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    響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取工藝

    2022-06-08 05:55:24黃卉卉柳誠剛王子偉許雪霞
    現(xiàn)代食品 2022年10期
    關(guān)鍵詞:液料多糖工藝

    ◎ 黃卉卉,柳誠剛,王 清,王子偉,劉 濤,許雪霞

    (信陽農(nóng)林學院 食品學院,河南 信陽 464000)

    枸骨為冬青科冬青屬常綠植物,枸骨的果實、葉子和根部都具有一定的藥用價值,枸骨具有補肝腎、清熱涼血、祛風止痛等多種功效[1-4]。枸骨中含有多糖,多糖是一種重要的生命物質(zhì),其參與了細胞的多種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié),強化了機體自身的免疫功能,天然植物多糖提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗癌及延緩衰老等作用[5-7]。近年來,枸骨化學成分和功效的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注,但其多糖研究很少見報道。因此,為進一步開發(fā)利用枸骨資源,本研究以枸骨根為原料,運用響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖的提取工藝,以期為枸骨資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    枸骨根,購自信陽市醫(yī)藥公司,經(jīng)信陽農(nóng)林學院中藥教研室鑒定為枸骨根,干燥后粉碎備用。

    苯酚(濟南創(chuàng)世化工有限公司)、濃硫酸(湖北鑫潤德化工有限公司)、葡萄糖(無錫市晶科化工有限公司)、無水乙醇、丙酮和乙醚,以上試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TU-1810型紫外線分光光度計:北京普析通用儀器有限公司;WK-4008高速藥物粉碎機:青州市(山東)精誠機械有限公司;LDZ4-0.8型離心機:北京醫(yī)用離心機廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:北京精科華瑞儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 繪制標準曲線

    準確稱取葡萄糖2.500 0 g,用蒸餾水溶解,定容于500 mL量瓶中。移取2 mL定容至100 mL容量瓶,即得濃度為100 μg·mL-1葡萄糖標準溶液。分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL和0.9 mL于10 mL具塞試管中,加水至1 mL,搖勻,加入1 mL體積分數(shù)5%苯酚,搖勻后,加入5 mL濃H2SO4立即振蕩搖勻,放置15 min,在波長490 nm條件下測定吸光度,作濃度-吸光度曲線,得標準曲線方程Y=5.448 6X+0.004 7,R2=0.992 5[8]。

    1.3.2 枸骨根多糖的提取流程

    參照王清等[9]、王子偉等[10]提取工藝流程,確定枸骨根多糖的提取流程為:枸骨根粉末→熱水浸提→離心取上清液→減壓濃縮→加無水乙醇沉淀→丙酮、乙醚洗滌沉淀→真空干燥→枸骨根粗多糖。

    1.3.3 枸骨根多糖的含量測定

    采用苯酚-硫酸法[11],即將所得到的粗多糖產(chǎn)品稀釋100倍,取多糖液2.0 mL緩慢加入5%的苯酚1.0 mL,搖勻,再加5.0 mL濃H2SO4,立即搖勻,室溫靜置15~20 min,于490 nm測其吸光值。利用標準曲線計算出多糖含量,得出多糖的提取率。實驗重復(fù)3次,取平均值。多糖提取率計算公式為:多糖提取率=(多糖含量/原料重)×100%。

    1.3.4 單因素試驗

    (1)提取時間對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉,分別溶于30 mL蒸餾水中,并于70 ℃溫度下分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h,過濾、離心得上清液,測定上清液吸光度。

    (2)提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉,分別溶于30 mL蒸餾水中,于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃溫度下水浴提取2 h,過濾、離心得上清液,測定上清液吸光度。

    (3)液料比對枸骨根多糖提取率的影響。準確稱取5份3.000 0 g枸骨根粉,分別以液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1溶于蒸餾水中,于70 ℃溫度下水浴提取2 h,過濾、離心得上清液,測定上清液吸光度。

    1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以枸骨根多糖提取率為響應(yīng)值,選取時間(A)、溫度(B)、液料比(C)這3個因素設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,對枸骨根多糖提取工藝進行進一步優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素與水平見表1。

    表1 響應(yīng)面分析因素與水平表

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1 提取時間對枸骨根多糖提取率的影響

    由圖1可看出,隨著提取時間的增加,枸骨根多糖提取率呈先增長后下降趨勢,當提取時間為2 h時提取率達到最大值,隨后提取率緩慢下降,說明多糖濃度已達到飽和,提取時間過長也可能導(dǎo)致其他物質(zhì)溶出,進而影響多糖的提取率。因此,提取時間應(yīng)選擇2 h為宜。

    2.1.2 提取溫度對枸骨根多糖提取率的影響

    由圖2看出,隨提取溫度增高,枸骨根多糖提取率逐漸增高,至80 ℃達到最大值,隨后提取率下降,其可能的原因是溫度過高對枸骨根多糖的結(jié)構(gòu)有所影響,并造成多糖部分分解。因此,提取溫度應(yīng)選擇80 ℃為宜。

    2.1.3 液料比對枸骨根多糖提取率的影響

    由圖3可知,隨著溶劑用量增加,枸骨根多糖提取率呈先增大后降低趨勢,液料比為10∶1(mL·g-1)時提取率達最大值,是因為當液料比較小時,由于樣品中的多糖未能充分溶解,故多糖提取率隨著液料比的增大而升高;而達到10∶1后趨于穩(wěn)定,再增加溶液的體積對多糖提取率影響較小,考慮到成本效益,液料比應(yīng)選擇10∶1為宜。

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取工藝的試驗結(jié)果

    2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

    使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸分析,可得到回歸方程:Y=5.22+0.049A-0.12B+0.32C-0.29AB+0.44AC+0.16BC-0.39A2-0.30B2-0.12C2。通過對方程的進一步分析可以確定優(yōu)化枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)組合。

    表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果表

    2.2.2 方差分析

    利用Design-Expert 8.0.6軟件對枸骨根多糖提取率結(jié)果進行方差分析,見表3。

    由表3可看出模型P<0.01,說明模型極顯著,且一次項C,交互項AB、AC,二次項A2、B2差異極顯著,一次項A、B,交互項BC,二次項C2差異不顯著,說明3個因素交互作用共同影響多糖提取率,不是單一因素作用的結(jié)果,且由P值大小可得各因素對多糖提取率影響為:C(液料比)>B(溫度)>A(時間)。

    表3 方差分析表

    2.2.3 響應(yīng)面分析

    對表2數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合,得二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖。由圖4、5、6可見,不同因素交互作用對枸骨根多糖提取率的影響程度不同,其中,提取時間(A)與提取溫度(B)、提取時間(A)與液料比(C)的交互作用均比較明顯,而提取溫度(B)與液料比(C)的交互作用不明顯,這與方差分析結(jié)果一致。

    圖4表明了液料比取中心水平時,提取時間與提取溫度對枸骨根多糖提取率的交互作用。當液料比一定時,隨著提取時間和提取溫度的增加,枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

    圖5表明了提取時間取中心水平時,提取溫度與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。當提取溫度一定時,隨著液料比的增加,枸骨根多糖提取率呈上升趨勢;當液料比一定時,隨著提取溫度的增加,枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降的趨勢。

    圖6表明了提取溫度取中心水平時,提取時間與液料比對枸骨根多糖提取率的交互作用。由圖6可看出,當提取溫度一定時,隨著提取時間和液料比的增加,枸骨根多糖提取率呈先上升后緩慢下降趨勢。

    2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定

    在提取時間、提取溫度、液料比單因素試驗的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.0.6軟件,經(jīng)過以上對模型方程的方差分析以及其響應(yīng)面圖形分析可以得出枸骨根多糖提取的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果顯示,在液料比為12∶1 mL·g-1,提取時間為2.2 h,提取溫度為85 ℃時,理論上枸骨根多糖提取率達到最高,為5.62%。

    2.2.5 驗證試驗

    為檢驗結(jié)果的可靠性,依據(jù)最佳提取條件進行驗證試驗。設(shè)計3組平行試驗,測得枸骨根多糖提取率平均值為5.59%,與上述預(yù)測值5.62%誤差較小,表明該工藝穩(wěn)定可靠

    3 結(jié)論

    為更好地開發(fā)枸骨根資源,本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗,得到枸骨根多糖提取的最佳工藝條件為液料比12:1 mL·g-1,提取時間2.2 h,提取溫度85 ℃。此時理論上枸骨根多糖提取率可達到5.62%,驗證值為5.59%,說明其實際提取率與預(yù)測理論的最佳提取率相對誤差較小,故響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨根多糖提取的工藝參數(shù)可靠有效,可作為實際應(yīng)用操作的參考,也為進一步研究枸骨根多糖奠定了理論基礎(chǔ)。

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