 g·L-1，胰蛋白胨濃度為14 g·L-1，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，F(xiàn)eCl3·6 H2O 5 mg·L-1。

2.2 菌株3K32的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計確定關(guān)鍵因素

利用Design-Expert 8.0.6設(shè)計的方案進(jìn)行Plackett-Burman試驗，檢測溫度、轉(zhuǎn)速、pH、接種量以及裝瓶量等因素對3K32菌株生物量的影響，以確定對3K32菌株影響最顯著的因素，試驗結(jié)果見表5。運用Minitab 15軟件對結(jié)果進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表6和表7。表7表明，模型的F檢驗結(jié)果為0.005，模型極顯著(P<0.01)。從表6可以看出溫度、轉(zhuǎn)速及pH對3K32菌株生長具有正效應(yīng)，接種量及裝瓶量對3K32菌株的生長表現(xiàn)負(fù)效應(yīng)。對3K32生物量影響最大的為pH，影響貢獻(xiàn)率為56.34%，其次為溫度，貢獻(xiàn)率為12.75%。因此選取這2個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表5 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

表6 各因素對3K32菌株生物量的影響

表7 Plackett-Burman 試驗結(jié)果方差分析

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，利用中心復(fù)合設(shè)計(CCD)原理，選取溫度和pH為自變量，以3K32菌株生長量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。每個自變量取5個水平，中心復(fù)合設(shè)計和響應(yīng)面結(jié)果見表8。

表8 CCD試驗結(jié)果

用Minitab 15對試驗數(shù)據(jù)處理，得到3K32菌株的生物量OD600的二次回歸方程:

OD600=1.577+0.156 5A+0.177 4B+0.003 8AB-0.362 9A2-0.337 4B2

響應(yīng)值的方差分析見表9，二次回歸方程模型的P<0.01，說明回歸模型具有極顯著意義。失擬項P=0.005<0.05，表明方程模型存在一定的誤差。根據(jù)試驗結(jié)果的方差分析(表9)和兩因素之間交互作用的等高線圖(圖2A)和響應(yīng)面圖(圖2B)可知，溫度與pH的交互作用對3K32菌株生長的影響差異不顯著，因此，最佳發(fā)酵溫度為30.21 ℃，pH值為8.05。通過以上結(jié)果分析，優(yōu)化后3K32菌株的最佳發(fā)酵條件為：初始pH 8.05、培養(yǎng)溫度30.21 ℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速120 r·min-1、裝瓶量20%。

表9 CCD試驗結(jié)果方差分析

圖2 溫度和pH交互作用對3K32菌株生物量的等高線圖(A)和響應(yīng)面(B)

2.3 3K32菌株發(fā)酵優(yōu)化效果

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基在最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3K32菌株，檢測其菌落數(shù)，結(jié)果表明(圖3)：優(yōu)化后的培養(yǎng)基中3K32菌株的生物量為2.7×109CFU·mL-1，為優(yōu)化前的2.278倍。經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含1%鉀長石)同時接種3K32菌株，連續(xù)培養(yǎng)10 d后，優(yōu)化后的培養(yǎng)基可溶鉀含量為58.35 μg·mL-1，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶鉀含量提高了5.3倍。

圖3 優(yōu)化培養(yǎng)基對3K32菌株生物量(A)和溶鉀性能(B)的影響

3 討論與結(jié)論

土壤中微生物在土壤營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，利用土壤中的微生物將植物難以利用的氮、磷和鉀轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的氮、磷和鉀，提高土壤有效氮、磷和鉀含量，是提高作物產(chǎn)量、維護(hù)土壤健康、維持農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的理想措施[22-23]。本實驗室前期自煙草根際土壤篩選出一株皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)菌株3K32，該菌同時具有解鉀、解有機(jī)磷和無機(jī)磷及固氮作用，為一株具有較高開發(fā)利用價值的多功能菌。

不同功能微生物的發(fā)酵培養(yǎng)條件不同。從小麥根際分離的解磷假單胞菌(Pseudomonassp.)MS16最適溫度和pH分別為22.5 ℃和7，葡萄糖能提高其解磷能力[16]。大豆根際的解磷泡盛曲霉(Aspergillusawamori)S29最適碳源為麥芽糖，最適氮源為硫酸銨[24]；李新新等[25]從梨園土中分離的假單胞桿菌屬(Paenibacillussp.)解鉀菌最適碳源和氮源分別為麥芽糖和蛋白胨；吳紅艷等[26]從番茄根際分離的解鉀膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillusmucilaginosus)最適碳源和氮源分別為可溶性淀粉和酵母膏。3K32菌株的最適氮源和碳源分別為葡萄糖和胰蛋白胨(圖1)。培養(yǎng)基各成分的比例、濃度及培養(yǎng)基的pH和裝瓶量等因素均影響微生物的生長和生物學(xué)功能[27]，本文利用正交試驗和響應(yīng)面設(shè)計等研究手段對3K32菌株的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，3K32菌株最佳培養(yǎng)基組分為葡萄糖15 g·L-1、胰蛋白胨14 g·L-1、硫酸鎂0.4 g·L-1、磷酸氫二鉀2 g·L-1；最適發(fā)酵條件為溫度30.21 ℃、pH 8.05、轉(zhuǎn)速140 r·min-1、接種量4%、裝瓶量20%；在優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下其生物量達(dá)到2.7×109CFU·mL-1。