液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂產(chǎn)品中的喹諾酮類物質(zhì)

◎ 劉 梅，羅詩(shī)泳，李韻儀

（佛山市沃特測(cè)試技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 佛山 528000）

蜂蜜是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的天然食品，其中60%～80%是人體容易吸收的葡萄糖和果糖，具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等生物活性，是一種食療佳品和天然藥品[1-2]。蜂蜜不僅能夠改善人體的血液循環(huán)、補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)、緩解和恢復(fù)人體疲勞，還能起到潤(rùn)肺止咳、消積通便等作用[3-4]。目前我國(guó)主要是傳統(tǒng)養(yǎng)蜂方式，在養(yǎng)殖過(guò)程中，蜂群極易感染美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、麻痹病等疾病，蜂農(nóng)為了控制病害而出現(xiàn)濫用抗生素和農(nóng)藥的情況[5]。消費(fèi)者食用蜂蜜后，很可能攝入蜂蜜中殘留的抗生素，影響健康。中國(guó)是世界蜂蜜生產(chǎn)、消費(fèi)和出口大國(guó)，卻不是蜂蜜出口強(qiáng)國(guó)，主要原因在于蜂蜜質(zhì)量安全問(wèn)題較為突出，蜂蜜質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后，屢屢遭遇國(guó)際貿(mào)易壁壘[6]。

因此，建立一種能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定蜂蜜中多種藥物殘留的方法勢(shì)在必行。目前，蜂產(chǎn)品的獸藥殘留研究主要集中在蜂蜜、蜂王漿，檢測(cè)的方法主要有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，其靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，可大大提高檢測(cè)效率[7-8]。本文建立了HLB固相萃取柱前處理，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer，HPLC-MS/MS）測(cè)定蜂產(chǎn)品中的喹諾酮類物質(zhì)的方法，方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，且適用于蜂蜜產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的大批量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Xevo TQS），配有電噴霧離子源；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；固相萃取裝置（上海亞榮）。

氟甲喹（Flumequine，F(xiàn)LU）、噁喹酸（Oxolinic acid，OXO）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、伊諾沙星（Enoxacin，ENO）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、洛美沙星（Lomefloxacin，LOM）、沙拉沙星（Sarafloxacin，SAR）、恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、氟羅沙星（Fleroxacin，F(xiàn)LE）、司帕沙星（Sparfloxacin，SPA）、奧比沙星（Orbifloxacin，ORB）、雙氟沙星（Difloxacin，DIF）及達(dá)氟沙星（Danofloxacin，DAN）的混合液體標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為1 000 mg·L-1，購(gòu)自壇墨質(zhì)檢公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純），均購(gòu)自上海安譜公司。

15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1 mg·L-1）的配制：準(zhǔn)確移取15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 mg·L-1）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇準(zhǔn)確定容至刻度。

15種喹諾酮類基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用乙腈-甲酸水（0.1%）（2+8，體積比）溶液稀釋，分別配制成濃度為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1.00 mL，分別加于經(jīng)提取、凈化步驟處理的空白試料中，溶解殘余物（蜂王漿基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min），上清液過(guò)微孔尼龍濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

C18色 譜 柱（150 mm×2.0 mm，3 μm）； 流 動(dòng)相：乙腈（A相）+0.1%甲酸水溶液（B相）；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃；液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，A相保持5%；1～7 min，A相5%→90%；7～9 min，A相保持90%；9～12 min，A相90%→5%；12～13 min，A相保持5%。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源）；正離子模式（ESI+）檢測(cè)；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；離子源溫度：149 ℃；霧化溫度：595 ℃；毛細(xì)管電壓：0.56 kV。

1.2.3 樣品前處理

本方法分別采用了蜂蜜樣品和蜂王漿不同的測(cè)試基體進(jìn)行了方法的運(yùn)用。

蜂蜜：取試料2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），于50 mL聚丙烯離心管中，加磷酸鹽緩沖液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，1 000 r·min-1離心5 min，取上清液，備用。

蜂王漿：取試料2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），于50 mL聚丙烯離心管中，加磷酸鹽緩沖液10 mL，渦旋1 min，振蕩 10 min，4 ℃下 10 000 r·min-1離心 10 min，移取上清液至另一離心管。殘?jiān)恿姿猁}緩沖液10 mL重復(fù)提取，合并2次上清液，玻璃纖維濾紙過(guò)濾，備用。

HLB固相萃取柱分別用甲醇10 mL、水10 mL活化，備用液過(guò)柱，用水5 mL淋洗，抽干，依次用5%甲酸甲醇和乙酸乙酯各4 mL洗脫，抽干，收集洗脫液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?0%乙腈甲酸水溶液1.00 mL溶解殘余物，超聲1 min，渦旋混勻（蜂王漿樣品溶液需在4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min），上清液過(guò)微孔尼龍濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。15種喹諾酮類藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)下模式下15種藥物的質(zhì)譜參數(shù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 定量離子色譜情況

本文樣品前處理過(guò)程及色譜條件的優(yōu)化中，都使用了少量甲酸水溶液，加大了提取效率，利于形成色譜峰形，分離效果良好，且為目標(biāo)化合物提供質(zhì)子來(lái)源，提高了離子化效率。正離子模式下，目標(biāo)物經(jīng)過(guò)二級(jí)碰撞掃描，產(chǎn)生不同的碎片離子峰，以豐度最大的荷質(zhì)比（m/z）為各目標(biāo)化合物的定量離子，15種喹諾酮類物質(zhì)在100 μg·kg-1的定量離子色譜圖如圖1所示。

圖1 陰性樣品添加水平為100 μg·kg-1的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限及定量限的測(cè)定

分別向空白蜂蜜及蜂王漿基質(zhì)中加入測(cè)定濃度為 5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和 200 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各 1.00 mL，上清液過(guò)微孔尼龍濾膜后，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。以各藥物特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)曲的建立，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，各個(gè)組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～200 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）附錄F的要求；同時(shí)根據(jù)《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）的要求，用信噪比法評(píng)估檢出限，以產(chǎn)生3倍信噪比信號(hào)的檢測(cè)濃度為最小檢出濃度，計(jì)算該檢測(cè)項(xiàng)目的方法檢出限。本方法參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021 中檢測(cè)限為 0.5 μg·kg-1，配制濃度為1 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定，確定儀器的檢出限和定量下限。

表2 15種喹諾酮類物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表

2.3 方法的回收率及精密度

分別準(zhǔn)確稱取蜂蜜及蜂王漿樣品2 g（準(zhǔn)確至0.02 g），濃度加標(biāo)量均為1 μg·kg-1，按照1.2.3進(jìn)行樣品前處理，按照1.2.1，1.2.2的色譜條件進(jìn)行上機(jī)分析，每個(gè)相同的濃度加標(biāo)量分別測(cè)試6次，測(cè)試結(jié)果見表3，蜂蜜基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在88.33%～111.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%，蜂王漿基質(zhì)的加標(biāo)組分的平均回收率在82.50%～116.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%，參照標(biāo)準(zhǔn)GB 31657.2—2021要求，添加水平1～5 μg·kg-1濃度下的回收率為60%～120%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，表明本方法測(cè)試結(jié)果回收率高，準(zhǔn)確度好，且測(cè)試結(jié)果的重現(xiàn)性好，精密度高。

表3 蜂蜜基質(zhì)和蜂王漿基質(zhì)中15種喹諾酮類物質(zhì)的加標(biāo)回收率、濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表

續(xù)表3

2.4 樣品測(cè)試情況

采用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)上的20款不同品牌的蜂蜜樣品進(jìn)行分析，每款蜂蜜樣品各測(cè)試2次，測(cè)得其中2款蜂蜜樣品的譜圖見圖2。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所抽的蜂蜜測(cè)試樣品中，1款蜂蜜樣品中檢出恩諾沙星，濃度為1.2 μg·kg-1；1款蜂蜜樣品中檢出環(huán)丙沙星，濃度為10.4 μg·kg-1；其他的組分在本次所抽檢的蜂產(chǎn)品中均未檢出。

圖2 蜂蜜樣品的質(zhì)譜峰監(jiān)測(cè)圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了蜂產(chǎn)品中15種喹諾酮類化合物的檢測(cè)分析方法。結(jié)果表明，各個(gè)組分的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線在5～200 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于 0.99，本方法測(cè)定檢出限為 0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1；蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)的平均回收率在82%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜20%。本方法回收率高，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可用于蜂產(chǎn)品中喹諾酮類物質(zhì)的日常檢測(cè)。