氣相色譜法測定醬油中對羥基苯甲酸酯類的含量

◎ 楊飛帆，趙舒景

（上海市崇明食品藥品檢驗所，崇明食品安全檢測中心，上海 202150）

新鮮安全的食品是保障人們健康的基本條件，食品的保鮮和防腐是食品生產加工的首要問題，食品防腐劑的選擇及其有效檢測也是社會關注的熱點問題[1]。食品防腐劑是指能有效防止微生物引起的腐敗變質，延長保質期的添加劑，我國規(guī)定使用的防腐劑有山梨酸、苯甲酸、丙酸等共30多種。對羥基苯甲酸酯具有酚羥基結構，能夠破壞微生物的細胞膜，使細胞內的蛋白質變性，并可抑制微生物細胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，從而起到防腐保鮮的作用。防腐效果優(yōu)于苯甲酸鈉、山梨酸鉀，而且其使用量和毒性均低于苯甲酸鈉、山梨酸鉀，所以廣泛應用于化工、醫(yī)藥、食品和化妝品等領域[2]。

對羥基苯甲酸酯包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯和庚酯等，隨著烷基碳鏈的增大，其毒性降低，抗菌作用增加。根據(jù)《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定，按照標準使用，對羥基苯甲酸甲酯鈉、對羥基苯甲酸乙酯鈉和對羥基苯甲酸丙酯鈉作為食品防腐劑應用于醬油、果醬、水產品、飲料、新鮮水果和蔬菜等產品。

食品中的對羥基苯甲酸酯類的檢測方法較多，如高效液相色譜法[3-4]、高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法[5]、氣相色譜法[6-7]。本次對醬油中羥基苯甲酸脂類含量測定采用的是氣相色譜法，《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）[8]中推薦使用的為氣相色譜法，但整個方法中所需用到的有機溶劑用量大、前處理復雜、精密度和準確度低。通過試驗，簡化了醬油基質的樣品前處理，優(yōu)化了分析條件，建立了醬油中對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯及丁酯的準確、快速、有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用醬油為市售產品。

對羥基苯甲酸甲酯（DR.E，CAS號94-26-8，純度99.90%）；對羥基苯甲酸乙酯（DR.E，CAS號120-47-8，純度99.02%）；對羥基苯甲酸丙酯（DR.E，CAS號94-13-3，純度98.70%）；對羥基苯甲酸丁酯（DR.E，CAS號99-76-3，純度99.73%）；無水乙醚（色譜純）；無水乙醇（色譜純）；鹽酸（1∶1）；飽和氯化鈉溶液；碳酸氫鈉溶液（10 g·L-1）；50 mL離心管；150 mL梨形瓶；一次性吸管；0.22 μm有機相濾膜；一次性無菌注射器。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀，配有FID檢測器：美國Agilent；ME104E電子天平：瑞士METTLER TOLEDO；R-100旋轉蒸發(fā)儀：瑞士Buchi；渦旋混合儀、氮吹儀、低溫高速離心機：美國Thermo Scientific；HP-5MS毛細管柱：美國Agilent。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

以醬油作為基質，稱取5 g試樣（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，加入1 mL鹽酸（1∶1），混合均勻。分別以15 mL、10 mL、10 mL無水乙醚提取3次，渦旋提取后，4 000 r·min-1離心5 min，提取有機相，合并于50 mL離心管中，加入10 mL碳酸氫鈉溶液進行洗滌一次，棄去水相，提取有機相至150 mL梨形瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮近干，用氮吹儀吹干，準確加入2 mL無水乙醇復溶，經0.22 μm濾膜過濾后進行氣相色譜測定。

1.3.2 標準溶液配制

參照GB 5009.31—2016[8]的標準溶液配制要求，準確配制1 mg·mL-1的單個對羥基苯甲酸酯類的標準儲備溶液。置于4 ℃冰箱冷藏保存，有效期1個月。

分別吸取對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯的上述標準儲備 液 各 40 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL于10 mL容量瓶，定容至刻度，得到標準工作系列，具體濃度見表1，標準工作液應臨用現(xiàn)配。

表1 對羥基苯甲酸酯類標準工作系列表

1.3.3 儀器參考條件

色譜柱：HP-5MS毛細管色譜柱，柱長30 m，柱內徑0.32 mm，固定液膜厚度0.25 μm；載氣恒流模式：2 mL·min-1；氫氣：30 mL·min-1；空氣：300 mL·min-1；進樣量1 μL；進樣口溫度：220 ℃；分流比：5∶1；氣相升溫程序見表2。

表2 對羥基苯甲酸酯程序升溫條件表

2 結果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇

分別對DB-FFAP、HP-FFAP、HP-Innowax、HPWAX和HP-5MS等柱子進行測試分析發(fā)現(xiàn)，HP-5MS擁有非常好的重現(xiàn)性和非常高的柱效，且分析完成的時間短，所以選定弱極性的HP-5MS柱子，克服了極性柱無法分離對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯以及拖尾嚴重的缺點，同時提高了分析速度。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

氣相色譜（Gas Chromatography，GC）分析中柱溫的選擇是一個重要的因素。筆者對初始溫度和升溫速率進行優(yōu)化，結果表明當柱溫程序升溫為初始柱溫60 ℃，保持2 min后以10 ℃·min-1速率升溫至170 ℃，再以12 ℃·min-1速率升溫至220 ℃保持1 min后，以10 ℃·min-1速率升溫到250 ℃保持6 min時，4種防腐劑可在4 min內完全分離，且峰型較好。

在選定的儀器條件下，對羥基苯甲酸甲酯（11.799 min）、對羥基苯甲酸乙酯（12.627 min）、對羥基苯甲酸丙酯（13.742 min）、對羥基苯甲酸丁酯（14.795 min）完全分離，峰型完整，試劑空白沒有干擾，結果見圖1。由于醬油基質復雜，干擾峰雜多，在用電腦軟件進行校正時，應將校正設置中的參比峰時間設置為±1%，以減少雜峰對結果的干擾。結果見圖2。

圖1 4組分對羥基苯甲酸酯色譜圖

圖2 醬油中4組分對羥基苯甲酸酯色譜圖

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑及用量的選擇

根據(jù)待測組分的極性與溶解性特征，比較了三氯甲烷、二氯甲烷及無水乙醚的提取效果。試驗發(fā)現(xiàn)，使用三氯甲烷、二氯甲烷進行提取，各組分回收率低于50%，使用無水乙醚進行提取時，各組分回收率在87.5%～110.8%。故選擇無水乙醚作為提取溶劑。

試驗考察了提取溶劑加入量為以下兩種情況的提取效果。①一次性加入無水乙醚50 mL進行提取。②分別以15 mL、10 mL、10 mL無水乙醚提取3次。試驗結果表明，一次性加入無水乙醚50 mL進行提取得到的有機相較少；故選擇提取溶劑用量為35 mL，分別以15 mL、10 mL、10 mL提取3次。

2.2.2 提取溶劑的毒性及環(huán)保污染比較

本試驗中所采用的3種有機試劑（三氯甲烷、二氯甲烷及無水乙醚）為有機分析前處理中常用的3種提取試劑。在保證試驗過程及結果準確、高效、快速的前提下，筆者還應考慮試劑本身產生的毒性及帶來的環(huán)保污染。3種有機試劑的沸點及毒性見表3。

由表3可知，二氯甲烷、三氯甲烷以及無水乙醚3種有機試劑的極性大小順序為二氯甲烷＜三氯甲烷＜無水乙醚；而3種有機試劑的毒性大小順序則為三氯甲烷＞二氯甲烷＞無水乙醚。

表3 3種有機試劑的沸點及相關毒性表

綜上所述，本試驗從溶劑的提取效率、溶劑的溶解性強弱、提取溶劑的毒性和環(huán)保污染3方面進行綜合考慮，最終選定無水乙醚作為本試驗所使用的提取有機溶劑。

2.2.3 鹽效應影響

已有文獻報道[9]，當溶液中無機鹽濃度增大時，有機溶劑與水的互溶比改變，組分在水中的溶解度降低。試驗考察了不同氯化鈉濃度對提取效果的影響，結果表明，隨著氯化鈉濃度的增加，對羥基苯甲酸甲酯的提取量逐漸增大，對羥甲苯甲酸乙酯、對羥甲苯甲酸丙酯、對羥甲苯甲酸丁酯的提取量卻減少，這說明不同組分受氯化鈉的影響不同。當使用飽和氯化鈉溶液時，各組分相對標準偏差＜5%，回收率為80%～120%。但使用不飽和氯化鈉溶液時，相對標準偏差＞11%，回收率為60%～150%。故選擇飽和氯化鈉溶液。

2.2.4 提取、離心的選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，若選用液液萃取方式，形成的體系的渾濁度不同，并且易有乳化現(xiàn)象產生，故采用渦旋離心的前處理方法，該方法方便、快速、高效。

2.3 標準曲線及相關系數(shù)、檢出限

標準工作系列分別通過氣相色譜分析，4組分的對羥基本甲酸酯類線性相關系數(shù)均大于0.999 9，校準曲線及相關性系數(shù)見表4，同時4組分的對羥基本甲酸酯類的檢出限也較低，符合《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）檢測要求。

表4 4種對羥基苯甲酸脂類的標準曲線方程及相關系數(shù)、檢出限表

2.4 加標回收率和精密度試驗

準確在醬油基質中添加檢出限、定量限、最高添加限量的濃度點的混合標準溶液，同時進行6份平行試樣，按照1.3.1樣品處理方法進行處理，進行3濃度6平行的加標回收試驗，加標回收率和精密度結果見表5。

由表5可知，醬油中4種對羥基苯甲酸酯3個濃度點6個平行的加標回收率平均值在87.5%～111.7%，相對標準偏差為0.05%～8.30%，其回收率和精密度均滿足測定要求，證明該方法重現(xiàn)性好。

表5 醬油基質中4種對羥基苯甲酸脂類加標試驗回收率和相對標準偏差結果表（n=6）

2.5 實際樣品的測定

根據(jù)上述試驗條件，對經提取、凈化的醬油樣品進行測定分析，得到樣品色譜圖，見圖2。經計算該醬油中對羥基苯甲酸甲酯的含量為0.007 g·kg-1，對羥基苯甲酸乙酯的含量為0.008 g·kg-1，對羥基苯甲酸丙酯的含量為0.007 g·kg-1，對羥基苯甲酸丁酯的含量為0.008 g·kg-1。其中《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規(guī)定對羥基苯甲酸酯類的用量不大于0.25 g·kg-1。說明本試驗方法檢測醬油中對羥基苯甲酸酯類的靈敏度更好，準確度更高，推廣實用性更強。

3 結論

本試驗建立了醬油中4種對羥基本甲酸酯類的氣相色譜法，與《食品安全國家標準 食品中對羥基苯甲酸脂類的測定》（GB 5009.31—2016）相比較，不僅對儀器分析條件進行了優(yōu)化，還優(yōu)化了前處理過程，將分液漏斗的提取方式改進為離心管分離提取，快速、高效、操作方便；該方法能有效去除基質干擾、分離度高、回收率和精密度高，在檢測結果的回收率和精密度都符合實驗室要求的前提下，有機試劑用量僅是標準方法推薦使用量的20%，有效地減少了廢液的產生。

在上述試驗分析討論中，筆者從一系列數(shù)據(jù)可以看出無水乙醚既能達到很好的提取效果，滿足試驗檢測所需的要求，同時從試驗人員人身健康及環(huán)保角度方面來看，無水乙醚優(yōu)于二氯甲烷和三氯化碳。故本試驗從溶劑的提取效率、溶劑的溶解性強弱、提取溶劑的毒性及環(huán)保污染3方面進行綜合考慮，最終選擇使用無水乙醚作為提取試劑。