低分子透明質(zhì)酸片段對(duì)紅細(xì)胞聚集誘發(fā)作用及其種屬特異性

郭田田，王家麒，賈瀟瀟，LAZCANO SILVEIRA Rayko，HUI SHOFARO Jessica,王鳳舞，馬澤芳，惠覓宙

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109)

目前，對(duì)透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能的研究已經(jīng)較為充分，其在醫(yī)藥和臨床上的應(yīng)用也日益廣泛。大量研究表明，透明質(zhì)酸的部分生物活性與其分子量的大小有密切關(guān)系[1]。近年來(lái)，透明質(zhì)酸片段廣泛的應(yīng)用前景已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[2-20]，逐漸成為透明質(zhì)酸研究的熱點(diǎn)。因此大規(guī)模生產(chǎn)透明質(zhì)酸片段是進(jìn)一步研究的前提，意義重大，值得深入研究。

分子量大小不同的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段與人體多種受體相互作用，包括淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronic Acid Receptor 1，LYVE-1)、CD44、透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)性受體(Hyaluronanmediated Motility Receptor，RHAMM)、免疫球蛋白樣凝集素(Sialic Acid-binding Immunoglobulin-type Lectins 9，SIGLEC-9)、Toll樣受體2(Toll-like Receptor 2，TLR2)、透明質(zhì)酸內(nèi)吞受體(Hyaluronan Receptor for Endocytosis，HARE)、細(xì)胞遷移誘導(dǎo)與透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(Cell Migration-inducing and Hyaluronanbinding Protein，CEMIP)和跨膜蛋白2(Transmembrane Protein 2，TMEM2)。透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、T細(xì)胞、B 細(xì)胞)遷移[21-22]和白細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)炎癥因子分泌[23-24]。作為受體之一的CD44是一種分布廣泛的跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的吸附作用，其肽鏈的N端可以和HA結(jié)合。紅細(xì)胞作為血液循環(huán)中最多的細(xì)胞群體，自身具有識(shí)別和結(jié)合抗原物質(zhì)、參與免疫反應(yīng)的作用，失去細(xì)胞核的成熟紅細(xì)胞表面依舊保持CD44蛋白的高表達(dá)[25]。CD44在機(jī)體正常生理和病理生理的狀態(tài)下，絕不僅僅是單純的存在[26-29]。

因此，本研究利用重組人透明質(zhì)酸酶PH20，制備了一種人體組織滲透性好的平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35注射液，并以HA35注射液和不同分子量透明質(zhì)酸片段為研究對(duì)象，探索兩者與人和不同種屬動(dòng)物紅細(xì)胞之間的相互作用，為HA35注射液在臨床應(yīng)用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-S和pMH3表達(dá)載體質(zhì)粒由紹興惠薈生物科技有限公司提供；注射級(jí)平均分子量1 600 kDa透明質(zhì)酸原料、普通平均分子量300 kDa透明質(zhì)酸原料和平均分子量24 kDa透明質(zhì)酸片段購(gòu)自華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；平均分子量60 kDa透明質(zhì)酸片段購(gòu)自麗陽(yáng)生物科技有限公司；anti-human CD44 antibody、anti-dog antibody、anti-mouse CD44 antibody、non-specific rabbit IgG、non-specific dog IgG、non-specific mouse IgG購(gòu)自Abcam公司(英國(guó))；瓊脂糖(Agarose)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

酶解反應(yīng)器(杭州安普生物工程有限公司)、滲透壓摩爾濃度測(cè)定儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)、激流式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器(杭州安普生物工程有限公司)；重組人透明質(zhì)酸酶PH20純化用QFF層析柱、Phenyl HP疏水層析柱、CHT I型陶瓷羥基磷灰石層析柱、SP HP陽(yáng)離子交換層析柱由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所提供；黑背景2016型顯微鏡(哈爾濱康邦黑背景光學(xué)儀器有限公司)；電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；恒溫?fù)u床(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)。

1.1.3 血樣

人靜脈血：健康志愿者共12人，年齡(24±4)歲，靜脈采血經(jīng)長(zhǎng)春嘉和外科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和本人同意。

動(dòng)物靜脈血：比格犬、BALB/c小鼠、內(nèi)蒙古山羊、內(nèi)蒙古黃牛、迷你豬、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂、恒河猴和田園貓的靜脈血由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供。動(dòng)物靜脈采血經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 人重組透明質(zhì)酸酶PH20的生產(chǎn)

以RISHTON等[30]中記載的方法為基礎(chǔ)，將人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20的cDNA插入富含GC的pMH3載體，構(gòu)建pMH3-PH20表達(dá)載體；再將pMH3-PH20表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-S細(xì)胞系，篩選高表達(dá)PH20的CHO-S細(xì)胞系，并在激流式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行放大和大規(guī)模培養(yǎng)；將含有PH20的豐收液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)QFF層析柱、Phenyl HP疏水層析柱、CHT I型陶瓷羥基磷灰石層析柱和SP HP陽(yáng)離子交換層析柱4步純化，再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后制成純度大于98.5%的無(wú)菌的有糖化的重組人透明質(zhì)酸酶PH20[31-32]。

1.3 低分子量透明質(zhì)酸片段的制備

1.3.1 使用重組人透明質(zhì)酸酶PH20制備

取1支離心管加入10 mL超純水，分多次加入1 600 kDa透明質(zhì)酸原料200 mg，反復(fù)震蕩混勻，直至透明質(zhì)酸全部溶于水；按表1加入MgCl2、NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，反復(fù)混勻；加入人PH20(27 000 U/mL)至終濃度為20 000 U/g。置于37 ℃搖床，于處理后8 min、16 min、24 min、32 min、40 min、48 min、56 min、64 min取降解產(chǎn)物1 mL于離心管中，取完的樣品標(biāo)記后迅速置于-20 ℃冰箱。

表1 人重組透明質(zhì)酸酶PH20酶解透明質(zhì)酸原料的反應(yīng)體系

1.3.2 使用牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20制備

取1支離心管加入10 mL超純水，分多次加入1 600 kDa透明質(zhì)酸原料200 mg，反復(fù)震蕩混勻，直至透明質(zhì)酸全部溶于水；按表2加入MgCl2、NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，反復(fù)混勻；加入牛PH20(1 500 U/mL)至終濃度為20 000 U/g；置于37 ℃搖床，于處理后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h取降解產(chǎn)物1 mL于離心管中，取完的樣品標(biāo)記后迅速置于-20 ℃冰箱。

表2 牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20酶解透明質(zhì)酸原料的反應(yīng)體系

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定透明質(zhì)酸片段的分子量

將全部樣品置于95 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱45 min，使殘留透明質(zhì)酸酶失活，將加熱完成的全部樣品置于4 ℃冰箱。取0.3 g瓊脂糖溶于30 mL TBE溶液中，微波爐中加熱沸騰3次以上，稍冷卻倒入插有制膠梳的制膠板中，待膠冷卻凝固。取15 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入45 μL超純水制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取5 μL待測(cè)樣品加入15 μL超純水制備樣品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品終濃度均為5 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別與上樣buffer按4∶1比例混勻。將制備好的凝膠板置于含1×TBE的電泳槽中，每個(gè)膠孔里按順序各加入20 μL的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，人PH20降解樣品電泳20 min，牛PH20降解樣品電泳1 h，電壓均為80 V。

1.3.4 GPC-MALLS法測(cè)定HA35的分子量及分子量分布

采用GPC-MALLS在線檢測(cè)方法分析樣品的分子量。(1)色譜條件：儀器，高效液相色譜儀(配示差檢測(cè)器)；Shodex SB-804 HQ凝膠柱(Φ8 mm×300 mm)；流動(dòng)相，0.02%疊氮鈉水溶液；流速，1 mL/min；進(jìn)樣量，100 μL；溫度，40 ℃；檢測(cè)器，示差檢測(cè)器、十八角激光散射檢測(cè)器。(2)樣品相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定：稱取適量樣品，用流動(dòng)相溶解配成1 mg/mL樣品溶液，用0.22 μm濾器過(guò)濾后進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相分析。(3)分子質(zhì)量分布檢測(cè)采用示差檢測(cè)器和激光檢測(cè)器，分別記錄供試品質(zhì)量濃度和供試品在不同角度的光散射強(qiáng)度，折光指數(shù)增加量(dn/dc)值為0.138，通過(guò)數(shù)據(jù)處理軟件ASTRA獲取供試樣品的分子質(zhì)量分布圖。

1.4 紅細(xì)胞錢串狀凝集研究

使用表3中不同分子量的透明質(zhì)酸與人、小鼠、比格犬、羊、牛、豬、羊駝、馬、水貂、猴和貓的靜脈血混合至終濃度分別為12 mg/mL、6 mg/mL、3 mg/mL、1.5 mg/mL、0.75 mg/mL、0.375 mg/mL。制備紅細(xì)胞涂片，顯微鏡下觀察不同分子量的HA引發(fā)的紅細(xì)胞錢串狀聚集情況，得出其誘發(fā)人、小鼠、比格犬、羊、牛、豬、羊駝、馬、水貂、猴和貓的紅細(xì)胞錢串狀聚集的最低濃度。

表3 不同分子量的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段

1.5 紅細(xì)胞錢串狀凝集的CD44阻斷研究

使用分子量為35 kDa的HA35分別與人、小鼠、比格犬的靜脈血混合至終濃度為1.5 mg/mL，制備紅細(xì)胞涂片，顯微鏡下觀察和驗(yàn)證HA35引發(fā)的紅細(xì)胞錢串狀聚集。進(jìn)一步使用CD44抗體、非特異性IgG抗體、人PH20(27 000 U/mL)與人、小鼠、比格犬的靜脈血混合，終濃度分別為CD44抗體10 μg/mL、IgG抗體10 μg/mL、人PH20 1 927 U/mL。37 ℃孵育25 min，再加入HA35至濃度1.5 mg/mL。制備紅細(xì)胞涂片，顯微鏡下觀察紅細(xì)胞錢串狀聚集程度。

1.6 紅細(xì)胞沉降試驗(yàn)

HA35與新鮮采集的人、比格犬、小鼠靜脈血混合至終濃度分別為1.5 mg/mL、1.1 mg/mL、0.75 mg/mL，吸取400 μL混合血液至血沉管中，靜置25 min，記錄血沉管中血紅細(xì)胞的沉降率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子量透明質(zhì)酸片段的分子量測(cè)定

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)HA35的分子量

圖1結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳的全部條帶都處于同一水平位置，表明20 000 U/g的人重組透明質(zhì)酸酶PH20酶切效果非常強(qiáng)，作用8 min就已經(jīng)產(chǎn)生了酶切，而且切割制備的35 kDa透明質(zhì)酸片段HA35分子量差異非常小。

圖2結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳條帶參差不齊，第4、5、6條帶明顯比第1、2、3條帶遠(yuǎn)，說(shuō)明牛透明質(zhì)酸酶PH20切割制備的HA35分子量隨時(shí)間延長(zhǎng)變小。

條帶1: 8 min；條帶2: 16 min；條帶3: 24 min；條帶4: 32 min；條帶5: 40 min；條帶6: 48 min；條帶7: 56 min；條帶8: 64 min；條帶9: 10 kDa透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品；條帶10: 50 kDa透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品

圖1和圖2相比，圖2中第1、2、3條帶和圖1中條帶位置相同，說(shuō)明相同濃度下，人PH20切割8 min和牛PH20切割1 h產(chǎn)生的透明質(zhì)酸片段分子量相同，表明相同條件下，人重組透明質(zhì)酸酶PH20比牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20切割效果更快更好。

條帶1: 1 h；條帶2: 2 h；條帶3: 3 h；條帶4: 4 h；條帶5: 5 h；條帶6: 6 h；條帶7: 10 kDa透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品；條帶8: 50 kDa透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品

2.1.2 GPC-MALLS法測(cè)定HA35的分子量及分子量分布

選取6次人PH20制備的不同批次HA35樣品，使用GPC-MALLS測(cè)定平均分子量。如表4所示，結(jié)果表明6個(gè)HA35樣品的平均分子量為(35±8)kDa，其批間變異系數(shù)CV=22%。

表4 GPC-MALLS測(cè)定的6個(gè)HA35樣品的平均分子量

分子量分布結(jié)果如表5所示，(92.75±2.42)%的HA35分布在10～70 kDa之間，其分布范圍相對(duì)較小，表明生產(chǎn)方法比較穩(wěn)定可靠。

表5 GPC-MALLS測(cè)定的6個(gè)HA35樣品的分子量分布

2.2 紅細(xì)胞錢串狀凝集及CD44阻斷結(jié)果

如圖3、圖4、圖5所示，HA35與人、犬、小鼠紅細(xì)胞作用發(fā)生錢串狀聚集(圖3A、圖4A、圖5A)，加入CD44抗體即可解除這種作用(圖3B、圖4B、圖5B)，而加入Ig抗體并不能解除這種作用(圖3C、圖4C、圖5C)。CD44蛋白是紅細(xì)胞表面表達(dá)量最多的免疫分子，也是HA的主要受體。因此，以上結(jié)果表明HA35可誘發(fā)人和動(dòng)物的紅細(xì)胞錢串狀聚集，并且該現(xiàn)象是由紅細(xì)胞表面的受體CD44介導(dǎo)的。

圖3 HA35誘導(dǎo)人紅細(xì)胞錢串狀聚集

圖4 HA35誘導(dǎo)比格犬紅細(xì)胞錢串狀聚集

圖5 HA35誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞錢串狀聚集

2.3 HA35和不同分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細(xì)胞聚集與分子量的關(guān)系

不同分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)誘發(fā)人、比格犬、BALB/c鼠、迷你豬、田園貓、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂的紅細(xì)胞錢串狀聚集的最低濃度與其分子量大小呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖6，表6～13)。例如，明顯誘發(fā)紅細(xì)胞錢串狀凝集的平均分子量24 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是6 mg/mL，明顯誘發(fā)紅細(xì)胞錢串狀凝集的平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是1.5 mg/mL，而明顯誘發(fā)紅細(xì)胞錢串狀凝集的平均分子量60 kDa的透明質(zhì)酸片段的最低濃度是0.375 mg/mL。這一負(fù)相關(guān)關(guān)系可被用來(lái)檢測(cè)低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)的分子量，經(jīng)驗(yàn)證此方法靈敏可靠。

圖6 誘發(fā)人、比格犬、小鼠、豬、貓、羊駝、馬、水貂紅細(xì)胞錢串狀聚集的透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段的最低濃度和分子量之間的負(fù)相關(guān)曲線

表6 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)人紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表7 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)比格犬紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表8 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)小鼠紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表9 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)豬紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表10 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)貓紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表11 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)羊駝紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表12 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)馬紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表13 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)水貂紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

2.4 低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細(xì)胞聚集的種屬特異性

本研究另選取羊、牛、恒河猴作為研究對(duì)象，以研究低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)在不同種屬動(dòng)物中誘發(fā)紅細(xì)胞聚集是否存在差異。結(jié)果顯示低分子量透明質(zhì)酸片段不誘發(fā)羊、牛、恒河猴紅細(xì)胞聚集(表14～表16)，提示低分子量透明質(zhì)酸片段(包括HA35)對(duì)人和不同動(dòng)物的生理作用和使用劑量不同。

表14 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)羊紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表15 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)牛紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

表16 不同透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸片段誘發(fā)猴紅細(xì)胞錢串狀聚集的終濃度

2.5 低分子量透明質(zhì)酸片段影響紅細(xì)胞沉降

通過(guò)使用人、比格犬、小鼠的靜脈血與HA35混合進(jìn)行紅細(xì)胞沉降試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HA35誘發(fā)紅細(xì)胞沉降率增加，且一定濃度下分子量不同引發(fā)沉降率增加程度不同(表17～表19)。HA35不但誘發(fā)人和動(dòng)物紅細(xì)胞錢串狀聚集，而且還誘發(fā)紅細(xì)胞沉降率增加，這個(gè)結(jié)果提示低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細(xì)胞沉降率改變直接和間接影響紅細(xì)胞和白細(xì)胞血液流變學(xué)，進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)白細(xì)胞滲出的生物效應(yīng)。利用低分子量透明質(zhì)酸片段分子量不同引發(fā)沉降率增加程度不同，來(lái)檢測(cè)制備的HA35不同批次間的分子量變異，從而進(jìn)行生產(chǎn)質(zhì)量控制。

表17 HA35對(duì)人紅細(xì)胞沉降率的影響

表18 HA35對(duì)比格犬紅細(xì)胞沉降率的影響

表19 HA35對(duì)小鼠紅細(xì)胞沉降率的影響

3 討論

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)的有糖化的純度大于98.5%的重組人透明質(zhì)酸酶PH20被用來(lái)皮下輸液、免疫球蛋白皮下給藥和治療性抗體皮下給藥[20,26]，和牛睪丸提取的透明質(zhì)酸酶PH20相比，人PH20注射前不需皮膚敏感試驗(yàn)，靜脈注射不誘發(fā)人中和抗體產(chǎn)生[26]。

本文分別使用人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20和牛睪丸透明質(zhì)酸酶PH20降解高分子透明質(zhì)酸注射級(jí)原料，制備了平均分子量為35 kDa的HA35(圖1，圖2)，并使用瓊脂糖凝膠電泳和十八角度激光方法(GPC-MALLS)測(cè)定透明質(zhì)酸片段的平均分子量和分子量分布范圍(圖1，圖2，表2，表3，表4)。使用重組人透明質(zhì)酸酶PH20降解高分子透明質(zhì)酸HA制備的HA35和高分子HA相比，黏度降低，組織滲透性增強(qiáng)；使用重組人透明質(zhì)酸PH20降解制備的HA35和物理(加熱或超聲)、化學(xué)(酸或堿或活性氧)方法制備的低分子透明質(zhì)酸片段相比，HA35沒(méi)有非切割部位的結(jié)構(gòu)理化損傷；使用重組人透明質(zhì)酸PH20降解制備的HA35和有免疫原性動(dòng)物、昆蟲(chóng)提取的或沒(méi)有糖化的微生物生產(chǎn)的透明質(zhì)酸酶制備的低分子透明質(zhì)酸片段相比，加熱使殘留重組人透明質(zhì)酸酶PH20失活后使用不引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，注射前不需皮膚敏感試驗(yàn)。

本研究首次發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸片段HA35與其他平均分子量不同的透明質(zhì)酸片段誘發(fā)人和多種試驗(yàn)動(dòng)物的血紅細(xì)胞錢串狀聚集，這種誘發(fā)紅細(xì)胞錢串狀聚集的透明質(zhì)酸片段的最小濃度與其分子量呈負(fù)相關(guān)(圖3，圖4，圖5，圖6)，為低分子量透明質(zhì)酸片段的分子量測(cè)定提供了新的細(xì)胞學(xué)方法，而且這種細(xì)胞學(xué)方法靈敏度高、重復(fù)性好。

CD44蛋白是一組分布廣泛的膜整合蛋白，是紅細(xì)胞表面表達(dá)量最多的免疫分子，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細(xì)胞錢串狀聚集由透明質(zhì)酸受體CD44介導(dǎo)(圖3，圖4，圖5)，提示透明質(zhì)酸片段HA35通過(guò)紅細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體CD44參與機(jī)體功能調(diào)節(jié)[33]。

另外，本研究意外發(fā)現(xiàn)低分子量透明質(zhì)酸片段誘發(fā)內(nèi)蒙古山羊、內(nèi)蒙古黃牛和恒河猴、人、比格犬、BALB/c小鼠、迷你豬、田園貓、美洲羊駝、蒙古馬、紅顏白水貂紅細(xì)胞錢串狀凝集的現(xiàn)象完全不同(表6～表16)，存在種屬特異性。通過(guò)以上結(jié)果我們推論透明質(zhì)酸片段HA35對(duì)不同種屬生物體的治療作用和使用劑量可能不同，為透明質(zhì)酸片段HA35的進(jìn)一步臨床研究提供了新的線索。

相關(guān)文獻(xiàn)表明HA通過(guò)與紅細(xì)胞受體CD44和白細(xì)胞受體SIGLEC-9相互作用間接影響白細(xì)胞的交通和白細(xì)胞激活[26-28]，低濃度的透明質(zhì)酸片段HA35和其他分子量不同的透明質(zhì)酸片段不但誘發(fā)人和動(dòng)物紅細(xì)胞錢串狀聚集，而且還誘發(fā)紅細(xì)胞沉降率增加(表17～表19)。因此，我們推論以上與紅細(xì)胞相關(guān)的變化直接或間接影響紅細(xì)胞和白細(xì)胞血液流變學(xué)，可能與中性粒細(xì)胞在血管表面形成軸流和吸附有關(guān)，進(jìn)而產(chǎn)生白細(xì)胞吸附血管壁滲出的生物效應(yīng)[34-35]。目前，本研究利用不同分子量的透明質(zhì)酸片段誘發(fā)紅細(xì)胞沉降率改變來(lái)檢測(cè)平均分子量35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35產(chǎn)品生產(chǎn)批次間的分子量變異系數(shù)或產(chǎn)品質(zhì)量控制情況。

綜上所述，使用人工合成重組人透明質(zhì)酸酶PH20制備的35 kDa的透明質(zhì)酸片段HA35具有更好的組織滲透性、無(wú)理化損傷和過(guò)敏反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了HA35與人和不同動(dòng)物的紅細(xì)胞的相互作用和種屬特異性，為HA35的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。