◎ 劉 梅,羅詩泳,李韻儀
(佛山市沃特測(cè)試技術(shù)服務(wù)有限公司,廣東 佛山 528000)
蜂蜜是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的天然食品,其中60%~80%是人體容易吸收的葡萄糖和果糖,具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等生物活性,是一種食療佳品和天然藥品[1-2]。蜂蜜不僅能夠改善人體的血液循環(huán)、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、緩解和恢復(fù)人體疲勞,還能起到潤(rùn)肺止咳、消積通便等作用[3-4]。目前我國(guó)主要是傳統(tǒng)養(yǎng)蜂方式,在養(yǎng)殖過程中,蜂群極易感染美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、麻痹病等疾病,蜂農(nóng)為了控制病害而出現(xiàn)濫用抗生素和農(nóng)藥的情況[5]。消費(fèi)者食用蜂蜜后,很可能攝入蜂蜜中殘留的抗生素,影響健康。中國(guó)是世界蜂蜜生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó),卻不是蜂蜜出口強(qiáng)國(guó),主要原因在于蜂蜜質(zhì)量安全問題較為突出,蜂蜜質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后,屢屢遭遇國(guó)際貿(mào)易壁壘[6]。
因此,建立一種能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定蜂蜜中多種藥物殘留的方法勢(shì)在必行。目前,蜂產(chǎn)品的獸藥殘留研究主要集中在蜂蜜、蜂王漿,檢測(cè)的方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等,其靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短,可大大提高檢測(cè)效率[7-8]。本文建立了HLB固相萃取柱前處理,高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer,HPLC-MS/MS)測(cè)定蜂產(chǎn)品中的喹諾酮類物質(zhì)的方法,方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,且適用于蜂蜜產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的大批量檢測(cè)。
高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters Xevo TQS),配有電噴霧離子源;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);固相萃取裝置(上海亞榮)。
氟甲喹(Flumequine,F(xiàn)LU)、噁喹酸(Oxolinic acid,OXO)、諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)、伊諾沙星(Enoxacin,ENO)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、培氟沙星(Pefloxacin,PEF)、洛美沙星(Lomefloxacin,LOM)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、氟羅沙星(Fleroxacin,F(xiàn)LE)、司帕沙星(Sparfloxacin,SPA)、奧比沙星(Orbifloxacin,ORB)、雙氟沙星(Difloxacin,DIF)及達(dá)氟沙星(Danofloxacin,DAN)的混合液體標(biāo)準(zhǔn)品,濃度為1 000 mg·L-1,購自壇墨質(zhì)檢公司;乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(分析純),均購自上海安譜公司。
15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 mg·L-1)的配制:準(zhǔn)確移取15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100 mg·L-1)1 mL至10 mL容量瓶中,用甲醇準(zhǔn)確定容至刻度。
15種喹諾酮類基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量,用乙腈-甲酸水(0.1%)(2+8,體積比)溶液稀釋,分別配制成濃度為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,各取1.00 mL,分別加于經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料中,溶解殘余物(蜂王漿基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min),上清液過微孔尼龍濾膜后,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。
1.2.1 色譜條件
C18色 譜 柱(150 mm×2.0 mm,3 μm); 流 動(dòng)相:乙腈(A相)+0.1%甲酸水溶液(B相);流速:0.4 mL·min-1;進(jìn)樣體積:5 μL;柱溫:35 ℃;液相色譜梯度洗脫程序:0~1 min,A相保持5%;1~7 min,A相5%→90%;7~9 min,A相保持90%;9~12 min,A相90%→5%;12~13 min,A相保持5%。
1.2.2 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源(ESI源);正離子模式(ESI+)檢測(cè);掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring,MRM);離子源溫度:149 ℃;霧化溫度:595 ℃;毛細(xì)管電壓:0.56 kV。
1.2.3 樣品前處理
本方法分別采用了蜂蜜樣品和蜂王漿不同的測(cè)試基體進(jìn)行了方法的運(yùn)用。
蜂蜜:取試料2 g(準(zhǔn)確至0.02 g),于50 mL聚丙烯離心管中,加磷酸鹽緩沖液20 mL,渦旋1 min,振蕩10 min,1 000 r·min-1離心5 min,取上清液,備用。
蜂王漿:取試料2 g(準(zhǔn)確至0.02 g),于50 mL聚丙烯離心管中,加磷酸鹽緩沖液10 mL,渦旋1 min,振蕩 10 min,4 ℃下 10 000 r·min-1離心 10 min,移取上清液至另一離心管。殘?jiān)恿姿猁}緩沖液10 mL重復(fù)提取,合并2次上清液,玻璃纖維濾紙過濾,備用。
HLB固相萃取柱分別用甲醇10 mL、水10 mL活化,備用液過柱,用水5 mL淋洗,抽干,依次用5%甲酸甲醇和乙酸乙酯各4 mL洗脫,抽干,收集洗脫液,40 ℃氮?dú)獯蹈?,?0%乙腈甲酸水溶液1.00 mL溶解殘余物,超聲1 min,渦旋混勻(蜂王漿樣品溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min),上清液過微孔尼龍濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。15種喹諾酮類藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見表1。
表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)下模式下15種藥物的質(zhì)譜參數(shù)表
本文樣品前處理過程及色譜條件的優(yōu)化中,都使用了少量甲酸水溶液,加大了提取效率,利于形成色譜峰形,分離效果良好,且為目標(biāo)化合物提供質(zhì)子來源,提高了離子化效率。正離子模式下,目標(biāo)物經(jīng)過二級(jí)碰撞掃描,產(chǎn)生不同的碎片離子峰,以豐度最大的荷質(zhì)比(m/z)為各目標(biāo)化合物的定量離子,15種喹諾酮類物質(zhì)在100 μg·kg-1的定量離子色譜圖如圖1所示。
圖1 陰性樣品添加水平為100 μg·kg-1的色譜圖
分別向空白蜂蜜及蜂王漿基質(zhì)中加入測(cè)定濃度為 5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和 200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各 1.00 mL,上清液過微孔尼龍濾膜后,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。以各藥物特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)曲的建立,標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明,各個(gè)組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5~200 ng·mL-1,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》(GB/T 27404—2008)附錄F的要求;同時(shí)根據(jù)《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》(GB/T 27417—2017)的要求,用信噪比法評(píng)估檢出限,以產(chǎn)生3倍信噪比信號(hào)的檢測(cè)濃度為最小檢出濃度,計(jì)算該檢測(cè)項(xiàng)目的方法檢出限。本方法參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021 中檢測(cè)限為 0.5 μg·kg-1,配制濃度為1 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定,確定儀器的檢出限和定量下限。
表2 15種喹諾酮類物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表
分別準(zhǔn)確稱取蜂蜜及蜂王漿樣品2 g(準(zhǔn)確至0.02 g),濃度加標(biāo)量均為1 μg·kg-1,按照1.2.3進(jìn)行樣品前處理,按照1.2.1,1.2.2的色譜條件進(jìn)行上機(jī)分析,每個(gè)相同的濃度加標(biāo)量分別測(cè)試6次,測(cè)試結(jié)果見表3,蜂蜜基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在88.33%~111.67%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%,蜂王漿基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在82.50%~116.67%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%,參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021要求,添加水平1~5 μg·kg-1濃度下的回收率為60%~120%,批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%,表明本方法測(cè)試結(jié)果回收率高,準(zhǔn)確度好,且測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性好,精密度高。
表3 蜂蜜基質(zhì)和蜂王漿基質(zhì)中15種喹諾酮類物質(zhì)的加標(biāo)回收率、濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表
續(xù)表3
采用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)上的20款不同品牌的蜂蜜樣品進(jìn)行分析,每款蜂蜜樣品各測(cè)試2次,測(cè)得其中2款蜂蜜樣品的譜圖見圖2。試驗(yàn)結(jié)果顯示,所抽的蜂蜜測(cè)試樣品中,1款蜂蜜樣品中檢出恩諾沙星,濃度為1.2 μg·kg-1;1款蜂蜜樣品中檢出環(huán)丙沙星,濃度為10.4 μg·kg-1;其他的組分在本次所抽檢的蜂產(chǎn)品中均未檢出。
圖2 蜂蜜樣品的質(zhì)譜峰監(jiān)測(cè)圖
本試驗(yàn)采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了蜂產(chǎn)品中15種喹諾酮類化合物的檢測(cè)分析方法。結(jié)果表明,各個(gè)組分的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在5~200 ng·mL-1,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于 0.99,本方法測(cè)定檢出限為 0.5 μg·kg-1,定量限為1.0 μg·kg-1;蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)的平均回收率在82%~120%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<20%。本方法回收率高,重現(xiàn)性好,靈敏度高,可用于蜂產(chǎn)品中喹諾酮類物質(zhì)的日常檢測(cè)。